Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Resumo

A manutenção da cobertura da barreira hematoencefálica é fundamental para a homeostase do sistema nervoso central. Este protocolo descreve técnicas in vitro para delinear os processos fundamentais e patológicos que modulam a cobertura da barreira hematoencefálica.

Resumo

A cobertura da barreira hematoencefálica (BBB) ​​desempenha um papel central na homeostase do sistema nervoso central (SNC). O BBB é mantido dinamicamente por astrocitos, pericitos e células endoteliais cerebrais (BECs). Aqui, detalhamos métodos para avaliar a cobertura BBB usando culturas únicas de BEC humanas imortalizadas, culturas únicas de BEC de ratos primários e um modelo de cultura triplicada humanizado (BECs, astrocitos e pericitos) do BBB. Para destacar a aplicabilidade dos ensaios em estados de doença, descrevemos o efeito da amilóide-β (oAβ) oligomérica, que é um contribuinte importante para a progressão da doença de Alzheimer (AD), na cobertura de BBB. Além disso, utilizamos o fator de crescimento epidérmico (EGF) para iluminar o potencial de rastreamento de drogas das técnicas. Nossos resultados mostram que os BEC cultivados de um único e triplo formam estruturas semelhantes a malhas em condições basais, e que oAβ interrompe essa formação de malha celular e degenera as estruturas de malha pré-formadas,Mas EGF bloqueia essa interrupção. Assim, as técnicas descritas são importantes para a dissecação de processos fundamentais e relevantes para a doença que modulam a cobertura BBB.

Introdução

A barreira hematoencefálica (BBB) ​​dos capilares cerebrais é a maior interface de contato de sangue para cérebro e desempenha um papel central na homeostase do sistema nervoso central (SNC) ^{1 , 2} . Os processos dinâmicos no BBB impedem a absorção de moléculas indesejadas do sangue, eliminam os resíduos do SNC, fornecem nutrientes essenciais e moléculas de sinalização ao SNC e modulam a neuroinflamação ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . O dano BBB é prevalente durante o envelhecimento e vários distúrbios neurodegenerativos, incluindo doença de Alzheimer (AD), esclerose múltipla e AVC ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,}Ass = "xref"> 6. Portanto, a disfunção BBB pode desempenhar um papel fundamental em distúrbios neurodegenerativos, inclusive como alvo terapêutico.

Manter a cobertura do navio é importante para as funções homeostáticas da BBB. No entanto, os dados in vivo e in vitro conflitam se os processos envolvidos em distúrbios neurodegenerativos causam maior ou menor cobertura BBB ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} , particularmente em AD. Portanto, há uma forte justificativa para o desenvolvimento de modelos in vitro usando tipos de células relevantes para avaliar e compreender de forma mais abrangente a dinâmica da cobertura BBB. Os capilares cerebrais são compostos de astrocitos, pericitos e células endoteliais do cérebro (BECs) ^{3. Todos os tipos de células contribuem para a função do BBB através do suporte estrutural e através da secreção de moléculas efectoras, como fatores de crescimento angiogênicos, citocinas e quimiocinas que atuam de forma paracrina e autocrina. No entanto, as principais células efetoras da BBB são BECs 3 . Em geral, as técnicas de cultura celular para avaliar a função BBB são os ensaios de permeabilidade realizados em células cultivadas em inserções de filtro, ou avaliar níveis de proteínas BEC chave, ambos após a adição de estressores 14 , 15 , 16 . Embora importantes, esses ensaios não se concentram na cobertura cerebrovascular.}

Aqui, nossos métodos anteriores ¹⁷ são detalhados para avaliar a cobertura de BEC e as estruturas semelhantes a redes, usando culturas únicas de BEC humanas imortalizadas, culturas únicas de BEC primários de mouse e uma cultura tripla humanizadaModelo (BECs, astrocitos e pericitos) do BBB. O objetivo foi demonstrar o efeito prejudicial da OAβ, que é considerado um contribuinte importante para a progressão do AD, na cobertura da BEC. O efeito protetor do fator de crescimento epidérmico (EGF) destaca o potencial da técnica como ferramenta de triagem terapêutica. A técnica tem várias aplicações amplas para pesquisa básica e aplicada, incluindo: 1) delineando o papel de caminhos específicos sobre angiogênese e cobertura de vasos, 2) avaliação dos efeitos da doença e fatores relevantes ao envelhecimento na angiogênese e cobertura vascular e 3) identificação de farmacologia Alvos.

Protocolo

Todas as experiências seguem os protocolos do Comitê de Consentimento Institucional de Animais e Instituições da Universidade de Illinois, Chicago.

1. Preparação geral

NOTA: A linha de células endoteliais microvasculares do cérebro (hCMEC / D3) é uma linha BEC humana imortalizada amplamente caracterizada ^{14 , 15 , 16 , 18 , 19} . Cultive as células hCMEC / D3 em frascos de cultura de tecidos revestidos com colágeno tipo I (pele de bezerro, diluição 1:20 de solução a 0,1% na solução de sal equilibrada de Hank (HBSS) contendo Ca ²⁺ e Mg ²⁺ ) no meio basal de crescimento endotélial basal (EBM-2) contendo 2-5% de soro bovino fetal (FBS), 10% de ácido ascórbico, 10% de sulfato de gentamicina, 25% de hidrocortisona e 1/4 do volume total dos suplementos de fator de crescimento fornecidos por 500 mL de meio [ Endotélio vascular grO Factor Owth (VEGF), o fator de crescimento epidérmico (EGF), o fator de crescimento insulino-like 1 (IGF-1) eo fator de crescimento fibroblástico básico humano (bFGF), ver Tabela de Materiais ].
NOTA: O meio EBM-2 com FBS e fatores de crescimento é referido como "EBM-2 completo". EBM-2 sem FBS e suplementos é referido como "EBM-2 basal". Na confluência total, as células hCMEC / D3 são ~ 1 x 10 ⁵ células / cm ² .

1. Passar as células hCMEC / D3 a uma proporção de 1: 5 pela primeira incubação com HBSS durante 3 min sem Ca ²⁺ e Mg ²⁺ seguido de desprendimento com 5 mL de tripsina / EDTA (0,25%) durante 5 min. Neutralize a tripsina utilizando EBM-2 completo (neutralização 1: 1) e centrifugue a 290 xg durante 5 minutos a 4 ° C; Descarte o sobrenadante. Ressuspender a pastilha em EBM-2 completa e re-chapa em proporção 1: 5.
2. Cultive os pericitos e astrócitos humanos primários de acordo com o protocolo do fornecedor [ Tabela de Materiais ]. CulturE os pericitos no meio basal pericyte com FBS e suplemento de crescimento pericítico.
3. Cultive os astrocitos humanos em meio de astrocito contendo fatores de crescimento de astrocitos. Cultive tanto os pericitos quanto os astrocitos em frascos de cultura de tecidos revestidos com 3 mL de poli-L-lisina (PLL) para a aderência celular e utilizem as células entre as passagens 2 e 5.
4. Eutanizar 7 camundongos e remover as hastes do cérebro e cerebella com fórceps; Desanexar as meninges com cuidado rolando o cérebro com gaze. Agite o tecido cerebral restante em uma placa de Petri em meio mínimo essencial (MEM) com HEPES (5 mL por cérebro) com uma lâmina de barbear estéril. Isolar os BEC de ratos primários de ratos C57BL / 6J de 2 meses de acordo com o protocolo ²⁰ referenciado.
5. Transfira o tecido cerebral triturado para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e incube o tecido em uma papaína (833,33 μL por cérebro) e DNase (41,7 μL por cérebro)Solução, em banho-maria a 37 ° C durante 1 h, para digerir o tecido.
6. Triturar o homogeneizado sequencialmente através de agulhas de calibre 19 e 21, misturar a uma proporção de 1: 1 com uma solução de albumina de soro bovino (BSA) a 22% e centrifugar a 1360 xg durante 10 min a 4 ° C.
7. Ressuspender o sedimento resultante em 1 mL de EBM-2 completo e centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender novamente em 1 mL de EBM-2 completo e prender as células (1 mL / poço) em placas de 6 poços revestidas com colágeno (~ 1 cérebro por poço).
8. Substitua a mídia 24 h mais tarde por EBM-2 completo contendo 4 μg / mL de cloridrato de puromicina; Substitua com o EBM-2 completo após 2 dias. Os BEC primários são cultivados quanto às células hCMEC / D3 e estão em confluência total em 1 x 10 ⁵ células / cm ² .
9. Prepare um 100 μM de oAβ, 24 h antes do ensaio.
   NOTA: OAβ é considerado a forma relevante para a doença de A. Para oAβ, use as preparações bem caracterizadas descritas por DahlgreN et al. ²¹ .
10. Destilar a solução de reserva da membrana no solo durante a noite a 4 ° C e uma alíquota em tiras de tubo de PCR estéril (8 tubos) a 140 μL de membrana basal por tubo. Refonte cada tira e armazene a -20 ° C. Descongelar uma tira por placa de 96 poços a 4 ° C, 24 h antes do ensaio. Pré-esfrie as pontas da pipeta para evitar a solidificação.
    NOTA: Todo o tratamento da matriz da membrana basal deve ser realizado em gelo para evitar solidificação rápida. Como 10 μL por poço de membrana basal é usado no dia do ensaio, cada tira é suficiente para uma placa de 96 poços.
11. Incubar BEC totalmente confluentes em EBM-2 basal, 24 h antes do ensaio.
    NOTA: O raciocínio é: o EBM-2 completo contém fatores suplementados e FBS com o objetivo de promover o crescimento celular ótimo; No entanto, as mesmas vias moleculares que promovem o crescimento celular também são importantes para a cobertura e dinâmica das células endoteliais cerebrais, tanto na presença quanto no abseUm estressor. Portanto, soro e suplemento morrem de fome dos BECs para reduzir o efeito de confusão da ativação residual das vias de sinalização celular. De notar, as células são brevemente (5 min) expostas a FBS durante a neutralização de células tripsinizadas antes do ensaio. Em contraste com os BECs, os pericitos e astrócitos não são soro feridos, devido à exigência de diferentes fatores para o crescimento e a relativa instabilidade desses tipos de células em resposta à inanição de soro (laboratório de Tai, observações não publicadas).
    NOTA: O EBM-2 basal é utilizado durante o ensaio para os ensaios de formação e de interrupção da malha de cultura única e tripla. Isto é crítico para evitar a degradação do estressor ou sinalização dependente do tratamento.

2. Ensaios de Formação e Perturbação semelhantes a Meshwork

1. Ensaios simples de cultura BEC:
   NOTA: Três paradigmas diferentes para culturas individuais de BECs são mostrados na Figura 1A . Cada paradigma é projetado para avaliar a resposta dos BEC em diferentes modelos de cobertura de embarcações. O paradigma 1 é a formação de malha. Este paradigma é projetado para examinar os efeitos de estressores e / ou tratamentos na angiogênese e formação de malha. BECs, oAβ e tratamentos são todos adicionados à placa no ponto horário de 0 h. Paradigma 2 é a prevenção da interrupção da malha. As células são plaqueadas na presença de um fator de crescimento ou fármaco e incubadas durante 4 h para formar estruturas tipo malha. Um estressor, oAβ neste caso, é adicionado após 4 h. Este paradigma avalia a capacidade de um tratamento para evitar danos induzidos pelo estressor a estruturas pré-formadas semelhantes a redes. Paradigma 3 é o tratamento simultâneo da interrupção da malha. As células são banhadas e permitidas formar estruturas tipo malha durante 4 h. Os tratamentos e oAβ são então adicionados simultaneamente no ponto de tempo de 4 h, avaliando a capacidade da rede celular pré-formada para responder a vários tratamentos. Todos os paradigmas paraEssas etapas comuns, exceto com diferenças no momento da adição do tratamento.
   1. No dia do ensaio, pipetar a matriz da membrana do porão a 10 μL / poço no fundo das placas de 96 poços e permitir que seja ajustado durante 1 h a 37 ° C.
   2. Suspender o corante de rastreamento de células verdes liofilizado (ver Tabela de Materiais ) em 10 μL de DMSO para gerar uma solução de reserva de 10 mM e diluir para 10 μM (1: 1000) em EBM-2 basal. Remova a mídia do frasco totalmente confluente e substitua-a com base EBM-2 contendo o corante de rastreamento de células verdes (5 mL para um balão de 75 cm2). Preload BECs com o corante de rastreamento de células verdes, 20 min antes do início do ensaio.
   3. Incube as células por 20-30 min a 37 ° C, remova o meio com corante de rastreamento celular e separe as células como descrito no Passo 1.1. Neutralize a mídia com EBM-2 contendo 10% de FBS e centrifugue a 240 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 1 mL de EBM-2 basal.
   4. Placa os BECs na placa de 96 poços em 10.000 células / poço em EBM-2 basal (0 h ponto de tempo em todos os paradigmas).
      NOTA: Dependendo do paradigma que está sendo utilizado, tratamentos, estressores ou controles do veículo são adicionados nos pontos de tempo especificados. Em todos os paradigmas, o meio é colhido para análise subsequente ( por exemplo, análise ELISA) e as células são fixadas às 24 h com paraformaldeído 4% recentemente preparado em Soro Tamponado de Fosfato (PBS). Como uma abordagem alternativa para determinar o termo efeitos de oAβ na formação de malha, o protocolo pode ser modificado para pré-incubar frascos de cultura de células confluentes com oAβ e, em seguida, realizar os paradigmas de formação de malha (+/- oAβ).
      NOTA: O volume final em cada poço para todos os paradigmas é de 70 μL. Todos os tratamentos (oAβ, EGF, etc. ) são adicionados aos respectivos poços com uma diluição de 1:20 ou seja, 3,5 μL por tratamento. Para o Paradigma 1, as células são adicionadas numa solução de suspensão celular a 63 μL / pEll. Imediatamente oAβ, tratamentos desejados e controles são adicionados a 3,5 μL / poço cada, dando um total de 70 μL. Para Paradigm 2, são adicionados 63 μL de suspensão celular e 3,5 μL de tratamento ( por exemplo, 100 ng / mL de EGF) no ponto de tempo de 0 h. Após 4 h de incubação, adicionam-se 3,5 μL de uma reserva de oAβ ( por exemplo, para uma concentração final de 100 μM de OAβ, 3,5 μL de 2 μM de reserva de OAβ). Para Paradigm 3, são adicionados 63 μL de suspensão celular no ponto de tempo de 0 h e às 4 h, oAβ e os tratamentos desejados são adicionados a 3,5 μL / poço cada, dando um total de 70 μL. Estes volumes podem ser ajustados de acordo com os tratamentos. Por exemplo, se apenas um tratamento for necessário, o volume da suspensão celular pode ser ajustado para 66,5 μL (mantendo 10 000 células / poço) e o volume do tratamento pode permanecer em 3,5 μL.
2. Ensaio de cultura tripla:
   NOTA: Além dos ensaios de cultura única de BECs, desenvolvemosUm paradigma de ensaio de cultura tripla ( Figura 1B ) para determinar a resposta de BECs, pericítas e astrocitos em redes pré-formadas a estressores relevantes ( por exemplo, oAβ). Os BECs são chapeados na presença de tratamentos desejados às 0 h. Às 4 h, os pericitos são suavemente adicionados à placa. Às 7 h, os astrocitos são adicionados à placa, seguido da adição de um estressor às 11 h. As células são então incubadas até o ponto de tempo de 24 horas.
   NOTA: Para os ensaios de cultura tripla, é importante considerar o tempo para garantir que todas as células sejam confluentes ao mesmo tempo. Astrocitos e pericitos humanos devem ser cultivados 1 semana antes do ensaio, enquanto que as células hCMEC / D3 precisam ser banhadas ou passadas 4-5 dias antes da data do ensaio. Além disso, é importante usar células primárias de passagem baixa (2-5) para evitar deriva fenotípica.
   1. Adicione a solução de trabalho de corante de rastreamento de célula verde às células hCMEC / D3 20 min antes do início do ensaio. Placa as células hCMEC / D3 às 10, 000 células / poço em EBM-2 basal (ponto horário de 0 h). Os volumes utilizados são 45 μL de suspensão celular e 3,5 μL de tratamento ( ou seja, concentrações finais de EGF de 50 ng / mL, 100 ng / mL ou 1000 ng / mL de estoques 20 vezes mais concentrados).
   2. Após a incubação de 3,5 h a 37 ° C, adicione a solução de trabalho de corante de rastreamento de células azuis (rastreador de células de 10 μM azul em EBM-2 basal) aos pericitos primários humanos. No ponto de tempo de 4 h (~ 30 min de incubação com corante de rastreamento celular), adicione suavemente 2,000 pericitos / poço à placa que contém o hCMEC / D3 num volume de 6 μL / poço.
   3. Após uma incubação adicional de 2,5 h (total 6,5 h a partir do ponto de tempo de 0 h), adicione a solução de trabalho de corante de rastreamento de células de laranja (laranja de rastreador de células 10 μM em EBM-2 basal) aos astrócitos primários humanos. No ponto de tempo de 7 horas, adicione suavemente 10.000 astrocitos / bem à placa em 12 μL de volume. Portanto, a relação celular global para células endoteliais: pericítes: astrócitos iS 5: 1: 5. Além disso, o volume alcançado até este ponto é de 66,5 μL.
   4. Adicione oAβ (3,5 μL de estoque de 100 μM) 4 h depois (total 11 h a partir do ponto de tempo de 0 h).
   5. Corrija as células 13 h depois em paraformaldeído a 4% recentemente preparado em PBS.
      Cuidado: use roupas protetoras, luvas e óculos enquanto manipula paraformaldeído.

3. Quantificação

1. Capture imagens de fluorescência do poço inteiro da placa de 96 poços com uma ampliação de 1,6X com um tempo de exposição de 2 s com 50% de potência máxima usando um microscópio de dissecação.
   NOTA: Os microscópios equivalentes podem ser utilizados; No entanto, é fundamental capturar todo o poço para análise abrangente.
2. Para análise quantitativa, processe as imagens usando o plugin ^{22 do} analisador de angiogênese ImageJ para quantificar o número de ramos, o número de malhas e o comprimento total da célula (essas leituras são tabuladas automaticamente pelo softwaRe) conforme descrito abaixo. Um protocolo visual detalhado desta etapa é fornecido na Figura 2 .
   1. Abra o fiji ImageJ clicando no ícone do software.
   2. Clique nas duas setas diretas do lado direito localizadas no final da barra de ferramentas, depois clique em "Angiogenesis Analyzer".
   3. Selecione a pasta com arquivos de imagem, clique em "Abrir".
   4. Quando a caixa "Configurações para análise" aparecer, clique em "OK".
   5. Quando a caixa "imagens de processamento" for exibida, o que indica o número de imagens a serem processadas, clique em "OK".
   6. Quando aparece a caixa "janela de progresso do lote", que indica o tempo de processamento estimado. Durante este tempo, o programa quantifica as saídas, incluindo o número de ramos, o número de malhas e o comprimento total da célula.
      NOTA: Uma vez que todas as imagens são quantificadas, o arquivo de resultados aparecerá na pasta de imagem original como um documento de planilha eletrônica.
   7. SelecioneO arquivo da planilha contendo resultados e compare o número de ramos, malhas e o comprimento total da célula entre os grupos.
      NOTA: No ensaio de cultura tripla, o ImageJ é utilizado para analisar a cobertura e número de pericitos / astrocitos. As imagens são controladas por um experimentador cego e a função "analisar partículas" utilizada para gerar leituras. As células fixas e as estruturas semelhantes a tubos também podem ser imunossintérias para Aβ ¹⁷ ou outros marcadores.

Resultados

Em culturas individuais, tanto as células hCMEC / D3 ( Figura 3A ) como os BEC primários do mouse ( Figura 3B ) formam estruturas semelhantes a redes em todo o poço. As estruturas são caracterizadas por uma malha de nós interligados ( Figura 3 ). Em todos os paradigmas descritos ( Figura 1 ), as estruturas semelhantes às malhas são semelhantes após 24 h nos grup...

Discussão

Os métodos descritos podem ser utilizados para abordar várias questões biológicas fundamentais em torno da cobertura cerebrovascular ²⁴ . Especificamente, eles podem identificar quais receptores e vias de sinalização desempenham um papel na angiogênese, na cobertura vascular no tecido cancerígeno e nas células endoteliais periféricas relevantes para o cérebro. Exemplos incluem receptores de fator de crescimento angiogênico, óxido nítrico, sinalização de proteína quinase ativada p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
hCMEC/D3 cells	Milipore	SCC066
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156
Collagen Type 1	ThermoFisher	A1064401
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14025092
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14175095
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media	Lonza	CC-4147
5% FBS	Lonza	CC-4147
10% Ascorbic acid	Lonza	CC-4147
10% Gentamycin sulphate	Lonza	CC-4147
25% Hydrocortisone	Lonza	CC-4147
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor	Lonza	CC-4147
Puromycin hydrochloride	VWR	80503-312
MEM-HEPES	Thermo Scientific	12360-038
Papain cell dissociation system (papain and DNase1)	Worthington Biochemical	LK003150
Human pericytes	Sciencell	1200
Pericyte basal media	Sciencell	1201
Pericyte growth supplement	Sciencell	1252
Human Astrocytes	Sciencell	1800
Astrocyte media	Sciencell	1801
Astrocyte growth supplement	Sciencell	1852
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)	Corning	356231
Angiogenesis m-plates (96-well)	ibidi	89646
Human Epidermal growth factor	Shenendoah Biotechnology	100-26
CellTracker green	ThermoFisher	C7025
CellTracker orange	ThermoFisher	C34551
CellTracker blue	ThermoFisher	C2110
Poly-l-lysine	Sciencell	0403
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT5012-60ML
C57BL mice	Jackson Laboratory	na
PCR tube strips	GeneMate	T-3014-2
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope	Zeiss	na