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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le maintien de la couverture de la barrière hémato-encéphalique est la clé de l'homéostasie du système nerveux central. Ce protocole décrit des techniques in vitro pour délimiter les processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture de la barrière hémato-encéphalique.

Résumé

La couverture de la barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​joue un rôle central dans l'homéostasie du système nerveux central (SNC). Le BBB est maintenu dynamiquement par les astrocytes, les pericytes et les cellules endothéliales du cerveau (BEC). Ici, nous détaillons les méthodes pour évaluer la couverture BBB en utilisant des cultures individuelles de BEC humains immortalisés, des cultures simples de BEC de souris primaires et un modèle de culture triple humanisé (BEC, astrocytes et pericytes) du BBB. Pour mettre en évidence l'applicabilité des tests aux états pathologiques, nous décrivons l'effet de l'amyloide-β (oAβ) oligomère, qui est un facteur important de la progression de la maladie d'Alzheimer (AD), sur la couverture BBB. De plus, nous utilisons le facteur de croissance épidermique (EGF) pour éclairer le potentiel de dépistage des techniques des médicaments. Nos résultats montrent que les BEC cultivés à une ou à trois fois forment des structures en forme de maille dans des conditions basales et que oAβ perturbe cette formation de maillage cellulaire et dégénère les structures de maille préformées,Mais EGF bloque cette perturbation. Ainsi, les techniques décrites sont importantes pour la dissection de processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture BBB.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​des capillaires cérébraux est la plus grande interface de contact entre le sang et le cerveau et joue un rôle central dans l'homéostasie du système nerveux central (SNC) 1 , 2 . Les processus dynamiques à la BBB empêchent l'absorption de molécules indésirables du sang, éliminent les déchets du SNC, fournissent des nutriments essentiels et des molécules de signalisation au SNC, et modulent la neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Le dommage de BBB est répandu pendant le vieillissement et plusieurs troubles neurodégénératifs, y compris la maladie d'Alzheimer (AD), la sclérose en plaques et les accidents vasculaires cérébraux 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Par conséquent, la dysfonctionnement BBB peut jouer un rôle clé dans les troubles neurodégénératifs, y compris en tant que cible thérapeutique.

Le maintien de la couverture des navires est important pour les fonctions homéostatiques du BBB. Cependant, les conflits de données in vivo et in vitro sur le fait que les processus impliqués dans les troubles neurodégénératifs causent une couverture BBB plus élevée ou inférieure à 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , en particulier en AD. Par conséquent, il existe une forte raison pour le développement de modèles in vitro utilisant des types cellulaires pertinents pour évaluer et comprendre de manière plus complète la dynamique de la couverture BBB. Les capillaires cérébraux sont composés d'astrocytes, de pericytes et de cellules endothéliales du cerveau (BEC) 3. Tous les types de cellules contribuent à la fonction du BBB grâce au soutien structurel et à la sécrétion de molécules effectrices telles que les facteurs de croissance angiogéniques, les cytokines et les chimiokines qui agissent de manière paracrine et autocrine. Cependant, les principales cellules effectrices du BBB sont les BEC 3 . En général, les techniques de culture cellulaire pour évaluer la fonction BBB sont des essais de perméabilité effectués sur des cellules cultivées sur des inserts de filtre, ou l'évaluation des niveaux de protéines BEC clés, à la fois après l'addition de facteurs de stress 14 , 15 , 16 . Bien que important, ces tests ne se concentrent pas sur la couverture cérébrovasculaire.

Ici, nos méthodes précédentes 17 sont détaillées pour évaluer la couverture de BEC et les structures en forme de maillage en utilisant des cultures simples de BEC humains immortalisés, des cultures uniques de BEC de souris primaires et une triple culture humaniséeModèle (BEC, astrocytes et pericytes) du BBB. L'objectif était de démontrer l'effet néfaste de l'OAβ, qui est considéré comme un facteur important de la progression de l'AD, sur la couverture de la BEC. L'effet protecteur du facteur de croissance épidermique (EGF) souligne le potentiel de la technique en tant qu'outil de dépistage thérapeutique. La technique a plusieurs applications générales pour la recherche fondamentale et appliquée, notamment: 1) délimiter le rôle des voies spécifiques sur l'angiogenèse et la couverture des vaisseaux; 2) évaluer les effets de la maladie et les facteurs pertinents du vieillissement sur l'angiogenèse et la couverture vasculaire; 3) Cibles.

Protocole

Toutes les expériences suivent les protocoles du Comité institutionnel d'élevage et d'utilisation de l'Université de l'Illinois, Chicago Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Préparation générale

REMARQUE: La lignée de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (hCMEC / D3) est une ligne 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Culturez les cellules hCMEC / D3 sur des flacons de culture de tissus revêtus de collagène type I (peau de veau, dilution 1:20 de solution à 0,1% dans la solution de sel équilibré de Hank (HBSS) contenant Ca 2+ et Mg 2+ ) dans le milieu basal de base de croissance endothéliale (EBM-2) contenant 2 à 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 10% d'acide ascorbique, 10% de sulfate de gentamicine, 25% d'hydrocortisone et 1/4 du volume total des suppléments de facteur de croissance fournis pour 500 mL de milieu [ Endothélium vasculaire gr(Facteur VEGF), facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance 1 de l'insuline (IGF-1) et facteur de croissance fibroblastique basique humain (bFGF), voir Tableau des matériaux ].
NOTE: Le moyen EBM-2 avec FBS et les facteurs de croissance est appelé "EBM-2 complet". L'EBM-2 sans FBS et les suppléments sont appelés "EBM-2 basal". En pleine confluence, les cellules hCMEC / D3 sont ~ 1 x 10 5 cellules / cm 2 .

  1. Passer les cellules hCMEC / D3 à un rapport de 1: 5 en incubant d'abord avec HBSS pendant 3 min sans Ca 2+ et Mg 2+ suivi d'un détachement avec 5 mL de trypsine / EDTA (0,25%) pendant 5 min. Neutraliser la trypsine en utilisant l'EBM-2 complète (neutralisation 1: 1) et centrifuger à 290 xg pendant 5 min à 4 ° C; Jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans EBM-2 complète et re-plaque au ratio de 1: 5.
  2. Culturez les percytes et les astrocytes humains primaires selon le protocole du fournisseur [ Table of Materials ]. CulturE les pericytes en milieu basique pericyte avec FBS et complément de croissance par péricyte.
  3. Culturez les astrocytes humains dans un milieu d'astrocytes contenant des facteurs de croissance d'astrocytes. Culturez à la fois les pericytes et les astrocytes dans des flacons de culture tissulaire enduits de 3 ml de poly-L-lysine (PLL) pour l'adhérence cellulaire et utilisent les cellules entre les passages 2 et 5.
  4. Éuthaniser 7 souris et enlever les tiges du cerveau et les cérébelles avec des pinces; Détachez les meninges en enlevant soigneusement le cerveau sur la gaze. Pique le reste du tissu cérébral dans une boîte de Petri en milieu essentiel minimal (MEM) avec HEPES (5 mL par cerveau) avec une lame de rasoir stérile. Isoler les BEC de souris primaires de souris C57BL / 6J de 2 mois selon le protocole référencé 20 .
  5. Transférer le tissu cérébral haché à un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 290 xg pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et incuber le tissu dans une papaïne (833,33 μL par cerveau) et DNase (41,7 μL par cerveau)Solution, dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 1 h, pour digérer le tissu.
  6. Triturer l'homogénat séquentiel par des aiguilles de 19 et 21, mélanger à un rapport de 1: 1 avec une solution d'albumine de sérum bovin (BSA) à 22% et centrifuger à 1360 xg pendant 10 min à 4 ° C.
  7. Remettre en suspension la pastille résultante dans 1 ml d'EBM-2 complète et centrifuger à 290 xg pendant 5 min à 4 ° C. Remettre à nouveau à nouveau dans 1 mL d'EBM-2 complète et plaquer les cellules (1 mL / puits) sur des plaques de 6 puits revêtues de collagène (~ 1 cerveau par puits).
  8. Remplacer les médias 24 heures plus tard avec EBM-2 complet contenant 4 μg / mL de chlorhydrate de puromycine; Remplacer par EBM-2 complet après 2 jours. Les BEC primaires sont cultivés comme pour les cellules hCMEC / D3 et sont à pleine confluence à 1 x 10 5 cellules / cm 2 .
  9. Préparer 100 uM d'OAß, 24 heures avant l'essai.
    REMARQUE: oAβ est considéré comme la forme pertinente de la maladie de A. Pour oAβ, utilisez les préparations bien caractérisées décrites par DahlgreN et al. 21 .
  10. Décongeler la solution mère de membrane de sous-sol pendant une nuit à 4 ° C et une aliquote dans des bandes de tubes PCR stériles (8 tubes) à 140 μL de membrane par tube. Refroidir chaque bande et stocker à -20 ° C. Décongeler une bande par plaque de 96 puits à 4 ° C, 24 heures avant l'essai. Pré-refroidir les pointes de la pipette pour éviter la solidification.
    REMARQUE: Toute manipulation de la matrice de membrane basique doit être effectuée sur de la glace pour éviter une solidification rapide. Comme 10 μL par puits de membrane basale est utilisé le jour de l'essai, chaque bande est suffisante pour une plaque à 96 puits.
  11. Incuber les BEC entièrement confluents dans le basal EBM-2, 24 heures avant l'essai.
    NOTE: La raison d'être est: EBM-2 complete contient des facteurs additionnels et FBS dans le but de promouvoir une croissance cellulaire optimale; Cependant, les mêmes voies moléculaires qui favorisent la croissance cellulaire sont également importantes pour la couverture et la dynamique des cellules endothéliales du cerveau, tant en présence qu'en abseUn facteur de stress. Nous supposons donc que le sérum et le complément affaiblissent les BEC pour réduire l'effet de confusion de l'activation résiduelle des voies de signalisation cellulaire. Il est à noter que les cellules sont brièvement (5 min) exposées à FBS lors de la neutralisation de cellules trypsinées avant l'analyse. Contrairement aux BEC, les pericytes et les astrocytes ne souffrent pas de sérum en raison de l'exigence de différents facteurs de croissance et de l'instabilité relative de ces types de cellules en réponse à la famine sérique (laboratoire Tai, observations non publiées).
    NOTE: L'EBM-2 basal est utilisé pendant le dosage pour les essais de formation et de rupture du maillage de culture simple et triple. Ceci est essentiel pour empêcher le stress ou la signalisation dépendant du traitement.

2. Ensembles de formation et de perturbation semblables à Meshwork

  1. Études simples de culture BEC:
    NOTE: Trois paradigmes différents pour les cultures individuelles de BEC sont présentés à la Figure 1A . Chaque paradigme est conçu pour évaluer la réponse des BEC dans différents modèles de couverture des navires. Le paradigme 1 est la formation de maillage. Ce paradigme est conçu pour examiner les effets des facteurs de stress et / ou des traitements sur l'angiogenèse et la formation du maillage. Les BEC, oAβ et les traitements sont tous ajoutés à la plaque au point de temps 0 h. Paradigm 2 est la prévention de la perturbation du maillage. Les cellules sont plaquées en présence d'un facteur de croissance ou d'un médicament et incubées pendant 4 h pour former des structures semblables à des mailles. Un facteur de stress, oAβ dans ce cas, est ajouté après 4 h. Ce paradigme évalue la capacité d'un traitement pour prévenir les dommages induits par le stress aux structures préformées semblables au maillage. Paradigm 3 est un traitement simultané de la perturbation du maillage. Les cellules sont plaquées et autorisées à former des structures en forme de maille pendant 4 h. Les traitements et oAβ sont ensuite ajoutés simultanément au point de temps de 4 heures, en évaluant la capacité du réseau cellulaire préformé à répondre à divers traitements. Tous les paradigmes pourToutes les étapes communes similaires, à l'exception des différences dans le moment de l'ajout du traitement.
    1. Le jour du dosage, pipettez la matrice de la membrane du sous-sol à 10 μL / puits dans le fond des plaques à 96 puits et laissez-les enfoncer pendant 1 h à 37 ° C.
    2. Suspendre le colorant de suivi des cellules vertes lyophilisé (voir Tableau des matériaux ) dans 10 μL de DMSO pour générer une solution stock 10 mM et diluer jusqu'à 10 μM (1: 1000) dans le bas de l'EBM-2. Retirez le support du ballon entièrement confluent et remplacez-le par une base bas EBM-2 contenant le colorant de suivi des cellules vertes (5 mL pour un flacon de 75 cm2). Précharger les BEC avec le colorant de suivi des cellules vertes, 20 min avant le début de l'analyse.
    3. Incuber les cellules pendant 20-30 min à 37 ° C, enlever le milieu avec un colorant de suivi des cellules et détacher les cellules comme décrit à l'étape 1.1. Neutraliser le milieu avec EBM-2 contenant 10% de FBS et centrifuger à 240 xg pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL d'EBM-2 basal.
    4. Placer les BEC dans la plaque de 96 puits à 10 000 cellules / puits dans le bas de l'EBM-2 (point de temps de 0 h dans tous les paradigmes).
      NOTE: Selon le paradigme utilisé, les traitements, les facteurs de stress ou les contrôles du véhicule sont ajoutés aux points de temps spécifiés. Dans tous les paradigmes, le milieu est récolté pour une analyse ultérieure ( par exemple, l' analyse ELISA) et les cellules sont fixées à 24 h avec du paraformaldéhyde 4% fraîchement préparé dans le Sérum tamponné au phosphate (PBS). En tant qu'approche alternative pour déterminer le terme d'effet de l'OAß sur la formation de maille, le protocole pourrait être modifié pour pré-incuber les flacons de culture cellulaire confluents avec oAβ, puis effectuer les paradigmes de formation du maillage (+/- oAβ).
      NOTE: Le volume final dans chaque puits pour tous les paradigmes est de 70 μL. Tous les traitements (oAβ, EGF, etc. ) sont ajoutés à leurs puits respectifs à une dilution 1:20, c'est-à-dire 3,5 μL par traitement. Pour Paradigm 1, les cellules sont ajoutées dans une solution de suspension cellulaire à 63 μL / waune. Immédiatement, oAβ, les traitements désirés et les témoins sont ajoutés à 3,5 μL / puits chacun, ce qui donne un total de 70 μL. Pour Paradigm 2, 63 μL de suspension cellulaire et 3,5 μL de traitement ( par exemple, 100 ng / mL EGF) sont ajoutés au point de temps 0 h. Après 4 h d'incubation, on ajoute 3,5 μl d'un stock d'OAβ ( par exemple pour une concentration finale d'oAß de 100 nM, 3,5 μL de 2 μM de stock d'OAβ). Pour Paradigm 3, on ajoute 63 μL de suspension cellulaire au point de temps de 0 h et à 4 h, oAβ et les traitements désirés sont ajoutés à 3,5 μL / puits chacun, ce qui donne un total de 70 μL. Ces volumes peuvent être ajustés selon les traitements. Par exemple, si un seul traitement est nécessaire, le volume de la suspension cellulaire peut être ajusté à 66,5 μL (maintien de 10 000 cellules / puits) et le volume de traitement peut rester à 3,5 μL.
  2. Essai de culture triple:
    NOTE: En plus des analyses de culture unique des BEC, nous avons développéUn paradigme de dosage de culture triple ( figure 1B ) pour déterminer la réponse des BEC, des pericytes et des astrocytes dans les réseaux préformés aux facteurs de stress pertinents ( p. Ex . OAβ). Les BEC sont plaqués en présence de traitements désirés à 0 h. À 4 h, les pericytes sont ajoutés doucement à la plaque. À 7 h, les astrocytes sont ajoutés à la plaque, suivis de l'addition d'un facteur de stress à 11 h. Les cellules sont ensuite incubées jusqu'à 24 h.
    REMARQUE: pour les essais à triple culture, il est important de tenir compte du moment pour s'assurer que toutes les cellules sont confluées en même temps. Les astrocytes et les pericytes humains doivent être cultivés 1 semaine avant l'analyse, alors que les cellules hCMEC / D3 doivent être plaquées ou passées 4-5 jours avant la date d'essai. En outre, il est important d'utiliser des cellules primaires à faible passage (2-5) pour éviter la dérive phénotypique.
    1. Ajouter la solution de travail de colorant de suivi des cellules vertes aux cellules hCMEC / D3 20 min avant le début de l'essai. Placer les cellules hCMEC / D3 à 10, 000 cellules / puits en EBM-2 basal (0 h time point). Les volumes utilisés sont 45 μL de suspension cellulaire et 3,5 μL de traitement ( c.-à-d. Concentrations EGF finales de 50 ng / mL, 100 ng / mL ou 1000 ng / mL de stocks 20 fois plus concentrés).
    2. Après l'incubation de 3,5 h à 37 ° C, ajoutez la solution de traitement de colorant de suivi des cellules bleues (10 μM de tracker cellulaire bleu en EBM-2 basal) aux pericytes primaires de l'homme. Au point de temps de 4 h (~ 30 minutes d'incubation avec un colorant de suivi des cellules), ajoutez doucement 2 000 pericytes / puits à la plaque contenant le hCMEC / D3 dans un volume de 6 μl / puits.
    3. Après une incubation supplémentaire de 2,5 h (total 6,5 h à partir du point de temps de 0 h), ajoutez la solution de traitement de colorant de suivi des cellules orange (10 uM de tracker orange en EBM-2 basal) aux astrocytes primaires humains. Au point de temps de 7 h, ajoutez doucement 10 000 astrocytes / puits à la plaque dans 12 μL de volume. Par conséquent, le rapport cellulaire global pour les cellules endothéliales: pericytes: astrocytes iS 5: 1: 5. En outre, le volume atteint à ce point est de 66,5 μL.
    4. Ajouter oAβ (3,5 μL de 100 μM stock) 4 h plus tard (total 11 h à partir de 0 h point de temps).
    5. Fixer les cellules 13 h plus tard dans du paraformaldéhyde 4% fraîchement préparé dans du PBS.
      Attention: Portez des vêtements de protection, des gants et des lunettes tout en manipulant du paraformaldéhyde.

3. Quantification

  1. Capturez des images de fluorescence du puit entier de la plaque à 96 puits à un grossissement de 1,6 fois avec un temps d'exposition de 2 s à une puissance maximale de 50% à l'aide d'un microscope à dissection.
    NOTE: Des microscopes équivalents peuvent être utilisés; Cependant, il est essentiel de capturer l'intégralité du puits pour une analyse complète.
  2. Pour une analyse quantitative, traiter les images en utilisant le plugin 22 de l'analyseur d'angiogenèse ImageJ pour quantifier le nombre de branches, le nombre de mailles et la longueur totale de la cellule (ces lectures sont automatiquement tabulées par la softwaRe) comme décrit ci-dessous. Un protocole visuel détaillé de cette étape est fourni à la figure 2 .
    1. Ajoute fiji ImageJ en cliquant sur l'icône du logiciel.
    2. Cliquez sur les flèches fléchées double rouge situées à la fin de la barre d'outils, puis cliquez sur "Analyseur d'angiogenèse".
    3. Sélectionnez le dossier avec les fichiers image, cliquez sur "Ouvrir".
    4. Lorsque la zone "Paramètres d'analyse" apparaît, cliquez sur "OK".
    5. Lorsque la boîte "images de traitement" apparaît, ce qui indique le nombre d'images à traiter, cliquez sur "OK".
    6. Lorsque la fenêtre "Fenêtre de progression du lot" apparaît, ce qui indique le temps de traitement estimé. Pendant ce temps, le programme quantifie les sorties, y compris le nombre de branches, le nombre de mailles et la longueur totale de la cellule.
      REMARQUE: Une fois que toutes les images sont quantifiées, le fichier de résultats apparaîtra dans le dossier d'image d'origine comme un document de feuille de calcul.
    7. SélectionnerLe fichier de tableur contenant les résultats et compare le nombre de branches, les mailles et la longueur totale des cellules entre les groupes.
      NOTE: Dans le test de culture triple, ImageJ est également utilisé pour analyser la couverture et le nombre de percytes / astrocytes. Les images sont limitées par un expérimentateur aveugle et la fonction "analyser les particules" utilisée pour générer des lectures. Les cellules fixées et les structures en forme de tube peuvent également être immunostained pour Aß 17 ou d'autres marqueurs.

Résultats

Dans les cultures uniques, les cellules hCMEC / D3 ( Figure 3A ) et les BEC de souris primaires ( Figure 3B ) forment des structures semblables à des mailles dans le puits. Les structures sont caractérisées par un maillage de noeuds interconnectés ( Figure 3 ). Dans tous les paradigmes décrits ( figure 1 ), les structures en forme de maillage sont similaires après...

Discussion

Les méthodes décrites peuvent être utilisées pour répondre à plusieurs questions biologiques fondamentales entourant la couverture vasculaire 24 . Plus précisément, ils peuvent identifier quels récepteurs et voies de signalisation jouent un rôle dans l'angiogenèse, la couverture vasculaire dans le tissu cancéreux et les cellules endothéliales périphériques pertinentes pour le cerveau. Les exemples comprennent les récepteurs du facteur de croissance angiogénique, l'oxyde n...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Leon Tai est financé par des fonds de démarrage de l'Université d'Illinois à Chicago.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
hCMEC/D3 cellsMiliporeSCC066
EBM-2 basal mediaLonzaCC-3156
Collagen Type 1ThermoFisherA1064401
HBSS, calcium, magnesium, no phenol redThermoFisher14025092
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redThermoFisher14175095
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher25200056
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 mediaLonzaCC-4147
5% FBSLonzaCC-4147
10% Ascorbic acidLonzaCC-4147
10% Gentamycin sulphateLonzaCC-4147
25% HydrocortisoneLonzaCC-4147
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factorLonzaCC-4147
Puromycin hydrochlorideVWR80503-312
MEM-HEPESThermo Scientific12360-038
Papain cell dissociation system (papain and DNase1)Worthington BiochemicalLK003150
Human pericytesSciencell1200
Pericyte basal mediaSciencell1201
Pericyte growth supplementSciencell1252
Human AstrocytesSciencell1800
Astrocyte mediaSciencell1801
Astrocyte growth supplementSciencell1852
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)Corning356231
Angiogenesis m-plates (96-well)ibidi89646
Human Epidermal growth factorShenendoah Biotechnology100-26
CellTracker greenThermoFisherC7025
CellTracker orangeThermoFisherC34551
CellTracker blueThermoFisherC2110
Poly-l-lysineSciencell0403
10% Neutral Buffered FormalinSigma-AldrichHT5012-60ML
C57BL miceJackson Laboratoryna
PCR tube stripsGeneMateT-3014-2
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscopeZeissna

Références

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