血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ

要約

血液脳関門のカバレッジを維持することは、中枢神経系の恒常性にとって重要である。このプロトコルは、血液脳関門のカバレッジを調節する基本的および病理学的プロセスを描写するためのインビトロ技術を記載する 。

要約

血液脳関門（BBB）の適用範囲は、中枢神経系（CNS）の恒常性において中心的な役割を果たす。 BBBは、星状細胞、周皮細胞および脳内皮細胞（BEC）によって動的に維持される。ここでは、不死化ヒトBECの単一培養、初代マウスBECの単一培養、およびBBBのヒト化三重培養モデル（BEC、星状細胞および周皮細胞）を使用して、BBBカバレッジを評価する方法を詳述する。疾患状態に対するアッセイの適用性を強調するために、我々は、BBB適用範囲におけるアルツハイマー病（AD）進行の重要な要因であるオリゴマーアミロイドβ（oAβ）の効果を記載する。さらに、本発明者らは、この技術の薬物スクリーニング能力を明らかにするために、上皮増殖因子（EGF）を利用する。本発明者らの結果は、単一および三重培養BECが基底条件下で網目様構造を形成し、oAβがこの細胞網形成を破壊し、予備形成された網構造を変性させ、EGFはこの中断を阻止します。したがって、記載された技術は、BBBカバレッジを調節する基本的かつ疾患関連プロセスを解剖するために重要である。

概要

脳毛細血管の血液脳関門（BBB）は、血液と脳の接触の最大の界面であり、中枢神経系（CNS） ^1,2の恒常性において中心的な役割を果たす。 BBBでのダイナミックなプロセスは、血液からの不要な分子の取り込みを防ぎ、中枢神経系からの老廃物を除去し、必須の栄養素とシグナル伝達分子をCNSに供給し、神経炎症を調節する1,2,3,4,5。 BBB損傷は、加齢およびアルツハイマー病（AD）、多発性硬化症および脳卒中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 ^、ass = "xref"> 6。したがって、BBB機能不全は、治療標的を含む神経変性疾患において重要な役割を果たす可能性がある。

船舶のカバレッジを維持することは、BBBの恒常性機能にとって重要である。しかし、 インビボおよびインビトロでのデータ衝突は、神経変性疾患に関与するプロセスが、特にADにおいて、BBB適用範囲を6,7,8,9,10,11,12,13より高くまたは低くするかどうかについて競合する。したがって、BBBカバレッジのダイナミクスを評価し、より包括的に理解するために、関連する細胞タイプを使用したインビトロモデルの開発には強い根拠があります。脳毛細血管は、星状細胞、周皮細胞および脳内皮細胞（BEC）から構成され、 ^{3。全ての細胞型は、構造支持体を介して、パラクリンおよびオートクリン様様式で作用する血管新生増殖因子、サイトカインおよびケモカインなどのエフェクター分子の分泌を介して、BBBの機能に寄与する。しかし、BBBの主要エフェクター細胞はBECである3 。一般に、BBB機能を評価するための細胞培養技術は、ストレッサー14,15,16の添加後の両方において、フィルターインサート上で増殖させた細胞、または重要なBECタンパク質のレベルを評価する浸透性アッセイである。重要ではあるが、これらのアッセイは脳血管カバレッジに焦点を当てていない。}

ここで、我々の以前の方法¹⁷は、不死化ヒトBECの単一培養、初代マウスBECの単一培養、およびヒト化三重培養を使用して、BEC適用範囲および網状様構造を評価するために詳述されているBBBのモデル（BEC、星状細胞および周皮細胞）を同定した。目標は、AECがAD進展の重要な要因であると考えられている有害作用がBECの対象範囲に及ぼす影響を実証することでした。表皮成長因子（EGF）の保護効果は、治療スクリーニングツールとしてのこの技術の可能性を強調している。この技術は、1）血管新生および血管カバレッジにおける特定の経路の役割の描写、2）血管新生および血管カバレージに対する疾患および加齢関連因子の影響の評価、および3）薬理学的目標。

プロトコル

すべての実験は、イリノイ大学シカゴ研究所の動物用ケアおよび使用委員会のプロトコールに従う。

1.一般的な準備

注：脳微小血管内皮細胞系（hCMEC / D3）は、広範に特徴付けられた不死化ヒトBEC系統14,15,16,18,19である。基底内皮成長基質培地中のコラーゲンタイプI（子牛皮膚、Ca ²⁺およびMg ²⁺を含有するハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中0.1％溶液の1:20希釈物）で被覆した組織培養フラスコ上のhCMEC / D3細胞を培養する。 （FBS）、10％アスコルビン酸、10％硫酸ゲンタマイシン、25％ヒドロコルチゾン、および供給された成長因子サプリメントの総量の1/4を含む培地（EBM-2）血管内皮gr（VEGF）、表皮成長因子（EGF）、インスリン様増殖因子1（IGF-1）およびヒト塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）（ 表の表を参照のこと）。
注：FBSおよび増殖因子を含むEBM-2培地は、「EBM-2 complete」と呼ばれる。 FBSおよびサプリメントを含まないEBM-2は、「EBM-2 basal」と呼ばれる。完全コンフルエンスでは、hCMEC / D3細胞は約1×10 ⁵細胞/ cm ^2である 。

1. Ca ²⁺およびMg ^2+を添加しないで3分間HBSSで最初にインキュベートし、続いて5mLのトリプシン/ EDTA（0.25％）で5分間脱離させることにより、hCMEC / D3細胞を1：5の比率で通過させる。 EBM-2完全（1：1中和）を用いてトリプシンを中和し、290 xgで5分間4℃で遠心分離する;上清を捨てる。ペレットをEBM-2に再懸濁し、1：5の比率で再プレートする。
2. サプライヤーのプロトコール[ 材料の一覧 ]に従って初代ヒトの周皮細胞および星状細胞を培養する。文化FBSおよび周皮成長促進剤を伴う周皮細胞基底培地中の周皮細胞。
3. astrocyte成長因子を含むastrocyte培地中のヒトアストロサイトを培養する。細胞接着のために3mLのポリ-L-リジン（PLL）で被覆した組織培養フラスコ中の周皮細胞および星状細胞を培養し、継代2と5の間の細胞を利用する。
4. 7匹のマウスを安楽死させ、鉗子で脳幹および小脳を除去する;慎重にガーゼの上で脳を圧延して髄膜を剥離する。滅菌カミソリの刃を用いて、HEPES（脳あたり5mL）を含む最小必須培地（MEM）中のペトリ皿中の残りの脳組織を入れ替える。 2ヶ月齢のC57BL / 6Jマウス由来の一次マウスBECを、参照されたプロトコールに従って単離する。
5. 細かい脳組織を15 mLコニカルチューブに移す。 4℃で5分間290 xgで遠心分離する。上清を除去し、組織をパパイン（脳あたり833.33μL）およびDNアーゼ（脳あたり41.7μL）中でインキュベートし、溶液を37℃の水浴中で1時間インキュベートして、組織を消化する。
6. ホモジネートを19および21ゲージ針で順次粉砕し、22％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液と1：1の比で混合し、1360 xgで10分間4℃で遠心分離する。
7. 得られたペレットを1 mLのEBM-2に再懸濁し、4℃で5分間290 xgで遠心分離します。再度1mLのEBM-2で再懸濁し、コラーゲンでコーティングした6ウェルプレート（ウェルあたり〜1脳）に細胞（1mL /ウェル）をプレートする。
8. 24時間後に4μg/ mL塩酸ピューロマイシンを含むEBM-2完全培地に交換する。 2日後にEBM-2と交換してください。初代BECは、hCMEC / D3細胞と同様に培養され、1×10 ⁵細胞/ cm ²で完全コンフルエントになる。
9. アッセイの24時間前に100μMのoAβを調製する。
   注：oAβは、Aの疾患関連形態と考えられる。 oAβについては、Dahlgren ら。 ²¹ 。
10. 4℃で一晩、基底膜ストック溶液を解凍し、チューブあたり140μLの基底膜で無菌PCRチューブストリップ（8チューブ）に等分する。各ストリップを-20℃で再凍結する。アッセイの24時間前に、4℃で96ウェルプレートあたり1つのストリップを解凍する。凝固を避けるためにピペットチップをあらかじめ冷却しておいてください。
    注：基底膜マトリックスの取り扱いはすべて急速凝固を避けるために氷上で行う必要があります。アッセイ当日に1ウェルあたり10μLの基底膜が使用されるので、各ストリップは1つの96ウェルプレートに十分である。
11. アッセイの24時間前に、EBM-2基礎中の完全にコンフルエントなBECをインキュベートする。
    注：理論的根拠は次のとおりです。EBM-2 completeには、最適な細胞増殖を促進する目的で、補足因子とFBSが含まれています。しかし、細胞増殖を促進する同じ分子経路も、脳内皮細胞のカバレッジおよびダイナミクスのために、存在下および非存在下の両方で重要であるストレス要因のnce。従って、我々は、血清および補充物がBECを飢えさせて、細胞シグナル伝達経路の残留活性化の交絡作用を減少させる。注目すべきことに、アッセイ前に細胞をトリプシン処理した細胞の中和中にFBSに短時間（5分間）曝露する。 BECとは対照的に、血清飢餓に応答したこれらの細胞型の増殖および相対的不安定性のために、周皮細胞および星状細胞は血清飢餓状態ではない（タイ実験室、未発表の観察）。
    注：EBM-2基礎は、一回および三重培養の網目形成および破壊アッセイのアッセイ中に利用される。これは、交絡ストレッサーまたは治療依存性シグナル伝達を防止するために重要である。

2.メッシュワーク様の形成および破壊アッセイ

1. 単一BEC培養アッセイ：
   注：BECの単一培養の3つの異なるパラダイムが図1Aに示されている。各パラダイムは、異なる船舶モデルのBECの反応を評価するように設計されています。パラダイム1は網目の形成である。このパラダイムは、血管新生および網目形成に対するストレッサーおよび/または処置の影響を調べるために設計されている。 BEC、OAβ、および処理はすべて、0時間の時点でプレートに加えられる。パラダイム2は、網目の破壊を防止します。細胞を成長因子または薬物の存在下で播種し、4時間インキュベートして網目状構造を形成させる。この場合、ストレッサー（stressor）は、4時間後に加えられる。このパラダイムは、予め形成された網目様構造に対するストレッサー誘発損傷を防止する治療の能力を評価する。パラダイム3は、網目の破壊の同時処理です。細胞をプレーティングし、網目様構造を4時間形成させる。その後、4時間の時点で処理物およびoAβを同時に添加し、予め形成された細胞ネットワークが様々な処置に応答する能力を評価する。すべてのパラダイムfo治療の追加のタイミングの違いを除いて、同様の共通ステップがある。
   1. アッセイ当日に、96ウェルプレートの底に10μL/ウェルの基底膜マトリックスをピペットで移し、37℃で1時間セットした。
   2. 凍結乾燥緑色細胞トラッキング色素（ 材料の表を参照）を10μLDMSOに懸濁して10mMストック溶液を生成させ、EBM-2基底で10μM（1：1000）に希釈する。完全にコンフルエントなフラスコから培地を除去し、緑色細胞トラッキング色素（75cm ²フラスコの場合5mL）を含むEBM-2基底と交換する。アッセイを開始する20分前にBECに緑色細胞トラッキング色素をプレロードする。
   3. 37℃で20〜30分間細胞をインキュベートし、細胞トラッキング色素で培地を除去し、ステップ1.1で説明したように細胞を剥がす。 10％FBSを含むEBM-2で培地を中和し、4℃で5分間240xgで遠心分離します。ペレットを1mLのEBM-2基底に再懸濁する。
   4. EBM-2基礎（すべてのパラダイムで0時間時点）で10,000細胞/ウェルで96ウェルプレート中のBECをプレートする。
      注：利用されているパラダイムに応じて、治療、ストレッサー、またはビークルコントロールが指定された時点で追加されます。すべてのパラダイムで、培地を次の分析（ 例えば ELISA分析）のために採取し、細胞を24時間後に新たに調製した4％パラホルムアルデヒドをリン酸緩衝化血清（PBS）に固定する。メッシュ形成に及ぼすoAβの効果を決定する別のアプローチとして、プロトコールを改変して、コンフルエントな細胞培養フラスコをoAβと共にプレインキュベートし、次いで網目形成パラダイム（+/-oAβ）を実施することができる。
      注：すべてのパラダイムの各ウェルの最終容量は70μLです。すべての処理（oAβ、EGF など ）を1:20希釈、 すなわち処理あたり3.5μLでそれぞれのウェルに加える。パラダイム1については、細胞懸濁液中に63μL/ well。直ちに、所望の処置および対照をそれぞれ3.5μL/ウェルで加え、合計70μLとする。パラダイム2では、63時間の細胞懸濁液および3.5μLの処理（ 例えば 100ng / mLのEGF）を0時間の時点で加える。 4時間のインキュベーションの後、3.5μLのoAβストックを添加する（ 例えば 、100nMの最終OAβ濃度、3.5μLの2μMoAβストックについて）。パラダイム3については、63時間の細胞懸濁液を0時間の時点で添加し、4時間で、所望の処置をそれぞれ3.5μL/ウェルで加え、合計70μLとする。これらのボリュームは、治療法に応じて調整することができます。例えば、1回の処置のみが必要な場合、細胞浮遊液量は66.5μL（10,000細胞/ウェルを維持する）に調整することができ、処理量は3.5μLのままでよい。
2. トリプル培養アッセイ：
   注：BECの単一培養アッセイに加えて、我々は、関連するストレッサー（ 例： oAβ）に対する予備形成されたネットワーク内のBEC、周皮細胞、および星状細胞の応答を決定するための三重培養アッセイパラダイム（ 図1B ）を開発した。 BECは、0時間で所望の処理の存在下でメッキされる。 4時間で、周皮細胞を静かにプレートに添加する。 7時間目に、星状細胞をプレートに添加し、続いて11時間でストレッサーを添加する。次いで、24時間の時点まで細胞をインキュベートする。
   注：トリプル培養アッセイの場合、すべての細胞が同時にコンフルエントになるようにタイミングを検討することが重要です。アッセイの1週間前にヒトの星状細胞および周皮細胞を培養しなければならないが、hCMEC / D3細胞はアッセイ日の4〜5日前に培養または継代培養する必要がある。さらに、表現型のドリフトを避けるために、低継代（2-5）初代細胞を使用することが重要である。
   1. アッセイを開始する20分前に、緑色の細胞追跡色素操作溶液をhCMEC / D3細胞に添加する。 10にhCMEC / D3細胞をプレートする。、EBM-2基底（0時間時点）における000細胞/ウェル。使用される容量は、45μLの細胞懸濁液および3.5μLの処理（ すなわち 、20倍濃縮されたストックから50ng / mL、100ng / mLまたは1,000ng / mLの最終EGF濃度）である。
   2. 37℃で3.5時間インキュベートした後、青色細胞追跡色素作動溶液（EBM-2基底部の10μM細胞トラッカーブルー）をヒトの周皮細胞に添加する。 4時間の時点（細胞トラッキング色素を用いて約30分間のインキュベーション）で、6μL/ウェルの体積のhCMEC / D3を含むプレートに2,000細胞/周を静かに加える。
   3. 追加の2.5時間のインキュベーション（0時間時点から合計6.5時間）後、オレンジ細胞追跡色素作動溶液（EBM-2基底部に10μM細胞トラッカーオレンジ）をヒト初代星状細胞に加える。 7時間の時点で、12μL容量のプレートに10,000個の星状細胞/ウェルを静かに加える。したがって、内皮細胞：血管周囲細胞：星状細胞is 5：1：5である。さらに、この時点までに達成された体積は66.5μLである。
   4. 4時間後（0時間の時点から合計11時間）、oAβ（100μMストック3.5μL）を加える。
   5. 新しく調製したPBS中の4％パラホルムアルデヒド中で13時間後に細胞を固定する。
      注意：パラホルムアルデヒドを取り扱う際は保護服、手袋、眼鏡を着用してください。

3.定量

1. 96ウェルプレートのウェル全体の蛍光画像を解剖顕微鏡を用いて50％最大出力で2秒の曝露時間で1.6倍の倍率で捕捉する。
   注：等価顕微鏡を利用することができます。ただし、包括的な分析のためにウェル全体をキャプチャすることが重要です。
2. 定量分析のために、ImageJ血管新生分析プラグイン²²を使用して画像を処理して、枝の数、メッシュの数、および全細胞の長さを定量する（これらの読み取り値は、ソフトワre）を使用します。このステップの詳細なビジュアルプロトコルを図2に示します。
   1. ソフトウェアアイコンをクリックしてfiji ImageJを開きます。
   2. ツールバーの最後にある二重赤矢印をクリックし、「Angiogenesis Analyzer」をクリックします。
   3. イメージファイルを含むフォルダを選択し、[開く]をクリックします。
   4. [分析の設定]ボックスが表示されたら、[OK]をクリックします。
   5. 処理する画像の数を示す「画像の処理」ボックスが表示されたら、「OK」をクリックします。
   6. 「バッチ進行状況」ボックスが表示され、予測処理時間が示されます。この時間の間、プログラムは、分岐の数、メッシュの数、および全セル長さを含む出力を定量化する。
      注：すべてのイメージが定量化されると、結果ファイルは元のイメージフォルダにスプレッドシートドキュメントとして表示されます。
   7. 選択スプレッドシートファイルには結果が含まれ、グループ間のブランチ、メッシュ、およびセルの総数が比較されます。
      注：三重培養アッセイにおいて、ImageJは、周細胞/星状細胞のカバレージおよび数を分析するためにさらに利用される。画像は、盲検の実験者によって閾値処理され、「粒子を分析する」機能は、読み取り値を生成するために利用される。固定された細胞および管様構造も、Aβ17または他のマーカーについて免疫染色することができる。

結果

単一培養では、hCMEC / D3細胞（ 図3A ）および初代マウスBEC（ 図3B ）の両方が、ウェル全体にわたって網目状の構造を形成する。構造は、相互リンクされたノードの網目構造によって特徴付けられます （ 図3 ）。記載されたすべてのパラダイム（ 図1 ）にお...

ディスカッション

記載された方法は、脳血管カバレッジを取り巻くいくつかの基本的な生物学的問題に対処するために利用することができる²⁴ 。具体的には、どの受容体およびシグナル伝達経路が、血管新生、癌組織における血管カバレッジ、および脳に関連する末梢内皮細胞において役割を果たすかを同定することができる。例としては、血管新生増殖因子受容体、酸化窒素、マイトジェ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
hCMEC/D3 cells	Milipore	SCC066
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156
Collagen Type 1	ThermoFisher	A1064401
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14025092
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14175095
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media	Lonza	CC-4147
5% FBS	Lonza	CC-4147
10% Ascorbic acid	Lonza	CC-4147
10% Gentamycin sulphate	Lonza	CC-4147
25% Hydrocortisone	Lonza	CC-4147
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor	Lonza	CC-4147
Puromycin hydrochloride	VWR	80503-312
MEM-HEPES	Thermo Scientific	12360-038
Papain cell dissociation system (papain and DNase1)	Worthington Biochemical	LK003150
Human pericytes	Sciencell	1200
Pericyte basal media	Sciencell	1201
Pericyte growth supplement	Sciencell	1252
Human Astrocytes	Sciencell	1800
Astrocyte media	Sciencell	1801
Astrocyte growth supplement	Sciencell	1852
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)	Corning	356231
Angiogenesis m-plates (96-well)	ibidi	89646
Human Epidermal growth factor	Shenendoah Biotechnology	100-26
CellTracker green	ThermoFisher	C7025
CellTracker orange	ThermoFisher	C34551
CellTracker blue	ThermoFisher	C2110
Poly-l-lysine	Sciencell	0403
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT5012-60ML
C57BL mice	Jackson Laboratory	na
PCR tube strips	GeneMate	T-3014-2
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope	Zeiss	na