ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Summary

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

Abstract

מחסום דם מוחי (BBB) ​​מכסה תפקיד מרכזי בהומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS). BBB מתוחזק באופן דינמי על ידי האסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל במוח (BECs). כאן, אנו מפרטים שיטות להעריך כיסוי BBB באמצעות תרבויות יחיד של BECs האדם הנציח, תרבויות יחיד של BECs העכבר הראשי, ואת מודל התרבות משולש אנושית (BECs, astrocytes ו pericytes) של BBB. כדי להדגיש את הישימות של מבחני למדינות מחלה, אנו מתארים את ההשפעה של olylomeric amyloid-β (oAβ), שהוא תורם חשוב להתפתחות אלצהיימר (AD) התקדמות, על כיסוי BBB. יתר על כן, אנו מנצלים את גורם הצמיחה באפידרמיס (EGF) כדי להאיר את פוטנציאל ההקרנה של התרופה של הטכניקות. התוצאות שלנו מראים כי BECs מתורבת יחיד יחיד משולש ליצור מבנים דמויי רשת כמו בתנאים הבסיסיים, וכי oAβ משבש את זה מבנה התא meshwork ו degenerates מבני רשת preformed,אבל EGF חוסם את ההפרעה הזאת. לכן, הטכניקות המתוארות חשובות לנתח תהליכים בסיסיים וחולי רלוונטיים המווסתים את כיסוי ה- BBB.

Introduction

מחסום דם מוח (BBB) ​​של נימים מוחיים הוא הממשק הגדול ביותר של מגע בין דם למוח וממלא תפקיד מרכזי בהומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ^{1 , 2} . תהליכים דינמיים ב- BBB מונעים את ספיגה של מולקולות לא רצויות מהדם, מסירים את מוצרי הפסולת מה- CNS, מספקים חומרים מזינים חיוניים ומולקולות איתות ל- CNS, ומווסתים את הנוירו-דלקתיות ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . נזקי BBB נפוצים במהלך ההזדקנות וכמה הפרעות ניווניות כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה ושבץ ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,}התחת = "xref"> 6. לכן, תפקוד לקוי של BBB עשוי למלא תפקיד מפתח בהפרעות נוירודגנרטיביות, כולל כמטרה טיפולית.

שמירה על כיסוי כלי חשוב עבור פונקציות homeostatic של BBB. עם זאת, in vivo ו במבחנה נתונים הסכסוך על אם התהליכים המעורבים הפרעות נוירודגנרטיב לגרום כיסוי BBB גבוה או נמוך יותר ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} , במיוחד לספירה. לכן, יש רציונל חזק לפיתוח של מודלים במבחנה באמצעות סוגי תאים רלוונטיים כדי להעריך באופן מקיף יותר להבין את הדינמיקה של כיסוי BBB. נימים מוחיים מורכבים אסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל במוח (BECs) ^{3. כל סוגי התאים לתרום את הפונקציה של BBB באמצעות תמיכה מבנית ועל ידי הפרשת המולקולות מפעיל כגון גורמי גדילה אנגיוגניים, ציטוקינים chemokines הפועלים באופרה paracrine ו אוטוקרינית. עם זאת, התאים העיקריים אפקטור של BBB הם BECs 3 . באופן כללי, טכניקות תא התרבות להערכת פונקציה BBB הן מבחני חדירות המבוצעת על תאים הגדלים על מסננים מוסיף, או הערכת רמות של חלבונים BEC מפתח, הן לאחר תוספת של לחצים 14 , 15 , 16 . למרות חשוב, מבחני אלה אינם מתמקדים כיסוי המוח.}

הנה, השיטות הקודמות שלנו ¹⁷ מפורטים כדי להעריך כיסוי BEC ומבנים דמויי רשת כמו באמצעות תרבויות יחיד של BECs האדם הנציח, תרבויות יחיד של BECs העכבר הראשי, תרבות משולשת אנושית(BECs, astrocytes ו pericytes) של BBB. המטרה היתה להדגים את ההשפעה המזיקה של OAβ, הנחשב תורם חשוב להתקדמות AD, על כיסוי BEC. האפקט המגן של גורם הצמיחה באפידרמיס (EGF) מדגיש את הפוטנציאל של הטכניקה ככלי סינון טיפולי. טכניקה זו כוללת מספר יישומים נרחבים למחקר בסיסי ויישומי, כולל:) 1 הגדרת תפקידם של מסלולים ספציפיים באנגיוגנזה וכיסוי כלי שיט,) 2 הערכת ההשפעות של מחלות וגורמים רלוונטיים להזדקנות על אנגיוגנזה ועל כיסוי כלי, 3) זיהוי תרופתי מטרות.

Protocol

כל הניסויים בצע את אוניברסיטת אילינוי, שיקגו מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת פרוטוקולים.

1. הכנה כללית

הערה: המוח בתאי המוח האנדותל המוחית (hCMEC / D3) הוא קו BEC ^{14 , 15 , 16 , 18 , 19} . תרבות hCMEC / D3 תאים על צלוחיות רקמה תרבות מצופה קולגן סוג אני (עגל העור, 1:20 דילול של פתרון 0.1% ב Hank של תמיסת מלח מאוזן (HBSS) המכיל Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +} ) ב Basal צמיחה האנדותל הבסיס (EBM-2) המכיל 2-5% סרום שור העובר (FBS), חומצה אסקורבית 10%, 10% גנטמיצין גנטמיצין, 25% hydrocortisone ו 1/4 מהנפח הכולל של גורם הגדילה גדל גורם לכל 500 מ"ל של התקשורת [ אנדותל כלי הדם(EGF), גורם גדילה דמוי-אינסולין (EGF), גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) ופקטור הגידול הפיברובלסטי הבסיסי האנושי (bFGF), ראה טבלה של חומרים ].
הערה: מדיום EBM-2 עם FBS וגורמי גדילה נקראים "EBM-2 Complete". EBM-2 ללא FBS ותוספות מכונה "EBM-2 הבסיס". במפגש מלא, תאים hCMEC / D3 הם ~ 1 x 10 ⁵ תאים / ס"מ ² .

1. מעבר תאים HCMEC / D3 ביחס של 1: 5 על ידי הדגירה הראשונה עם HBSS במשך 3 דקות ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +} ואחריו ניתוק עם 5 מ"ל טריפסין / EDTA (0.25%) במשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין באמצעות EBM-2 מלאה (ניטרול 1: 1), ו צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C; להשליך את supernatant. Resuspend גלולה ב EBM-2 להשלים מחדש צלחת ביחס 1: 5.
2. תרבות האדם העיקרי pericytes ו astrocytes על פי פרוטוקול הספק [ טבלה של חומרים ]. תרבותיE pericytes במדיום הבסיסי pericyte עם FBS ותוספת גידול pericyte.
3. תרבות האסטרוציטים האנושיים במדיום האסטרוציטים המכילים גורמי גדילת האסטרוציטים. התרבות הן pericytes ו astrocytes ב צלוחיות רקמה תרבות מצופה 3 מ"ל של פולי- L- ליזין (PLL) עבור התא דבקות לנצל את התאים בין מעברים 2 ו - 5.
4. להרדים 7 עכברים ולהסיר את הגבעולים במוח cerebella עם מלקחיים; לנתק את הקרום על ידי גלגול בזהירות את המוח על גזה. לשרוף את רקמת המוח הנותרת בצלחת פטרי במינימלי Essential בינוני (MEM) עם HEPES (5 מ"ל לכל מוח) עם להב גילוח סטרילי. לבודד את BECs העכבר העיקרי של 2 חודשים בן C57BL / 6J עכברים על פי פרוטוקול הפניה ²⁰ .
5. מעבירים את הרקמה המוח טחנת צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו דגירה הרקמה ב papain (833.33 μL לכל מוח) ו DNase (41.7 μL לכל מוח)פתרון, ב 37 מעלות צלזיוס אמבטיה במשך שעה 1, לעכל את הרקמה.
6. Triturate homogenate ברצף באמצעות מחטים 19 ו 21 מד, לערבב ביחס 1: 1 עם פתרון Bowine בסרום 22 אלבומין (BSA), ו צנטריפוגות ב XG 1360 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
7. Resuspend גלולה שהתקבל ב 1 מ"ל EBM-2 מלאה צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend שוב 1 מ"ל EBM-2 מלא צלחת התאים (1 מ"ל / טוב) על 6 צלחות היטב מצופה קולגן (~ 1 המוח לכל טוב).
8. החלף את התקשורת 24 שעות מאוחר יותר עם EBM-2 להשלים המכיל 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​puromycin hydrochloride; להחליף עם EBM-2 להשלים לאחר 2 ימים. BECs העיקרי מתורבת כמו לתאי hCMEC / D3 והם במפגש מלא ב 1 x 10 ⁵ תאים / ס"מ ² .
9. הכן מיקרומטר 100 של oAβ, 24 שעות לפני assay.
   הערה: oAβ נחשב בצורת המחלה הרלוונטית של A. עבור oAβ, השתמש היטב מאופיין ההכנות שתוארו על ידי DahlgreN et al. ²¹ .
10. להפשיר את הפתרון בממברנה במרתף המניה לילה ב 4 ° C ו aliquot לתוך סטרילי סטרילי PCR רצועות (8 צינורות) ב 140 קרום המרתף μL לכל צינור. Refreeze כל רצועה ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. להפשיר רצועה אחת לכל 96 - גם צלחת על 4 מעלות צלזיוס, 24 שעות לפני assay. טרום מגניב טיפים פיפטה כדי למנוע התמצקות.
    הערה: כל הטיפול במטריצת הממברנה במרתף חייב להתבצע על הקרח כדי למנוע הידוק מהיר. כמו 10 μL לכל טוב של קרום במרתף משמש ביום assay, כל רצועה מספיקה עבור צלחת 96-היטב.
11. דגירה BECs ומחוברות במלואה בבסיס EBM-2, 24 שעות לפני assay.
    הערה: הרציונל הוא: EBM-2 להשלים מכיל גורמים נוספו FBS במטרה לקדם את הצמיחה התא אופטימלית; אולם, אותם מסלולים מולקולריים המקדמים את צמיחת התאים חשובים גם לכיסוי תאי האנדותל של המוח ולדינמיקה, הן בנוכחות והן בשכיחותלא של לחץ. לכן, אנו מוסיפים את הרעל והורדים את BEC על מנת להפחית את האפקט המבלבל של הפעלה שיורית של מסלולי איתות סלולריים. שים לב, התאים הם בקצרה (5 דקות) חשופים FBS במהלך ניטרול של תאים trypsinized לפני assay. בניגוד BECs, pericytes ו astrocytes אינם מורעבים בסרום, בשל הדרישה של גורמים שונים לצמיחה וחוסר היציבות היחסית של סוגי תאים אלה בתגובה רעב בסרום (מעבדה טאי, תצפיות שלא פורסמו).
    הערה: הבסיס EBM-2 מנוצלת במהלך assay עבור יחיד ושלוש תרבות meshwork ו מבחני הפרעה. זה קריטי כדי למנוע בלבול confounding או טיפול תלוי איתות.

2. Meshwork- כמו גיבוש ו הפרעה Assays

1. בודד BEC תרבות מבחני:
   הערה: שלוש פרדיגמות שונות עבור תרבויות יחיד של BECs מוצגים בתרשים 1A . כל פרדיגמה נועדה להעריך את התגובה של BECs במודלים שונים של כיסוי כלי שיט. פרדיגמה 1 הוא מבנה רשת. פרדיגמה זו נועדה לבחון את ההשפעות של לחצים ו / או טיפולים על אנגיוגנזה ויצירת רשת. BECs, oAβ, וטיפולים מתווספים כולם לצלחת בנקודת הזמן 0 h. פרדיגמה 2 היא מניעת שיבושים ברשת. תאים מצופים בנוכחות גורם גדילה או סמים מודגרת במשך 4 שעות כדי ליצור מבנים דמויי רשת. לחץ, oAβ במקרה זה, נוסף לאחר 4 שעות. פרדיגמה זו מעריכה את היכולת של טיפול כדי למנוע נזק הנגרם על ידי לחץ, למבנים דמויי רשת. פרדיגמה 3 הוא טיפול בו-זמני של הפרעה ברשת. תאים מצופים מותר ליצור מבנים דמויי רשת כמו 4 שעות. טיפולים ו oAβ לאחר מכן הוסיף בו זמנית בנקודת זמן 4 שעות, להעריך את היכולת של רשת התא preformed להגיב טיפולים שונים. כל הפרדיגמותLlow צעדים נפוצים דומים, למעט עם ההבדלים בעיתוי של תוספת הטיפול.
   1. ביום assay, פיפטה המטריצה ​​במרתף במרתף 10 μL / גם לתוך החלק התחתון של צלחות 96-היטב ולאפשר להגדיר עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. להשעות את lyophilized תא ירוק מעקב צבע (ראה טבלה של חומרים ) ב 10 DMSO μL כדי ליצור פתרון מלאי 10 מ"מ, ו לדלל ל 10 מיקרומטר (1: 1000) בבסיס EBM-2. הסר את התקשורת מן הבקבוק ומחוברות לחלוטין ולהחליף EBM-2 הבסיס המכיל את התא ירוק צבע מעקב (5 מ"ל על בקבוק 75 ס"מ ² ). Preload BECs עם צבע ירוק מעקב התא, 20 דקות לפני תחילת assay.
   3. דגירה התאים 20-30 דקות על 37 מעלות צלזיוס, להסיר את המדיום עם צבע התא מעקב, לנתק את התאים כמתואר בשלב 1.1. לנטרל את התקשורת עם EBM-2 המכיל 10% FBS ו צנטריפוגה ב XG 240 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של EBM-2 הבסיס.
   4. צלחת BECs בצלחת 96-היטב ב 10,000 תאים / גם EBM-2 הבסיס (0 שעות נקודת הזמן בכל הפרדיגמות).
      הערה: בהתאם לפרדיגמה בשימוש, טיפולים, לחצים, או פקדי הרכב מתווספים בנקודות הזמן שצוין. בכל הפרדיגמות, המדיום נקצר לניתוח שלאחר מכן ( למשל ניתוח ELISA) ותאים קבועים ב 24 שעות עם paraformaldehyde 4% מוכן טרי ב פוספט שנאגרו בסרום (PBS). כגישה חלופית כדי לקבוע את ההשפעות טווח של oAβ על היווצרות רשת, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי מראש דגירה צלוחיות תרבות תאים confluent עם oAβ, ולאחר מכן לבצע את פרדיגמות היווצרות meshwork (+/- oAβ).
      הערה: נפח הסופי בכל טוב עבור כל הפרדיגמות הוא 70 μL. כל הטיפולים (oAβ, EGF, וכו ' ) מתווספים בארות בהתאמה שלהם בדילול 1:20 כלומר 3.5 μL לכל טיפול. עבור פרדיגמה 1, התאים מתווספים פתרון ההשעיה התא ב 63 μL / wEll. OAβ מיד, טיפולים הרצוי, ובקרות מתווספים 3.5 μL / טוב כל אחד, נותן סך של 70 μL. עבור פרדיגמה 2, 63 μL ההשעיה התא 3.5 μL של הטיפול ( למשל 100 ng / מ"ל ​​EGF) מתווספים בנקודת זמן 0 h. לאחר הדגירה 4 שעות, 3.5 μL של מלאי oAβ נוסף ( למשל עבור 100 nM ריכוז oAβ הסופי, 3.5 μL של 2 מיקרומטר oAβ המניות). עבור פרדיגמה 3, 63 μL ההשעיה התא מתווסף בנקודת זמן 0 שעה ב 4 שעות, oAβ וטיפולים הרצוי מתווספים 3.5 μL / טוב כל אחד, נותן סך של 70 μL. כרכים אלה יכולים להיות מותאמים בהתאם לטיפולים. לדוגמה, אם רק טיפול אחד נדרש, נפח ההשעיה התא יכול להיות מותאם 66.5 μL (שמירה על 10,000 תאים / טוב) ואת נפח הטיפול יכול להישאר 3.5 μL.
2. אסאי תרבות משולשת:
   הערה: בנוסף מבחני תרבות אחת של BECs, יש לנו לפתחאד פרדיגמה assay תרבות משולשת ( איור 1 ב ) כדי לקבוע את התגובה של BECs, pericytes, ו astrocytes בתוך רשתות preformed כדי רלוונטיים stressors ( למשל oAβ). BECs מצופה בנוכחות טיפולים הרצוי ב 0 h. ב 4 שעות, pericytes מתווספים בעדינות לצלחת. בשעה 7 שעות, אסטרוציטים מתווספים לצלחת, ואחריו תוספת של מתח ב 11 שעות. תאים מודגרת אז עד נקודת זמן 24 שעות.
   הערה: עבור מבחני תרבות משולשת, חשוב לשקול עיתוי כדי להבטיח שכל התאים מחוברים בו זמנית. אסטרוציטים אנושיים pericytes צריך להיות מתורבת 1 שבוע לפני assay, ואילו hCMEC / D3 תאים צריך להיות מצופה או passaged 4-5 ימים לפני תאריך assay. יתר על כן, חשוב להשתמש במעבר נמוך (2-5) תאים ראשוניים, כדי למנוע סחיפה פנוטיפי.
   1. הוסף את התא הירוק מעקב צבע עובד פתרון לתאי hCMEC / D3 20 דקות לפני תחילת assay. פלייט את hCMEC / D3 תאים בשעה 10, 000 תאים / גם EBM-2 הבסיס (0 שעות נקודת זמן). הכרכים המשמשים 45 μL ההשעיה התא 3.5 μL של טיפול ( כלומר ריכוז EGF הסופי של 50 ng / mL, 100 ng / mL, או 1000 ng / mL ממניות כי הם 20 פעמים מרוכז יותר).
   2. לאחר הדגירה 3.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס, מוסיפים את התא הכחול מעקב צבע עובד פתרון (10 מיקרומטר תא גשש כחול EBM-2 הבסיס) כדי pericytes העיקרי האדם. בנקודת זמן 4 שעות (~ 30 דקות הדגירה עם צבע מעקב התא), בעדינות להוסיף 2000 pericytes / גם על הצלחת המכילה את hCMEC / D3 בנפח של 6 μL / טוב.
   3. לאחר הדגירה 2.5 שעות נוספות (סה"כ 6.5 שעות מ 0 נקודת זמן שעה), להוסיף את התא כתום מעקב צבע פתרון עובד (10 מיקרומטר תא גשש כתום EBM-2 הבסיס) כדי האסטרוציטים העיקרי האדם. בנקודת זמן 7 שעות, בעדינות להוסיף 10,000 astrocytes / גם את הצלחת נפח 12 μL. לכן, היחס הסלולרי הכולל לתאי האנדותל: pericytes: astrocytes iS 5: 1: 5. יתר על כן, נפח שהושג לנקודה זו הוא 66.5 μL.
   4. הוסף oAβ (3.5 μL של 100 מיקרומטר המניה) 4 שעות מאוחר יותר (סה"כ 11 שעות מ 0 נקודת זמן שעה).
   5. תקן את התאים 13 שעות מאוחר יותר paraformaldehyde 4% מוכן טרי PBS.
      זהירות: ללבוש ביגוד מגן, כפפות, משקפיים תוך טיפול paraformaldehyde.

3. כימות

1. ללכוד תמונות הקרינה של כל טוב של צלחת 96-היטב בהגדלה 1.6X עם זמן חשיפה של 2 ב 50% כוח מקסימלי באמצעות מיקרוסקופ לנתח.
   הערה: מיקרוסקופים שווה יכול להיות מנוצל; עם זאת, זה קריטי כדי ללכוד את הבאר כולו לניתוח מקיף.
2. לשם ניתוח כמותי, לעבד את התמונות באמצעות ImageJ angiogenesis תוסף plugin ²² לכמת את מספר הענפים, מספר meshes, ואת אורך התא הכולל (אלה readouts הם tabulated באופן אוטומטי על ידי softwaRe) כמתואר להלן. פרוטוקול חזותי מפורט של שלב זה מסופק באיור 2 .
   1. פתח את fiji ImageJ על-ידי לחיצה על סמל התוכנה.
   2. לחץ על חצים קדימה אדום אדום הממוקם בסוף סרגל הכלים, ולאחר מכן לחץ על "אנגיוגנזה Analyzer".
   3. בחר את התיקיה עם קבצי תמונה, לחץ על "פתח".
   4. כאשר מופיעה תיבת "הגדרות לניתוח", לחץ על "אישור".
   5. כאשר מופיעה תיבת "עיבוד תמונות", המציינת את מספר התמונות שיש לעבד, לחץ על "אישור".
   6. כאשר מופיעה תיבת "חלון התקדמות אצווה", המציינת את זמן העיבוד המשוער. במהלך תקופה זו התוכנית לכמת את התפוקות, כולל מספר סניפים, מספר meshes, ואת אורך התא הכולל.
      הערה: לאחר הכנת כל התמונות, קובץ התוצאות יופיע בתיקיית התמונה המקורית כמסמך גיליון אלקטרוני.
   7. בחרקובץ הגיליון המכיל תוצאות ולהשוות את מספר הענפים, הרשתות ואורך התא הכולל בין הקבוצות.
      הערה: בתרשים assay תרבות משולש ImageJ מנוצל עוד יותר כדי לנתח כיסוי pericyte / astrocyte ומספר. תמונות הם thresholded על ידי נסיין עיוור ואת "לנתח חלקיקים" פונקציה מנוצל כדי ליצור readouts. תאים קבועים כמו מבנים דמויי צינור יכול גם להיות immunostained עבור Aβ ¹⁷ או סמנים אחרים.

תוצאות

בתרבויות בודדות, הן hCMEC / D3 תאים ( איור 3 א ) ואת BECs העכבר הראשי ( איור 3 ב ) טופס מבנים דמויי רשת כמו בכל רחבי הבאר. המבנים מאופיינים על ידי רשת של צמתים interlinked ( איור 3 ). בכל הפרדיגמות המתוארות ( אי...

Discussion

השיטות המתוארות ניתן להשתמש כדי לענות על כמה שאלות ביולוגיות היסוד סביב כיסוי המוחי ²⁴ . באופן ספציפי, הם יכולים לזהות אילו קולטנים מסלולי איתות לשחק תפקיד אנגיוגנזה, כיסוי כלי הדם ברקמת סרטן, ותאי האנדותל היקפיים הרלוונטיים למוח. הדוגמאות כוללות קולטני ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
hCMEC/D3 cells	Milipore	SCC066
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156
Collagen Type 1	ThermoFisher	A1064401
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14025092
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14175095
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media	Lonza	CC-4147
5% FBS	Lonza	CC-4147
10% Ascorbic acid	Lonza	CC-4147
10% Gentamycin sulphate	Lonza	CC-4147
25% Hydrocortisone	Lonza	CC-4147
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor	Lonza	CC-4147
Puromycin hydrochloride	VWR	80503-312
MEM-HEPES	Thermo Scientific	12360-038
Papain cell dissociation system (papain and DNase1)	Worthington Biochemical	LK003150
Human pericytes	Sciencell	1200
Pericyte basal media	Sciencell	1201
Pericyte growth supplement	Sciencell	1252
Human Astrocytes	Sciencell	1800
Astrocyte media	Sciencell	1801
Astrocyte growth supplement	Sciencell	1852
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)	Corning	356231
Angiogenesis m-plates (96-well)	ibidi	89646
Human Epidermal growth factor	Shenendoah Biotechnology	100-26
CellTracker green	ThermoFisher	C7025
CellTracker orange	ThermoFisher	C34551
CellTracker blue	ThermoFisher	C2110
Poly-l-lysine	Sciencell	0403
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT5012-60ML
C57BL mice	Jackson Laboratory	na
PCR tube strips	GeneMate	T-3014-2
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope	Zeiss	na