用3D-FRAP显微镜分析miRNA的间隙连接依赖性转移

摘要

在这里，我们描述了光漂白后三维荧光恢复（3D-FRAP）的应用，用于分析miRNA的间隙连接依赖穿梭。与通常应用的方法相比，3D-FRAP允许实时定量小RNA的细胞间转移，具有高的时空分辨率。

摘要

小反义RNA（如miRNA和siRNA）在细胞生理学和病理学中起重要作用，而且可用作治疗几种疾病的治疗剂。开发miRNA / siRNA治疗新的创新策略是基于对基础机制的广泛了解。最近的数据表明，小细胞以间隙连接依赖的方式在细胞之间进行交换，从而在受体细胞中诱导基因调控作用。分子生物学技术和流式细胞仪分析通常用于研究miRNA的细胞间交换。然而，这些方法不提供高的时间分辨率，这在研究分子的间隙连接通量时是必需的。因此，为了研究miRNA / siRNA作为细胞间信号分子的影响，需要新的工具，这将允许在细胞水平上分析这些小RNA。本协议描述了ap光漂白后三维荧光恢复（3D-FRAP）显微镜的澄清，以阐明心脏细胞之间的miRNA分子的间隙连接依赖性交换。重要的是，这种直接和非侵入性的活细胞成像方法允许实时荧光标记的小RNA的间隙连接穿梭的可视化和定量，具有高的时空分辨率。通过3D-FRAP获得的数据证实了细胞间基因调控的新途径，其中小RNA作为细胞间网络内的信号分子。

引言

小的非编码RNA是细胞基因调控的重要参与者。这些分子由与特异性靶mRNA结合的20-25个核苷酸组成，导致翻译的阻断或mRNA降解^1,2 。由小RNA（例如miRNA和siRNA）进行的基因调控过程是许多不同物种中发现的高度保守的机制。特别地，miRNA分子对多种生理过程至关重要，包括增殖，分化和再生^4,5 。此外，miRNA表达的失调归因于许多病理学障碍。相应地，miRNA已经被证明适合作为诊断的生物标志物和用作基因治疗的治疗剂^6,7 。

间隙连接（GJs）是两个相邻细胞的质膜中的专门的蛋白质结构，允许分子量高达1kD的扩散交换。已被证明对于组织发育，分化，细胞死亡和病理性疾病如癌症或心血管疾病^{8,9,10很重要} 。已经描述了几个分子能够穿过GJ通道，包括离子，代谢物和核苷酸。有趣的是，还发现GJs为小RNA ^11,12的细胞间移动提供了途径。因此，miRNA不仅可以在其产生的细胞内，而且在受体细胞内起作用。这突出了miRNA在细胞间信号转导系统中的作用。同时，数据显示该间隙连接细胞间通讯与miRNA功能密切相关。由于miRNA和GJs对组织稳态，病理学和诊断的重大影响，全面了解GJs的功能和miRNA的相关细胞间动力学有助于阐明基于miRNA的疾病的机制，并制定新的策略miRNA疗法。

根据间隙连接耦合的程度，miRNA分子在细胞间的转移可以是非常快速的过程。因此，需要一种允许可视化和量化这些调节信号分子的快速细胞间移动的方法。通常，已经应用流式细胞术和分子生物学技术来证明小RNA的穿梭11,12,13,14。然而，与FRAP微观相反复制，这些方法缺乏高时间分辨率，这是通过GJs分析miRNA的交换时强制的。此外，FRAP显微镜侵入性较小，因此代表了一种功能强大且新颖的活细胞成像技术，用于评估几种15,16,17型细胞中分子的GJ依赖性交换。

在这里，我们提出了一个详细的协议，描述了3D-FRAP应用于评估心肌细胞之间的miRNA穿梭。为此，用荧光标记的miRNA转染心肌细胞。用该miRNA标记的细胞被光漂白，并且以时间依赖的方式记录来自相邻细胞的间隙连接miRNA再流入。 FRAP实验的高时间分辨率提供了进行动力学研究以准确评估活细胞之间的miRNA和siRNA的细胞间转移的可能性。 Moreo由于小RNA可以通过具有高度不同动力学的不同机制进行交换，FRAP显微镜可以帮助澄清GJ在相应的穿梭过程¹⁸中涉及的程度。此外，3D-FRAP可用于研究GJ通透性的生理和病理学改变及其对小RNA转移的影响15,19。

研究方案

根据罗斯托克大学医学中心动物护理的道德准则进行了涉及新生小鼠的本议定书中的所有步骤。

1.细胞培养皿和心肌细胞培养基的制备

1. 用PBS中的0.1％明胶包被细胞培养板，并在37℃下孵育4小时或在4℃下孵育过夜。取出明胶，使其在无菌层流空气流下干燥。
2. 准备由补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）的50mL的DMEM组成的细胞培养基。预热至37°C。

2.新生儿心肌细胞的分离

1. 用无菌剪刀斩首新生儿小鼠（1-2天），沿胸骨打开胸部。使用镊子去除心脏，同时轻轻地将胸部按压在一起，并将心脏转移到含有冰冷HBSS的24孔板中（不含Ca ²⁺和Mg ²⁺ ）。
2. 使用无菌镊子去除非心脏组织和较大的血管。将清洁的心脏转移到含有冰冷HBSS的1.5mL管中。每管最多使用5颗心进行酶消化。
3. 用小剪刀将心脏夹碎成0.5至1毫米3片。
4. 使用1 mL微量移液管抽吸/添加HBSS，用HBSS洗涤切碎的心脏两次。加入酶前，彻底清除HBSS。
5. 对于新生儿心脏的酶消化，使用市售的试剂盒，并遵循制造商的方案（参见材料表 ）。每5分钟摇动含有切碎的心脏的管，同时用酶在37℃下孵育35分钟。
6. 将含有细胞培养基的未包被的细胞培养皿上的悬浮细胞悬浮1.5-2小时以允许非心肌细胞部分的粘附。如果高纯度重复此步骤需要心肌细胞。如果需要，进一步培养非心肌细胞部分。
   注意:对于15个心脏的细胞悬浮液，可以在75cm 2的细胞培养瓶上进行预镀层步骤。通常，从一个新生儿心脏获得〜5×10 ^5个细胞。
7. 将上清液收集在15 mL锥形管中，并以300 x g离心10 min。将细胞重悬于1mL细胞培养基中。
8. 用Neubauer室血细胞计数器计数细胞，或使用等效方法。
9. 在密度为3×10 ^5个细胞/ cm 2的6孔板上平板分离的心肌细胞。在37℃和5％CO ₂下孵育细胞过夜。
   注意:任选地，细胞也可以在这一点被转染。然而，当在进行电穿孔之前将细胞培养一天时，观察到增加的活力。

3.用荧光标记的miRNA进行转染

1. 预温水细胞培养基（参见步骤1.2）至37℃在水浴或等效装置中。
2. 在无RNase的无菌水中制备20μM的荧光miRNA储备溶液。
3. 制备含有90mM Na ₂ HPO 4，90mM NaH ₂ PO 4，5mM KCl，10mM MgCl ₂和10mM琥珀酸钠的电穿孔缓冲液，并将pH调节至7.2;电穿孔缓冲液可以在-20°C储存几个月。
4. 使用0.05％胰蛋白酶从培养皿中分离细胞5分钟。通过添加细胞培养基灭活胰蛋白酶。
5. 用Neubauer室血细胞计数器计数细胞，或使用等效方法。将细胞以300xg离心10分钟。
6. 将细胞重悬于电穿孔缓冲液中以获得每100μL4×10 ^5个细胞的浓度。
7. 将100μL细胞悬浮液与荧光miRNA（终浓度:0.25μM）在管中混合将混合物装入电穿孔试管。
   1. 根据细胞类型经验性地确定适当的miRNA数量。
8. 使用"G-009"程序，使用电穿孔装置进行电穿孔（参见材料表 ）。
9. 加入500μL预热后的细胞培养液，将全细胞悬浮液（4×10 ^5个细胞）转移到4孔玻璃底部载玻片的孔中。在37℃，5％CO ₂气氛中培养细胞1天。
   注意:对于FRAP分析，细胞密度为〜80％是最佳的。标记的miRNA的转染应该仅使用电穿孔进行。由于标记的miRNA分子的均匀分布对于FRAP测量是有益的，因此不推荐基于试剂的转染。

4.应用3D-FRAP显微镜（第3天）

1. 将显微镜孵化器预热至37°; C，并在FRAP测量前至少2小时开启共焦显微镜系统，建立热平衡并降低漂移的可能性。如果可能，保持5％二氧化碳气氛。
2. 将腔室载玻片插入平台样品架。
3. 使用1.4 NA油物镜（400倍放大）和561nm激光激发光在低激光功率下寻找转染的心肌细胞簇，检测范围为570-680nm。
   注意:使用显微镜专用软件（参见"材料表" ）对FRAP设置，图像采集和分析进行了定义 。
4. 激活"安装管理器"中的"z-Stack"，"时间序列"，"漂白"和"区域"按钮。
5. 定义FRAP参数。
   1. 通过设置"帧大小"来定义"采集模式"菜单中的图像采集设置4;到512×512，"行步"为1，"扫描时间"为<1秒。
   2. 在"通道"菜单中，调整激光功率，偏移和增益设置，以从最小激光激发（ 例如，激光功率:1-5％）获得最大荧光;调整以避免强度饱和。将"针孔尺寸"设置为2μm。
   3. 接下来，在"区域"菜单中，选择"ROI绘图工具"，并使用光标标记目标单元格，参考单元格和背景区域。如果需要，选择几个目标细胞进行光漂白。
   4. 调整"漂白"菜单中的漂白设置（ 例如，迭代:9-14，光漂白激光功率:100％，图像采集间隔:60秒，周期:15）。定义3次初始扫描后的漂白开始。
   5. 在"z-Stack"菜单中，根据单元格的厚度定义z-stack采集的限制。调整"数字of z层"至12 - 15。
   6. 开始FRAP实验并记录荧光恢复。
      注意:由于FRAP实验的设置取决于细胞类型，荧光染料和显微镜系统，最好进行试验性实验以确定FRAP的最佳参数。漂白应足以将初始荧光强度降低至少50％。通常，每30-60秒应记录荧光恢复，直到达到平台期。

数据分析

1. 创建所获得的z-叠层的最大投影并获得漂白的靶细胞，参考细胞和背景的荧光强度值。使用显微镜专用软件，点击"处理"→"最大强度投影"→选择文件→"应用"。
   1. 或者，使用等效图像分析工具（
2. 将所有时间点的荧光强度数据从目标单元格，背景和参考单元复制到电子表格中。
   1. 从目标单元的强度值中减去参考单元的背景强度和强度，以校正在采集过程中产生的漂白。对每个时间点执行背景和参考单元校正。
   2. 通过将每个值除以初始荧光，将校正的FRAP数据归一化为漂白前的初始荧光强度。
   3. 为了获得FRAP曲线，通过从每个时间点的强度值中减去，将基线设置为漂白后立即的荧光强度。

结果

在这里，我们提出3D-FRAP显微镜作为非侵入性技术研究新生儿心肌细胞荧光miRNA间隙连接穿梭。分离的心肌细胞显示典型的条纹α-肌动蛋白模式，并且沿着细胞 - 细胞边界包含大量的Cx43斑块（ 图1A ，白色箭头），这允许分子的高细胞间通量。通过显微定量α-肌动蛋白阳性细胞评估分离的心肌细胞的纯度。虽然培养物中存在一些非心肌细胞（α-肌动蛋?...

讨论

miRNA是细胞生理学中的关键参与者，并被证明通过使用G_s作为细胞间交换途径，作为信号分子11,12,22。目前的方案提出体外活细胞成像技术来表征使用荧光miRNA在细胞簇内的GJ依赖性穿梭。

该方案作为细胞模型系统在心肌细胞上开发。然而，如果电穿孔是miRNA转染的合适方法，则该方法可以应用于几种细胞类型。除了细胞间细胞交换，所提出的技术也适用于研究miRNA?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
neonatal NMRI mice	Charles River
Gelatin	Sigma Aldrich	G7041	0.1% solution in PBS, sterilized
PBS	Pan Biotech	P04-53500
Dulbecco´s modified medium	Pan Biotech	P04-03550
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum	Pan Biotech	P30-3306
Cell culture plastic	TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Fisher Scientific	88281
HBSS	Thermo Fisher Scientific	88281	included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic	Dharmacon	CP-004500-01-05	dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S3139
Sodium phosphate dibasic	Carl Roth	T877.2
Potassium chloride	Sigma	P9333
Magnesium chloride	Serva	28305.01
Sodium succinate	Carl Roth	3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution	Merck	L2153
4-well- Glass bottom chamber slides	IBIDI	80827	coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II	Lonza		program G-009 was used for Electroporation
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Excel software	Microsoft
α-actinin antibody	Abcam	ab9465	dilution 1:200
Connexin43 antibody	Santa Cruz	sc-9059	dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11005	dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034	dilution 1:300
Connexin43 siRNA	Thermo Fisher Scientific	AM16708 ID158724	final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
CellTrace Calcein Red-Orange	Thermo Scientific	C34851
DAPI nuclear stain	Thermo Scientific	D1306