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요약

여기, 우리는 miRNA의 갭 접합 종속 셔틀 (gap junction-dependent shuttling) 분석을위한 광 표백 (photobleaching) 후 3 차원 형광 복구 (3D-FRAP)의 응용을 기술한다. 일반적으로 적용되는 방법과는 달리, 3D-FRAP은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 작은 RNA의 세포 간 전달을 정량화합니다.

초록

miRNA 및 siRNA와 같은 작은 안티센스 RNA는 세포 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을하며, 또한 여러 질병의 치료에서 치료제로 사용될 수 있습니다. miRNA / siRNA 치료를위한 새롭고 혁신적인 전략의 개발은 근본적인 메커니즘에 대한 광범위한 지식을 기반으로합니다. 최근의 데이터는 작은 RNA가 갭 접합부 (gap junction-dependent) 방식으로 세포들 사이에서 교환 됨으로써 수용 세포에서 유전자 조절 효과를 유도 함을 시사한다. 분자 생물학적 기법과 유동 세포 계측 분석은 일반적으로 miRNA의 세포 간 교환을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나, 이러한 방법은 높은 시간 해상도를 제공하지 못하며, 이것은 분자의 갭 접합 플럭스를 연구 할 때 필요하다. 따라서 miRNA / siRNA가 세포 간 신호 전달 분자로서의 영향을 조사하기 위해서는 이러한 작은 RNA를 세포 수준에서 분석 할 수있는 새로운 도구가 필요합니다. 현재의 프로토콜은 ap(3 차원 - FRAP) 현미경 검사 후 3 차원 형광 복구의 plication은 심장 세포 사이의 갭 접합 - 의존적 인 miRNA 분자의 교환을 해명합니다. 중요한 것은,이 간단하고 비 침습적 인 라이브 셀 이미징 접근 방식은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 형광 표지 된 작은 RNA의 갭 접합 셔틀 링의 시각화 및 정량화를 허용합니다. 3D-FRAP에서 얻은 데이터는 작은 RNA가 세포 간 네트워크 내에서 신호 분자로 작용하는 세포 간 유전자 조절의 새로운 경로를 확인합니다.

서문

작은 noncoding RNA는 세포 유전자 조절에서 중요한 역할을합니다. 이 분자는 특정 표적 mRNA에 결합하는 20-25 개의 뉴클레오타이드로 이루어져 번역의 막힘 또는 mRNA 분해 1 또는 2를 유도합니다. miRNA와 siRNA와 같은 작은 RNA에 의해 수행되는 유전자 조절 과정은 많은 다른 종에서 발견 된 매우 보전 된 메커니즘입니다 3 . 특히, miRNA 분자는 증식, 분화 및 재생을 포함한 다양한 생리적 과정에 매우 중요합니다. 또한, miRNA 발현의 조절 장애는 많은 병리학 적 장애로 인한 것입니다. 그에 상응하여, miRNA는 진단을위한 바이오 마커 및 유전자 요법을위한 치료제로서 적합하다는 것이 입증되었습니다 6 , 7 .

GJ는 분자량이 1kD 인 분자를 확산 교환 할 수있는 인접한 두 세포의 원형질막에 특화된 단백질 구조입니다. 그들은 조직 발달, 분화, 세포 사멸, 암이나 심혈관 질환과 같은 병리학 적 장애에 중요한 것으로 밝혀졌습니다 8 , 9 , 10 . 여러 분자가 이온, 대사 산물 및 뉴클레오타이드를 포함하여 GJ 채널을 통과 할 수 있다고 기술되어 왔습니다. 흥미롭게도 GJ는 작은 RNA 11,12 의 세포 간 이동을위한 경로를 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, miRNAs는 생산 된 세포 내에서뿐만 아니라 수용 세포 내에서 작용할 수 있습니다. 이것은 세포 간 신호 전달 시스템에서 miRNA의 역할을 강조합니다. 동시에, 데이터는그 gap junctional intercellular communication은 miRNA 기능과 밀접하게 연관되어있다. 조직 항상성, 병리학 및 진단에 대한 miRNA 및 GJ의 중요한 영향으로 인해 GJ의 기능과 miRNA의 관련 세포 간 역학에 대한 포괄적 인 이해는 miRNA 기반 질병의 메커니즘을 명확히하고 새로운 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. miRNA 치료법.

gap junctional coupling의 정도에 따라 세포 간 miRNA 분자의 이동은 매우 신속한 과정이 될 수 있습니다. 따라서, 이들 조절 신호 분자의 빠른 세포 간 이동의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 방법론이 요구된다. 일반적으로 작은 RNA 11 , 12 , 13 , 14 의 왕복을 입증하기 위해 유동 세포 계측법과 분자 생물학적 기술이 적용되었습니다. 그러나 FRAP 마이크로와는 달리이러한 접근법은 GJ를 통한 miRNA 교환을 분석 할 때 높은 시간 해상도가 필요하지 않습니다. 더욱이 FRAP 현미경 검사법은 덜 침습적이므로 여러 세포 유형에서 GJ에 의존하는 분자의 교환을 평가하는 강력하고 새로운 생체 ​​영상 기술입니다 15 , 16 , 17 .

여기, 우리는 cardiomyocytes 사이에 miRNA 셔틀을 평가하는 3D - FRAP의 응용 프로그램을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시한다. 이 목적을 위해, 형광성으로 표지 된 miRNA로 심근 세포를 형질 감염시켰다. 이 miRNA로 표시된 세포는 광 표백되었고, 인접한 세포로부터 다시 유입되는 gap junctional miRNA는 시간 의존적으로 기록되었다. FRAP 실험의 높은 시간 해상도는 살아있는 세포 사이의 miRNA 및 siRNA의 세포 간 전달을 정확하게 평가하기위한 운동 연구를 수행 할 수있는 가능성을 제공합니다. 모레 오ver., 작은 RNA는 매우 다른 동력학을 가진 다른 메커니즘을 통해 교환 될 수 있기 때문에, FRAP 현미경 검사는 GJ가 각각의 왕복 운동 과정에 얼마나 관여 하는지를 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 3D-FRAP은 GJ 투과성의 생리 학적 및 병리학 적 변화와 작은 RNA 전이에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 15 , 19 .

프로토콜

신생아 생쥐가 관련된이 프로토콜의 모든 단계는 Rostock University Medical Center의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 세포 배양 용 접시의 준비 및 심근 세포 배양 용 배지

  1. PBS에서 0.1 % 젤라틴으로 세포 배양 플레이트를 코팅하고 37 ° C에서 4 시간 또는 4 ° C 밤새 인큐베이션하십시오. 젤라틴을 제거하고 멸균 층류 공기 흐름 하에서 건조 시키십시오.
  2. 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)가 보충 된 DMEM 50 ML로 구성된 세포 배양 배지를 준비합니다. 37 ° C로 예열하십시오.

2. 신생아 심근 세포의 분리

  1. 멸균 가위로 목을 베고 신생아 생쥐 (1 ~ 2 일 된)를 희생시키고 흉골을 따라 가슴을 엽니 다. 포어를 사용하여 가슴을 약간 제거하면서 가슴을 제거하고 심장을 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 24-well plate에 옮긴다.(Ca 2+ 및 Mg 2+ 없이).
  2. 살균 포셉을 사용하여 비 심장 조직 및 큰 혈관을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 1.5 ML 튜브로 청소 마음을 전송하십시오. 효소 소화에는 튜브 당 최대 5 개의 하트를 사용하십시오.
  3. 작은 가위로 가슴을 0.5-1mm³ 이하로 말하십시오.
  4. 다량의 심장을 HBSS로 2 회 씻어 낸다. 1 mL microliter 피펫을 사용하여 HBSS를 흡입 / 첨가한다. 효소를 첨가하기 전에 HBSS를 완전히 제거하십시오.
  5. 신생아 심장의 효소 소화를 위해서는 시중에서 구입할 수있는 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜 ( Table of Materials 참조)을 따르십시오. 35 분 동안 37 ° C에서 효소와 함께 잠복하면서 매 5 분마다 다진 하트가 담긴 튜브를 흔든다.
  6. 비 - cardiomyocyte 분수의 준수를 허용 1.5-2 시간 세포 배양 배지를 포함하는 비 코팅 세포 배양 접시에 종자 세포를 중단. 높은 순도라면이 단계를 반복하십시오.의 심근 세포가 필요합니다. 원하는 경우, 비 - cardiomyocyte 분수를 추가로 배양하십시오.
    참고 : 15 하트의 세포 현탁액의 경우, 75 cm² 세포 배양 플라스크에서 사전 도금 단계를 수행 할 수 있습니다. 일반적으로 한 신생아 심장에서 ~ 5 x 10 5 세포를 얻습니다.
  7. 300 x g에서 10 분간 15 mL 원추형 튜브와 원심 분리기에서 뜨는 물을 수집합니다. 세포 배양 매체 1 ML에 세포를 Resuspend.
  8. Neubauer 챔버 hemocytometer로 세포를 계산하거나, 동등한 방법을 사용하십시오.
  9. 플레이트는 3 x 10 5 cells / cm²의 밀도를 지닌 6- 웰 플레이트상의 분리 된 심근 세포를 분리 하였다. 37 밤새 세포를 품어 ° C 5 % CO 2 .
    참고 : 선택적으로이 시점에서 세포를 트랜 스펙 션 할 수도 있습니다. 그러나 일주일 동안 배양 한 후 일렉트로 포 레이션 (electroporation)을 실시 할 때 증가 된 생존력이 관찰되었다.

3. Fluorescently Labeled miRNA를 사용한 형질 감염

  1. 사전 -따뜻한 세포 배양 배지 (단계 1.2 참조)를 수 욕조 또는 이와 동등한 장치에서 37 ° C로 가열합니다.
  2. RNase가없는 멸균 수에서 형광성 miRNA의 20 μM 축적 용액을 준비하십시오.
  3. 90 MM Na 2 HPO 4 , 90 MM NaH 2 PO 4 , 5 MM KCl, 10 MM MgCl 2 및 10 MM sodium succinate가 들어있는 일렉트로 포 레이션 버퍼를 준비하고 7.2로 pH를 조절하십시오. electroporation 버퍼는 -20 ° C에서 몇 개월 동안 저장할 수 있습니다.
  4. 5 분 0.05 % 트립신을 사용하여 문화 요리에서 세포를 분리하십시오. 세포 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화시킨다.
  5. Neubauer 챔버 hemocytometer로 세포를 계산하거나, 동등한 방법을 사용하십시오. 10 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기.
  6. 100 μL 당 4 X 10 5 세포의 농도를 얻기 위해 일렉트로 포 레이션 버퍼에 세포를 Resuspend.
  7. 튜브에 형광 miRNA (최종 농도 : 0.25 μm의)와 세포 현탁액의 100 μL를 혼합하고혼합물을 전기 천공 큐벳에 넣는다.
    1. 세포 유형에 따라 적절한 양의 miRNA를 경험적으로 결정하십시오.
  8. "G - 009"프로그램을 사용하여 일렉트로 포 레이션 장치 (물질 표 참조)를 사용하여 일렉트로 포 레이션을 수행하십시오.
  9. 사전 예열 세포 배양 매체 500 μL를 추가하고 4 - 웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 우물에 전체 세포 현탁액 (4 X 10 5 세포)을 전송합니다. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 하루 동안 세포를 배양하십시오.
    참고 : FRAP 분석의 경우 ~ 80 %의 셀 밀도가 최적입니다. 분류 된 miRNA의 transfection은 electroporation을 사용하여 독점적으로 수행해야합니다. 분류 된 miRNA 분자의 균질 한 분포가 FRAP 측정에 유리하므로, 시약 기반 형질 감염은 권장하지 않습니다.

4. 3D-FRAP 현미경 검사 (3 일) 적용

  1. 현미경 배양기를 37 °로 예열하십시오.C와 열 평형을 확립하고 표류의 가능성을 줄이기 위해 FRAP 측정 전에 적어도 2 시간 공 촛점 현미경 시스템을 전환합니다. 가능하면 5 % CO2 대기를 유지하십시오.
  2. 스테이지 슬라이드 홀더에 챔버 슬라이드를 삽입합니다.
  3. 1.4 NA 오일 대물 렌즈 (400 배율)와 낮은 레이저 출력에서 ​​561 nm의 레이저 여기 광을 사용하여 570-680 nm의 검출 범위로 트랜 스펙 션 된 심근 세포의 클러스터를 찾으십시오.
    참고 : FRAP 설정, 이미지 획득 및 분석의 정의는 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다 ( 재료 표 참조).
  4. "Setup Manager"에서 "z-Stack", "Time Series", "Bleaching"및 "Regions"버튼을 활성화하십시오.
  5. FRAP 매개 변수를 정의하십시오.
    1. "획득 모드"메뉴에서 "프레임 크기"를 설정하여 이미지 획득 설정을 정의하십시오4; 512 x 512, "라인 단계"를 1로, "스캔 시간"을 1 초 미만으로 설정하십시오.
    2. "Channels"메뉴에서 레이저 파워, 오프셋 및 게인 설정을 조정하여 최소 레이저 여기에서 최대 형광을 얻습니다 ( 예 : 레이저 출력 : 1-5 %). 강도 채도를 피하기 위해 조정하십시오. "핀홀 크기"를 2 μm로 설정하십시오.
    3. 다음으로 "Regions"메뉴에서 "ROI drawing tool"을 선택하고 커서를 사용하여 대상 셀, 참조 셀 및 배경 영역을 표시합니다. 필요한 경우, 표백을 위해 여러 표적 세포를 선택하십시오.
    4. "표백"메뉴 ( 예 : 반복 : 9-14, 광 표백을위한 레이저 출력 : 100 %, 이미지 획득 간격 : 60 초,주기 : 15)에서 표백 설정을 조정하십시오. 3 회 초기 스캔 후 표백 시작을 정의하십시오.
    5. "z-Stack"메뉴에서 셀의 두께에 따라 Z- 스택 획득을위한 한계를 정의하십시오. "숫자 o 조정f z-layers "를 12 - 15로 설정합니다.
    6. FRAP 실험을 시작하고 형광 복구를 기록합니다.
      참고 : FRAP 실험의 설정은 세포 유형, 형광 염료 및 현미경 시스템에 따라 다르므로 파일럿 실험을 수행하여 FRAP에 대한 최적 매개 변수를 결정하는 것이 가장 좋습니다. 표백은 초기 형광 강도를 50 % 이상 줄이는 데 충분해야합니다. 일반적으로 형광 복구는 고원 단계에 도달 할 때까지 30-60 초마다 기록해야합니다.

5. 데이터 분석

  1. 획득 한 z- 스택의 최대 투사를 생성하고 표백 된 표적 세포, 참조 세포 및 배경의 형광 강도 값을 얻습니다. 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 "Processing"→ "Maximum intensity projection"→ 파일 선택 → "Apply"를 클릭하십시오.
    1. 또는, 동급 이미지 분석 도구 (
  2. 대상 세포, 배경 및 참조 세포의 모든 시점에서 형광 강도 데이터를 스프레드 시트에 복사합니다.
    1. 획득 과정에서 발생한 photobleaching을 수정하기 위해 대상 세포의 강도 값에서 참조 셀의 배경 강도와 강도를 뺍니다. 각 시점에 대한 배경 및 기준 셀 보정을 수행하십시오.
    2. 표백 전 초기 형광 강도로 각 값을 나눔으로써 보정 된 FRAP 데이터를 초기 형광 강도로 표준화하십시오.
    3. FRAP 곡선을 얻으려면 각 시점의 강도 값에서 빼서 표백 직후의 형광 강도로 기준선을 설정하십시오.

결과

여기, 신생아 cardiomyocytes 이내 형광 miRNA의 간격 junctional 셔틀을 연구 비 침습적 인 기술로 3D - FRAP 현미경을 제시합니다. 분리 된 심근 세포는 전형적으로 흘린 α- 액티 닌 패턴을 나타내었고, 세포 간 경계 ( 그림 1A , 흰 화살촉)를 따라 Cx43의 큰 플라크를 포함하여 분자간의 높은 세포 간 플럭스를 허용했다. 단리 된 심근 세포의 순도는 α-actinin 양성 ?...

토론

miRNA는 세포 생리학에서 중요한 역할을 담당하며, 다른 것들 중에서도 GJ를 세포 간 교환을위한 경로 11 , 12 , 22 로 사용함으로써 신호 분자로 작용하는 것으로 나타났습니다. 현재 프로토콜 세포 클러스터 내에서 형광 miRNAs를 사용 하여이 GJ 의존 shuttling을 특성화 하는 체외 라이브 셀 이미징 기술을 제공합니다.

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공개

저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 연방 교육 연구부 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), 유럽 연합 구조 기금 (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 및 ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) 및 독일 심장 재단 (F / 01 / 12). 또한 RD는 Rostock University Medical Center (889001)의 FORUN 프로그램, DAMP Foundation 및 BMBF (VIP + 00240)의 지원을받습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
neonatal NMRI miceCharles River
GelatinSigma AldrichG70410.1% solution in PBS, sterilized
PBSPan BiotechP04-53500
Dulbecco´s modified mediumPan BiotechP04-03550
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serumPan BiotechP30-3306
Cell culture plasticTPP
Primary Cardiomyocyte Isolation KitThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blueThermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA MimicDharmaconCP-004500-01-05dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasicSigmaS3139
Sodium phosphate dibasicCarl RothT877.2
Potassium chlorideSigmaP9333
Magnesium chlorideServa28305.01
Sodium succinateCarl Roth3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solutionMerckL2153
4-well- Glass bottom chamber slidesIBIDI80827coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector IILonzaprogram G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 systemZeiss
Excel softwareMicrosoft
α-actinin antibodyAbcamab9465dilution 1:200
Connexin43 antibodySanta Cruzsc-9059dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibodyThermo Fisher ScientificA-11005dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibodyThermo Fisher ScientificA-11034dilution 1:300
Connexin43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
DAPI nuclear stainThermo ScientificD1306

참고문헌

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