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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous décrivons l'application de la récupération de fluorescence tridimensionnelle après photoblanchage (3D-FRAP) pour l'analyse de la permutation dépendant de la jonction de miRNA. Contrairement aux méthodes couramment appliquées, 3D-FRAP permet de quantifier le transfert intercellulaire de petits ARN en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Résumé

Les petits ARN antisens, comme le miARN et l'ARNi, jouent un rôle important dans la physiologie et la pathologie cellulaires et, en outre, peuvent être utilisés comme agents thérapeutiques dans le traitement de plusieurs maladies. Le développement de nouvelles stratégies novatrices pour la thérapie miRNA / siRNA repose sur une connaissance approfondie des mécanismes sous-jacents. Les données récentes suggèrent que les petits ARN sont échangés entre les cellules d'une manière dépendant de la jonction, ce qui induit des effets de régulation des gènes dans la cellule destinataire. Les techniques biologiques moléculaires et l'analyse cytométrique en flux sont couramment utilisées pour étudier l'échange intercellulaire du miARN. Cependant, ces méthodes ne fournissent pas une résolution temporelle élevée, ce qui est nécessaire lors de l'étude du flux de jonction entre les molécules. Par conséquent, pour étudier l'impact du miRNA / siRNA en tant que molécules de signalisation intercellulaire, de nouveaux outils sont nécessaires pour permettre l'analyse de ces petits ARN au niveau cellulaire. Le présent protocole décrit l'apPlication de la récupération de fluorescence tridimensionnelle après microscopie de photoblanchissement (3D-FRAP) pour élucider l'échange de molécules d'ARNm entre les cellules cardiaques. Il est important de noter que cette approche directe et non invasive d'imagerie en cellule vive permet de visualiser et de quantifier le passage à genoux jumelé de petits ARN marqués par fluorescence en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle élevée. Les données obtenues par 3D-FRAP confirment une nouvelle voie de régulation des gènes intercellulaires, où les petits ARN agissent comme des molécules de signalisation dans le réseau intercellulaire.

Introduction

Les petits ARN non codants sont des acteurs importants de la régulation des gènes cellulaires. Ces molécules sont composées de 20 à 25 nucleotides qui se lient à un ARNm cible spécifique, conduisant au blocage de la traduction ou à la dégradation 1 de l'ARNm. Le processus de réglementation des gènes entrepris par les petits ARN, tels que le miARN et l'ARNi, est un mécanisme hautement conservé qui a été trouvé dans de nombreuses espèces différentes 3 . En particulier, les molécules d'ARNm sont d'une importance cruciale pour une variété de processus physiologiques, y compris la prolifération, la différenciation et la régénération 4 , 5 . En outre, la dérégulation de l'expression de l'ARNm est attribuée à de nombreux troubles pathologiques. De manière correspondante, les ARNm ont été démontrés comme appropriés comme biomarqueurs pour le diagnostic et comme agents thérapeutiques pour la thérapie génique 6 , 7 .

Les jonctions d'écart (GJ) sont des structures de protéines spécialisées dans la membrane plasmique de deux cellules adjacentes qui permettent l'échange diffusaire de molécules avec un poids moléculaire allant jusqu'à 1 kD. Ils ont montré qu'ils étaient importants pour le développement tissulaire, la différenciation, la mort cellulaire et les troubles pathologiques tels que le cancer ou les maladies cardiovasculaires 8 , 9 , 10 . Plusieurs molécules ont été décrites comme étant capables de traverser les canaux GJ, y compris les ions, les métabolites et les nucléotides. Fait intéressant, les GJ ont également été trouvés pour fournir une voie pour le mouvement intercellulaire des petits ARN 11 , 12 . Ainsi, les miARN peuvent agir non seulement dans la cellule dans laquelle ils sont produits, mais aussi dans les cellules destinataires. Cela met en évidence le rôle des miARN dans le système de transduction du signal intercellulaire. Dans le même temps, les données démontrentCette communication intercellulaire de jonction gap est étroitement liée à la fonction miARN. En raison de l'impact significatif du miRNA et des GJ sur l'homéostasie des tissus, la pathologie et le diagnostic, une compréhension globale de la fonction des GJ et de la dynamique interellulaire associée au miARN aidera à clarifier les mécanismes des maladies à base de miARN et à développer de nouvelles stratégies pour Thérapies de l'ARNm.

Selon l'étendue du couplage jonctionnaire, le transfert de molécules d'ARNm entre les cellules peut être un processus très rapide. Par conséquent, une méthodologie permettant la visualisation et la quantification du mouvement intercelulaire rapide de ces molécules de signalisation réglementaire est nécessaire. Généralement, la cytométrie de flux et les techniques de biologie moléculaire ont été appliquées pour démontrer le déplacement des petits ARN 11 , 12 , 13 , 14 . Cependant, par opposition aux micros FRAPCopie, ces approches manquent d'une résolution temporelle élevée, ce qui est obligatoire lors de l'analyse de l'échange de miRNA via GJs. En outre, la microscopie FRAP est moins invasive et représente donc une puissante et nouvelle technique d'imagerie des cellules vivantes pour évaluer l'échange de molécules dépendantes de GJ dans plusieurs types de cellules 15 , 16 , 17 .

Ici, nous présentons un protocole détaillé décrivant l'application de 3D-FRAP pour évaluer le transfert de miARN entre les cardiomyocytes. À cette fin, les cardiomyocytes ont été transfectés avec un miARN marqué par fluorescence. Une cellule marquée par ce miARN a été photoblanchée, et le réintroduction de miARN par jonction entre les cellules adjacentes a été enregistrée de manière dépendant du temps. La résolution temporelle élevée des expériences FRAP offre la possibilité d'effectuer des études cinétiques pour l'évaluation précise du transfert intercellulaire de miARN et d'ARNi entre les cellules vivantes. MoreoEn effet, comme les petits ARN peuvent être échangés via différents mécanismes avec une cinétique très différente, la microscopie FRAP peut aider à préciser dans quelle mesure les GJ sont impliqués dans les processus respectifs de navette 18 . En outre, 3D-FRAP peut être utilisé pour étudier les altérations physiologiques et pathologiques de la perméabilité GJ et son impact sur le transfert d'un petit ARN 15 , 19 .

Protocole

Toutes les étapes de ce protocole impliquant des souris néonatales ont été effectuées selon les directives éthiques pour les soins des animaux du Centre médical de l'Université de Rostock.

1. Préparation des plats de culture cellulaire et du milieu pour la culture des cardiomyocytes

  1. Revêtir une plaque de culture cellulaire avec 0,1% de gélatine dans du PBS et incuber à 37 ° C pendant 4 h ou à 4 ° C pendant une nuit. Retirez la gélatine et laissez-la sécher sous un flux d'air laminaire stérile.
  2. Préparer un milieu de culture cellulaire composé de 50 mL de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S). Préchauffer à 37 ° C.

2. Isolation des cardiomyocytes néonatals

  1. Sacrifiez les souris néonatales (1-2 jours) par décapitation avec des ciseaux stériles et ouvrez la poitrine le long du sternum. Retirez le cœur en utilisant une pince tout en appuyant légèrement sur le thorax ensemble et transférez le coeur dans une plaque de 24 puits contenant HBSS glacé(Sans Ca 2 + et Mg 2+ ).
  2. Enlever les tissus non cardiaques et les vaisseaux plus grands en utilisant des pinces stériles. Transférer les coeurs nettoyés dans un tube de 1,5 ml contenant de l'HBSS glacé. Utiliser un maximum de 5 coeurs par tube pour la digestion enzymatique.
  3. Pique les cœurs avec de petits ciseaux en <0,5 à 1 mm³ de morceaux.
  4. Laver les coeurs hachés avec HBSS deux fois par aspiration / addition de HBSS en utilisant une pipette à 1 mL de microlitres. Retirez complètement le HBSS avant d'ajouter les enzymes.
  5. Pour la digestion enzymatique des coeurs néonataux, utilisez un kit disponible dans le commerce et suivez le protocole du fabricant (voir la Table des matières ). Secouez le tube contenant les cœurs hachés toutes les 5 minutes tout en incubant avec des enzymes à 37 ° C pendant 35 minutes.
  6. Cellules suspendues à base de graines sur des boîtes de culture cellulaire non revêtues contenant un milieu de culture cellulaire pendant 1,5-2 h pour permettre l'adhérence de la fraction non cardiomyocytaire. Répétez cette étape si une pureté élevéeDes cardiomyocytes est nécessaire. Si désiré, développez davantage la fraction non cardiomyocytaire.
    NOTE: Pour une suspension cellulaire de 15 coeurs, l'étape de pré-plaquage peut être effectuée sur des flacons de culture cellulaire de 75 cm². Généralement, ~ 5 x 10 5 cellules sont obtenues à partir d'un cœur néonatal.
  7. Recueillir le surnageant dans un tube conique de 15 ml et centrifuger pendant 10 min à 300 x g. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture cellulaire.
  8. Compter les cellules avec un hémocytomètre de la chambre Neubauer, ou utiliser une méthode équivalente.
  9. Cardiomyocytes isolés en plaques sur des plaques à 6 puits avec une densité de 3 x 10 5 cellules / cm². Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2 .
    REMARQUE: optionnellement, les cellules peuvent également être transfectées à ce stade. Cependant, une viabilité accrue a été observée lorsque les cellules ont été cultivées pendant un jour avant d'être soumises à une électroporation.

3. Transfection avec microARN marqué par fluorescence

  1. Pré-Milieu de culture de cellules chaudes (voir étape 1.2) à 37 ° C dans un bain d'eau ou un dispositif équivalent.
  2. Préparez une solution mère 20 μM de miARN fluorescent dans de l'eau stérile sans RNase.
  3. Préparer un tampon d'électroporation contenant 90 mM de Na 2 HPO 4 , 90 mM de NaH 2 PO 4 , 5 mM de KCl, 10 mM de MgCl 2 et 10 mM de succinate de sodium et ajuster le pH à 7,2; Le tampon d'électroporation peut être stocké à -20 ° C pendant plusieurs mois.
  4. Détachez les cellules du plat de culture en utilisant 0,05% de trypsine pendant 5 min. Inactive la trypsine en ajoutant un milieu de culture cellulaire.
  5. Compter les cellules avec un hémocytomètre de la chambre Neubauer, ou utiliser une méthode équivalente. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min.
  6. Remettre en suspension les cellules dans un tampon d'électroporation pour obtenir une concentration de 4 x 10 5 cellules par 100 μL.
  7. Mélanger 100 μL de suspension cellulaire avec miARN fluorescent (concentration finale: 0,25 μM) dans un tube etCharger le mélange dans une cuvette à électroporation.
    1. Déterminer de façon empirique la quantité appropriée de miRNA, selon le type de cellule.
  8. Effectuer l'électroporation à l'aide d'un dispositif d'électroporation (voir la Table des matériaux ), en utilisant le programme "G-009".
  9. Ajouter 500 μL de milieu de culture cellulaire préchauffé et transférer la suspension de cellules entières (4 x 10 5 cellules) dans un puits d'une glissière à chambre à fond de verre à 4 puits. Culturez les cellules pendant 1 jour à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%.
    NOTE: Pour l'analyse FRAP, une densité cellulaire de ~ 80% est optimale. La transfection de l'ARNm marqué doit être exclusivement réalisée par électroporation. Étant donné que la distribution homogène des molécules d'ARNm marquées est bénéfique pour la mesure du FRAP, la transfection à base de réactif n'est pas recommandée.

4. Application de la microscopie 3D-FRAP (jour 3)

  1. Réchauffer l'incubateur au microscope à 37 °; C et allumer le système de microscope confocal au moins 2 h avant la mesure FRAP pour établir un équilibre thermique et diminuer la possibilité de dérive. Si possible, maintenir une atmosphère de CO 2 de 5%.
  2. Insérez la chambre dans le porte-échantillon de l'étape.
  3. Trouver un groupe de cardiomyocytes transfectés en utilisant un objectif d'huile 1.4 NA (grossissement 400X) et une lumière d'excitation laser de 561 nm à faible puissance laser, avec une plage de détection de 570 à 680 nm.
    REMARQUE: la définition des paramètres FRAP, l'acquisition de l'image et l'analyse ont été effectuées à l'aide d'un logiciel spécifique au microscope (voir la Table des matières ).
  4. Activez les boutons "z-Stack", "Time Series", "Blanchiment" et "Régions" dans le "Setup Manager".
  5. Définissez les paramètres FRAP.
    1. Définissez les paramètres d'acquisition d'image dans le menu "Mode d'acquisition" en définissant le "format d'image"4; À 512 x 512, le "pas de ligne" à 1, et le "temps de balayage" à <1 s.
    2. Dans le menu "Chaînes", ajustez les paramètres de puissance, de décalage et de gain du laser pour obtenir une fluorescence maximale à partir d'une excitation laser minimale ( p. Ex., Puissance laser: 1-5%); Ajuster pour éviter la saturation d'intensité. Réglez la "taille d'épingle" à 2 μm.
    3. Ensuite, dans le menu "Régions", sélectionnez le "outil de dessin ROI" et utilisez le curseur pour marquer la cellule cible, la cellule de référence et la zone d'arrière-plan. Si nécessaire, sélectionnez plusieurs cellules cibles pour photoblanchage.
    4. Ajustez les paramètres de photoblanchissement dans le menu "Blanchiment" ( p. Ex., Itérations: 9-14 , alimentation laser pour photoblanchage: 100%, intervalle d'acquisition d'image: 60 s, cycles: 15). Définir le début du blanchiment après 3 scans initiaux.
    5. Dans le menu "z-Stack", définissez les limites pour l'acquisition de la pile z, en fonction de l'épaisseur des cellules. Ajustez le "numéro oF z-layers "à 12-15.
    6. Démarrez l'expérience FRAP et enregistrez la récupération de fluorescence.
      REMARQUE: Étant donné que les paramètres d'une expérience FRAP dépendent du type de cellule, du colorant fluorescent et du système de microscope, il est préférable d'effectuer des expériences pilotes pour déterminer les paramètres optimaux pour FRAP. Le blanchiment doit être suffisant pour réduire l'intensité de fluorescence initiale d'au moins 50%. Généralement, la récupération de fluorescence doit être enregistrée toutes les 30 à 60 s jusqu'à ce que la phase du plateau soit atteinte.

5. Analyse des données

  1. Créez des projections maximales des piles z acquises et obtenez des valeurs d'intensité de fluorescence des cellules cibles blanchies, de la cellule de référence et de l'arrière-plan. En utilisant un logiciel spécifique au microscope, cliquez sur "Traitement" → "Projection d'intensité maximale" → sélectionnez le fichier → "Appliquer".
    1. Alternativement, utilisez un outil d'analyse d'image équivalent ( par exemple, ImageJ).
  2. Copiez les données d'intensité de fluorescence à tous les points de temps de la cellule cible, de l'arrière-plan et de la cellule de référence dans une feuille de calcul.
    1. Soustraire l'intensité de fond et l'intensité de la cellule de référence des valeurs d'intensité de la cellule cible pour corriger le photoblanchage provoqué lors du processus d'acquisition. Effectuez des corrections de base et de cellule de référence pour chaque point de temps.
    2. Normaliser les données FRAP corrigées à l'intensité de fluorescence initiale avant le blanchiment en divisant chaque valeur par la fluorescence initiale.
    3. Pour obtenir des courbes de FRAP, réglez la ligne de base à l'intensité de fluorescence immédiatement après l'eau de Javel en soustrayant les valeurs d'intensité de chaque point de temps.

Résultats

Ici, nous présentons la microscopie 3D-FRAP comme une technique non-invasive pour étudier la liaison de jonction entre le miRNA fluorescent dans les cardiomyocytes néonatals. Les cardiomyocytes isolés ont révélé le schéma typique de l'α-actinine striée et contenaient de grandes plaques de Cx43 le long des frontières des cellules ( figure 1A , pointes de flèches blanches), ce qui a permis le flux intercellulaire élevé des molécules. La pure...

Discussion

Les miARN sont des acteurs clés de la physiologie cellulaire et ont été considérés comme des molécules de signalisation en utilisant entre autres les GJ comme voie d'échange intercellulaire 11 , 12 , 22 . Le protocole actuel présente une technique in vitro d'imagerie par cellule vivante pour caractériser ce transfert GJ-dependant en utilisant des ARNm fluorescents dans des grappes de cellules.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral de l'Education et de la Recherche Allemagne (FKZ 0312138A et FKZ 316159), l'État Mecklembourg-Poméranie occidentale avec les Fonds structurels de l'UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 et ESF / IVBM-B35-0010 / 12), le DFG (DA1296-1) et la Fondation allemande des cœurs (F / 01/12). En outre, RD est soutenu par le programme FORUN du Centre Médical de l'Université Rostock (889001), la Fondation DAMP et le BMBF (VIP + 00240).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
neonatal NMRI miceCharles River
GelatinSigma AldrichG70410.1% solution in PBS, sterilized
PBSPan BiotechP04-53500
Dulbecco´s modified mediumPan BiotechP04-03550
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serumPan BiotechP30-3306
Cell culture plasticTPP
Primary Cardiomyocyte Isolation KitThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blueThermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA MimicDharmaconCP-004500-01-05dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasicSigmaS3139
Sodium phosphate dibasicCarl RothT877.2
Potassium chlorideSigmaP9333
Magnesium chlorideServa28305.01
Sodium succinateCarl Roth3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solutionMerckL2153
4-well- Glass bottom chamber slidesIBIDI80827coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector IILonzaprogram G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 systemZeiss
Excel softwareMicrosoft
α-actinin antibodyAbcamab9465dilution 1:200
Connexin43 antibodySanta Cruzsc-9059dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibodyThermo Fisher ScientificA-11005dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibodyThermo Fisher ScientificA-11034dilution 1:300
Connexin43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
DAPI nuclear stainThermo ScientificD1306

Références

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