Análisis de la transferencia dependiente de la unión Gap de miARN con 3D-FRAP Microscopía

Resumen

Aquí, describimos la aplicación de la recuperación de fluorescencia tridimensional después de fotoblanqueo (3D-FRAP) para el análisis de la separación gap dependiente de la transferencia de miARN. En contraste con los métodos comúnmente aplicados, 3D-FRAP permite la cuantificación de la transferencia intercelular de ARN pequeños en tiempo real, con alta resolución espacio-temporal.

Resumen

Pequeños ARNs antisentido, como el miARN y el siRNA, juegan un papel importante en la fisiología y patología celular y, además, pueden ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento de varias enfermedades. El desarrollo de nuevas e innovadoras estrategias para miARN / siRNA terapia se basa en un amplio conocimiento de los mecanismos subyacentes. Los datos recientes sugieren que los ARN pequeños se intercambian entre las células en una forma dependiente de la unión de vacíos, induciendo así los efectos reguladores de los genes en la célula receptora. Las técnicas biológicas moleculares y el análisis de citometría de flujo se usan comúnmente para estudiar el intercambio intercelular de miARN. Sin embargo, estos métodos no proporcionan una alta resolución temporal, que es necesaria cuando se estudia el flujo de juntura de las moléculas. Por lo tanto, para investigar el impacto de miARN / siRNA como moléculas de señalización intercelular, se necesitan nuevas herramientas que permitan el análisis de estos ARN pequeños a nivel celular. El presente protocolo describe el apPlication de la recuperación tridimensional de la fluorescencia después de la microscopía del photobleaching (3D-FRAP) para aclarar el intercambio dependiente de la conexión de la separación de moléculas del miRNA entre las células cardíacas. Es importante destacar que este enfoque directo y no invasivo de imágenes de células vivas permite la visualización y cuantificación de la separación gapcaling de pequeños RNA marcados fluorescentemente en tiempo real, con alta resolución espacio-temporal. Los datos obtenidos por 3D-FRAP confirman una nueva vía de regulación de genes intercelulares, donde los ARN pequeños actúan como moléculas de señalización dentro de la red intercelular.

Introducción

Los pequeños ARN no codificantes son actores importantes en la regulación de genes celulares. Estas moléculas están compuestas de 20-25 nucleótidos que se unen a un ARNm diana específico, lo que conduce al bloqueo de la traducción oa la degradación del mRNA ^{1 , 2} . El proceso de regulación de genes llevado a cabo por pequeños ARNs, como miARN y siRNA, es un mecanismo altamente conservado que se ha encontrado en muchas especies diferentes [ ^3] . En particular, las moléculas de miARN son de crucial importancia para una variedad de procesos fisiológicos, incluyendo la proliferación, diferenciación y regeneración ^{4 , 5} . Además, la desregulación de la expresión de miARN se atribuye a muchos trastornos patológicos. Correspondientemente, miRNAs han demostrado ser adecuados como biomarcadores para el diagnóstico y como agentes terapéuticos para la terapia génica ^{6 , 7}

Las uniones Gap (GJs) son estructuras proteicas especializadas en la membrana plasmática de dos células adyacentes que permiten el intercambio difusional de moléculas con un peso molecular de hasta 1 kD. Se ha demostrado que son importantes para el desarrollo de tejidos, la diferenciación, la muerte celular y trastornos patológicos como el cáncer o las enfermedades cardiovasculares [ ^{8 , 9 , 10]} . Varias moléculas han sido descritas como capaces de atravesar canales GJ, incluyendo iones, metabolitos y nucleótidos. Curiosamente, GJs también se encontró a proporcionar una vía para el movimiento intercelular de pequeños ARNs [ ^{11 , 12]} . Por lo tanto, miRNAs puede actuar no sólo dentro de la célula en la que se producen, sino también dentro de las células receptoras. Esto pone de relieve el papel de los miARN en el sistema de transducción de señales intercelulares. Al mismo tiempo, los datosQue la comunicación intercelular de unión gap está estrechamente vinculada a la función miARN. Debido al impacto significativo de miARN y GJs en la homeostasis, la patología y el diagnóstico de los tejidos, una comprensión integral de la función de los GJs y la dinámica intercelular relacionada del miRNA ayudará a aclarar los mecanismos de las enfermedades basadas en miARN y desarrollar nuevas estrategias para MiARN.

Dependiendo de la extensión del acoplamiento de la separación de la abertura, la transferencia de moléculas del miARN entre las células puede ser un proceso muy rápido. Por lo tanto, se requiere una metodología que permita la visualización y cuantificación del movimiento intercelular rápido de estas moléculas de señalización reguladora. Comúnmente, citometría de flujo y técnicas de biología molecular se han aplicado para demostrar el shuttling de pequeños ARNs ¹¹ , ^{12 , 13 , 14} . Sin embargo, a diferencia de FRAP microsCopiar, estos enfoques carecen de alta resolución temporal, lo que es obligatorio al analizar el intercambio de miRNA a través de GJs. Por otra parte, la microscopía FRAP es menos invasiva y por lo tanto representa una poderosa y novedosa técnica de imágenes de células vivas para evaluar el intercambio GJ-dependiente de moléculas en varios tipos de células ^{15 , 16 , 17} .

Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe la aplicación de 3D-FRAP para evaluar miRNA shuttling entre cardiomiocitos. Para este propósito, se transfectaron cardiomiocitos con miARN marcado fluorescentemente. Una celda marcada con este miARN fue fotoblanqueada, y el gap de unión de miRNA re-afluencia de células adyacentes se registró en un tiempo dependiente de la forma. La alta resolución temporal de los experimentos FRAP ofrece la posibilidad de realizar estudios cinéticos para la evaluación precisa de la transferencia intercelular de miRNA y siRNA entre células vivas. MoreoVer, como ARN pequeños pueden ser intercambiados a través de diferentes mecanismos con cinética muy diferente, la microscopía FRAP puede ayudar a aclarar la medida en que GJs están involucrados en los procesos de shuttling respectivos [ ^18] . Además, 3D-FRAP puede ser utilizado para investigar las alteraciones fisiológicas y patológicas en la permeabilidad GJ y su impacto en la transferencia de ARN pequeños [ ^{15 , 19]} .

Protocolo

Todos los pasos en este protocolo que implican ratones neonatal fueron realizados por las pautas éticas para el cuidado animal del centro médico de la universidad de Rostock.

1. Preparación de platos de cultivo celular y el medio para cultivo de cardiomiocitos

1. Recubrir una placa de cultivo celular con 0,1% de gelatina en PBS e incubar a 37 ° C durante 4 h oa 4 ° C durante la noche. Retire la gelatina y deje que se seque bajo flujo de aire laminar estéril.
2. Preparar el medio de cultivo celular compuesto de 50 ml de DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Precalentar a 37 ° C.

2. Aislamiento de Cardiomiocitos Neonatales

1. Sacrificar a ratones neonatales (1-2 días de edad) por decapitación con tijeras estériles y abrir el pecho a lo largo del esternón. Retire el corazón con una pinza mientras presiona ligeramente el tórax y transfiere el corazón a una placa de 24 pocillos que contenga HBSS helado(Sin Ca ²⁺ y Mg ²⁺ ).
2. Elimine el tejido no cardíaco y los vasos más grandes usando fórceps estériles. Transferir los corazones limpios a un tubo de 1,5 ml que contenga HBSS helado. Utilice un máximo de 5 corazones por tubo para la digestión enzimática.
3. Picar los corazones con tijeras pequeñas en piezas de <0,5 a 1 mm³.
4. Lave los corazones picados con HBSS dos veces por aspiración / adición de HBSS usando una pipeta de microlitro de 1 ml. Eliminar el HBSS completamente antes de agregar las enzimas.
5. Para la digestión enzimática de corazones neonatales, utilice un kit disponible comercialmente y siga el protocolo del fabricante (vea la Tabla de Materiales ). Agitar el tubo que contiene los corazones picados cada 5 min mientras se incuba con enzimas a 37 ° C durante 35 min.
6. Sembrar las células en suspensión en placas de cultivo celular no recubiertas que contienen medio de cultivo celular durante 1,5-2 h para permitir la adherencia de la fracción no cardiomiocitaria. Repita este paso si una alta purezaDe cardiomiocitos. Si se desea, se cultiva adicionalmente la fracción no cardiomiocítica.
   NOTA: Para una suspensión celular de 15 corazones, la etapa de pre-recubrimiento se puede realizar en matraces de cultivo celular de 75 cm $ ² $. Normalmente, se obtienen ~ 5 x 105 células de un corazón neonatal.
7. Recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 10 min a 300 x g. Resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo celular.
8. Contar las células con un hemocitómetro de cámara Neubauer, o utilizar un método equivalente.
9. Los cardiomiocitos aislados en placa en placas de 6 pocillos con una densidad de 3 x 105 células / cm $ ² $. Incubar las células durante la noche a 37 ° C y 5% de CO ₂ .
   NOTA: Opcionalmente, las células también pueden ser transfectadas en este punto. Sin embargo, se observó una mayor viabilidad cuando las células se cultivaron durante un día antes de ser sometidas a electroporación.

3. Transfección con miRNA marcado fluorescentemente

1. Pre-(Véase el paso 1.2) a 37 ° C en un baño de agua o un dispositivo equivalente.
2. Preparar una solución madre de 20 μM de miARN fluorescente en agua estéril libre de RNasa.
3. Preparar un tampón de electroporación que contiene Na _ { ₂ } HPO _ { ₄ } 90 mM, NaH _ { ₂ } PO _ { ₄ } 90 mM, KCl 5 mM, MgCl _ { ₂ } 10 mM y succinato de sodio 10 mM y ajustar el pH a 7,2; El tampón de electroporación puede almacenarse a -20 ° C durante varios meses.
4. Se separan las células del plato de cultivo usando tripsina al 0,05% durante 5 min. Inactivar la tripsina añadiendo medio de cultivo celular.
5. Contar las células con un hemocitómetro de cámara Neubauer, o utilizar un método equivalente. Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min.
6. Resuspender las células en tampón de electroporación para obtener una concentración de 4 x 105 células por 100 μl.
7. Mezclar 100 μL de suspensión celular con miARN fluorescente (concentración final: 0,25 μM) en un tubo yCargar la mezcla en una cubeta de electroporación.
   1. Determinar empíricamente la cantidad apropiada de miARN, dependiendo del tipo de célula.
8. Realizar la electroporación utilizando un dispositivo de electroporación (véase la tabla de materiales ), utilizando el programa "G-009".
9. Añadir 500 μl de medio de cultivo celular precalentado y transferir la suspensión de células completas (4 x 105 células) en un pocillo de un portaobjetos de 4 pocillos de fondo de vidrio. Cultivo de las células durante 1 día a 37 ° C en una atmósfera de CO ₂ al 5%.
   NOTA: Para el análisis FRAP, una densidad celular de ~ 80% es óptima. La transfección de miARN marcado debe realizarse exclusivamente mediante electroporación. Puesto que la distribución homogénea de las moléculas de miARN marcadas es beneficiosa para la medición de FRAP, no se recomienda la transfección basada en reactivos.

4. Aplicación de la 3D-FRAP Microscopía (Día 3)

1. Calentar la incubadora del microscopio a 37 °; C y encienda el microscopio confocal al menos 2 h antes de la medición FRAP para establecer un equilibrio térmico y disminuir la posibilidad de deriva. Si es posible, mantenga una atmósfera de CO2 al 5%.
2. Inserte la corredera de la cámara en el soporte de muestras de la etapa.
3. Encuentre un grupo de cardiomiocitos transfectados utilizando un objetivo de aceite 1.4 NA (aumento de 400X) y una luz de excitación láser de 561 nm con baja potencia láser, con un rango de detección de 570-680 nm.
   NOTA: La definición de los ajustes de FRAP, la adquisición de la imagen y el análisis se realizaron utilizando software específico del microscopio (ver Tabla de Materiales ).
4. Active los botones "z-Stack", "Series temporales", "Blanqueo" y "Regiones" en el "Administrador de configuración".
5. Defina los parámetros FRAP.
   1. Defina los ajustes de adquisición de imagen en el menú "Modo de adquisición" ajustando el "tamaño del marco4; A 512 x 512, el "paso de línea" a 1, y el "tiempo de exploración" a <1 s.
   2. En el menú "Canales", ajuste los ajustes de potencia, offset y ganancia del láser para obtener la máxima fluorescencia a partir de la mínima excitación del láser ( por ejemplo, potencia del láser: 1-5%); Ajustar para evitar la saturación de intensidad. Coloque el "tamaño del agujero de alfiler" en 2 μm.
   3. A continuación, en el menú "Regiones", seleccione la "herramienta de dibujo ROI" y utilice el cursor para marcar la celda de destino, la celda de referencia y el área de fondo. Si es necesario, seleccione varias celdas de destino para el fotoblanqueo.
   4. Ajuste la configuración de fotoblanqueo en el menú "Blanqueado" ( p. Ej., Iteraciones: 9-14, potencia láser para fotoblanqueo: 100%, intervalo de adquisición de imagen: 60 s, ciclos: 15). Definir el inicio del blanqueo después de 3 exploraciones iniciales.
   5. En el menú "z-Stack", defina los límites para la adquisición de la pila z, dependiendo del grosor de las celdas. Ajuste el "número oF z-capas "a 12 - 15.
   6. Iniciar el experimento FRAP y registrar la recuperación de fluorescencia.
      NOTA: Dado que los ajustes de un experimento FRAP dependen del tipo de célula, el colorante fluorescente y el sistema de microscopio, es mejor realizar experimentos piloto para determinar los parámetros óptimos para FRAP. El blanqueo debe ser suficiente para reducir la intensidad inicial de fluorescencia en al menos el 50%. Típicamente, la recuperación de fluorescencia debe ser registrada cada 30-60 s hasta que se alcance la fase de meseta.

5. Análisis de datos

1. Crear proyecciones máximas de las pilas z adquiridas y obtener valores de intensidad de fluorescencia de las células diana blanqueadas, la celda de referencia y el fondo. Utilizando el software específico del microscopio, haga clic en "Procesamiento" → "Proyección de intensidad máxima" → seleccione archivo → "Aplicar".
   1. Alternativamente, utilice una herramienta de análisis de imagen equivalente ( por ejemplo, ImageJ).
2. Copie los datos de intensidad de fluorescencia en todos los puntos de tiempo de la celda de destino, el fondo y la celda de referencia en una hoja de cálculo.
   1. Restar la intensidad de fondo y la intensidad de la celda de referencia de los valores de intensidad de la celda objetivo para corregir el fotoblanqueo causado durante el proceso de adquisición. Realice las correcciones de fondo y de celda de referencia para cada punto de tiempo.
   2. Normalizar los datos FRAP corregidos a la intensidad de fluorescencia inicial antes del blanqueo dividiendo cada valor por la fluorescencia inicial.
   3. Para obtener curvas FRAP, ajuste la línea base a la intensidad de fluorescencia inmediatamente después del blanqueo restando de los valores de intensidad de cada punto de tiempo.

Resultados

Aquí, presentamos la microscopía 3D-FRAP como una técnica no invasiva para estudiar la separación gapcaling de miRNA fluorescente dentro de los cardiomiocitos neonatales. Los cardiomiocitos aislados revelaron el típico patrón estriado de α-actinina y contenían grandes placas de Cx43 a lo largo de los bordes celulares ( Figura 1A , puntas de flecha blancas), lo que permitía el alto flujo intercelular de moléculas. La pureza de los cardiomiocitos ais...

Discusión

MiRNAs son actores clave en la fisiología celular y se demostró que actúan como moléculas de señalización utilizando-entre otros-GJs como una vía para el intercambio intercelular [ ^{11 , 12 , 22]} . El protocolo actual presenta una técnica de imágenes de células vivas in vitro para caracterizar este desplazamiento dependiente de GJ utilizando miRNAs fluorescentes dentro de grupos de células.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
neonatal NMRI mice	Charles River
Gelatin	Sigma Aldrich	G7041	0.1% solution in PBS, sterilized
PBS	Pan Biotech	P04-53500
Dulbecco´s modified medium	Pan Biotech	P04-03550
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum	Pan Biotech	P30-3306
Cell culture plastic	TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Fisher Scientific	88281
HBSS	Thermo Fisher Scientific	88281	included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic	Dharmacon	CP-004500-01-05	dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S3139
Sodium phosphate dibasic	Carl Roth	T877.2
Potassium chloride	Sigma	P9333
Magnesium chloride	Serva	28305.01
Sodium succinate	Carl Roth	3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution	Merck	L2153
4-well- Glass bottom chamber slides	IBIDI	80827	coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II	Lonza		program G-009 was used for Electroporation
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Excel software	Microsoft
α-actinin antibody	Abcam	ab9465	dilution 1:200
Connexin43 antibody	Santa Cruz	sc-9059	dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11005	dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034	dilution 1:300
Connexin43 siRNA	Thermo Fisher Scientific	AM16708 ID158724	final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
CellTrace Calcein Red-Orange	Thermo Scientific	C34851
DAPI nuclear stain	Thermo Scientific	D1306