JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем применение трехмерного восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (3D-FRAP) для анализа зависимого от щелевого перехода челнока miRNA. В отличие от общепринятых методов, 3D-FRAP позволяет количественно определять межклеточный перенос малых РНК в реальном времени с высоким пространственно-временным разрешением.

Аннотация

Малые антисмысловые РНК, такие как miRNA и siRNA, играют важную роль в клеточной физиологии и патологии и, более того, могут быть использованы в качестве терапевтических агентов для лечения нескольких заболеваний. Разработка новых инновационных стратегий терапии miRNA / siRNA основана на обширном знании основных механизмов. Недавние данные свидетельствуют о том, что небольшие РНК обмениваются между клетками в зависимом от щелевого соединения образом, тем самым индуцируя регуляторные эффекты гена в клетке-реципиенте. Молекулярно-биологические методы и проточный цитометрический анализ обычно используются для изучения межклеточного обмена miRNA. Однако эти методы не обеспечивают высокого временного разрешения, что необходимо при изучении щелевого взаимодействия молекул. Поэтому для исследования влияния miRNA / siRNA в качестве межклеточных сигнальных молекул необходимы новые инструменты, которые позволят проанализировать эти небольшие РНК на клеточном уровне. В настоящем протоколе описывается ap(3D-FRAP) микроскопии для выяснения взаимозависимого обмена молекул miRNA между сердечными клетками. Важно отметить, что этот простой и неинвазивный подход к визуализации живых клеток позволяет визуализировать и количественно измерять щелевую синхронизацию флуоресцентно меченных малых РНК в реальном времени с высоким пространственно-временным разрешением. Данные, полученные 3D-FRAP, подтверждают новый путь регуляции межклеточного гена, где небольшие РНК действуют как сигнальные молекулы внутри межклеточной сети.

Введение

Малые некодирующие РНК являются важными игроками в регуляции клеточных генов. Эти молекулы состоят из 20-25 нуклеотидов, которые связываются с специфической мишенью-мРНК, что приводит к блокировке трансляции или деградации мРНК 1 , 2 . Процесс регуляции генов, осуществляемый малыми РНК, такими как miRNA и siRNA, является высококонсервативным механизмом, который был обнаружен у многих разных видов 3 . В частности, молекулы miRNA имеют решающее значение для различных физиологических процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и регенерацию 4 , 5 . Кроме того, дисрегуляция экспрессии miRNA объясняется многими патологическими нарушениями. Соответственно, miRNAs были признаны пригодными в качестве биомаркеров для диагностики и в качестве терапевтических агентов для генной терапии 6 , 7 .

Разрывные соединения (GJ) являются специализированными белковыми структурами в плазматической мембране двух смежных клеток, которые позволяют диффузионный обмен молекулами с молекулярной массой до 1 кД. Было показано, что они важны для развития тканей, дифференцировки, гибели клеток и патологических нарушений, таких как рак или сердечно-сосудистые заболевания 8 , 9 , 10 . Несколько молекул описаны как способные пересекать GJ-каналы, включая ионы, метаболиты и нуклеотиды. Интересно, что ГД также были найдены, чтобы обеспечить путь для межклеточного движения малых РНК 11 , 12 . Таким образом, miRNAs могут действовать не только внутри клетки, в которой они производятся, но также и внутри клеток-реципиентов. Это подчеркивает роль miRNAs в межклеточной системе трансдукции сигнала. В то же время данные демонстрируютЭта щелевая межклеточная связь тесно связана с функцией miRNA. Из-за значительного воздействия miRNA и GJ на гомеостаз, патологию и диагностику тканей, всестороннее понимание функции GJs и связанной с ними межклеточной динамики miRNA поможет прояснить механизмы заболеваний, основанных на miRNA, и разработать новые стратегии для MiRNA-терапии.

В зависимости от степени щелевого взаимодействия, передача молекул miRNA между клетками может быть очень быстрым процессом. Поэтому требуется методология, позволяющая визуализировать и количественно определять быстрое межклеточное перемещение этих регулирующих сигнальных молекул. Как правило, проточная цитометрия и молекулярно-биологические методы были применены для демонстрации челночного движения небольших РНК 11 , 12 , 13 , 14 . Однако, в отличие от микроскопов FRAPКопии, эти подходы не имеют высокого временного разрешения, что является обязательным при анализе обмена miRNA через GJs. Кроме того, микроскопия FRAP менее инвазивна и поэтому представляет собой мощный и новый метод визуализации живых клеток для оценки GJ-зависимого обмена молекулами в нескольких типах клеток 15 , 16 , 17 .

Здесь мы приводим подробный протокол, описывающий применение 3D-FRAP для оценки транскрипции miRNA между кардиомиоцитами. С этой целью кардиомиоциты трансфицировали флуоресцентно меченной миРНК. Клетка, отмеченная этой miRNA, была фотоэлементами, и повторный приток межклеточной миРНК из смежных клеток регистрировался зависящим от времени образом. Высокое временное разрешение экспериментов FRAP дает возможность проводить кинетические исследования для точной оценки межклеточного переноса miRNA и siRNA между живыми клетками. MoreoVer, так как небольшие РНК могут быть обменены с помощью разных механизмов с сильно различной кинетикой, FRAP-микроскопия может помочь выяснить, в какой степени ГД участвуют в соответствующих процессах челночного процесса. Кроме того, 3D-FRAP можно использовать для исследования физиологических и патологических изменений проницаемости GJ и его влияния на перенос малых РНК 15 , 19 .

протокол

Все этапы этого протокола с участием неонатальных мышей были выполнены в соответствии с этическими принципами ухода за животными в Медицинском центре Университета Ростока.

1. Приготовление блюд для клеточной культуры и среды для культуры кардиомиоцитов

  1. Нанесите культуральную пластинку для клеток с 0,1% желатина в PBS и инкубируйте при 37 ° C в течение 4 часов или при 4 ° C в течение ночи. Удалите желатин и дайте ему высохнуть при стерильном ламинарном потоке воздуха.
  2. Подготовьте среду для культивирования клеток, состоящую из 50 мл DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S). Подогрейте его до 37 ° C.

2. Выделение неонатальных кардиомиоцитов

  1. Пожертвуйте неонатальных мышей (1-2 дня) путем обезглавливания стерильными ножницами и откройте сундук вдоль грудины. Удалите сердце, используя щипцы, слегка прижимая грудную клетку и перенося сердце в 24-луночный планшет, содержащий ледяную HBSS(Без Ca 2+ и Mg 2+ ).
  2. Удалите несердечную ткань и более крупные сосуды, используя стерильные щипцы. Перенесите очищенные сердца в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую ледяную HBSS. Используйте максимум 5 сердец на пробирку для ферментативного переваривания.
  3. Наполните сердца маленькими ножницами в <0,5 до 1 мм³ штук.
  4. Вымойте измельченные сердца с помощью HBSS два раза путем аспирации / добавления HBSS с использованием пипетки с микролитом объемом 1 мл. Перед добавлением ферментов полностью удалите HBSS.
  5. Для ферментативного расщепления новорожденных сердец используйте коммерчески доступный комплект и следуйте протоколу производителя (см. Таблицу материалов ). Встряхивайте пробирку, содержащую измельченные сердца каждые 5 мин, при инкубации с ферментами при 37 ° С в течение 35 мин.
  6. Семена взвешенных клеток на не покрытых оболочкой клеточных культурах, содержащих среду для культивирования клеток, в течение 1,5-2 ч, чтобы обеспечить прилипание некардиомиоцитарной фракции. Повторите этот шаг, если высокая чистотаКардиомиоцитов. При желании дополнительно культивируют фракцию, не являющуюся кардиомиоцитом.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для клеточной суспензии из 15 сердец этап предварительной обработки может быть выполнен на колбах для культивирования клеток размером 75 см2. Как правило, ~ 5 × 10 5 клеток получают из одного неонатального сердца.
  7. Собирают супернатант в 15 мл конической пробирке и центрифугируют в течение 10 мин при 300 х g. Ресуспендируют клетки в 1 мл среды для культивирования клеток.
  8. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра камеры Нойбауэра или используйте эквивалентный метод.
  9. Пластинчатые кардиомиоциты на 6-луночных планшетах с плотностью 3 × 10 5 клеток / см². Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. При необходимости клетки также могут быть трансфицированы в этот момент. Однако повышенная жизнеспособность наблюдалась, когда клетки культивировали в течение одного дня, прежде чем подвергали электропорации.

3. Трансфекция флуоресцентной меткой miRNA

  1. пред-(См. Шаг 1.2) до 37 ° C на водяной бане или эквивалентном устройстве.
  2. Подготовьте 20 мкМ исходный раствор флуоресцентной miRNA в свободной от RNase стерильной воде.
  3. Подготовьте буфер для электропорации, содержащий 90 мМ Na 2 HPO 4 , 90 мМ NaH 2 PO 4 , 5 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2 и 10 мМ сукцинат натрия и доведите pH до 7,2; Буфер электропорации можно хранить при -20 ° C в течение нескольких месяцев.
  4. Отсоедините клетки от культуральной чашки, используя 0,05% трипсина в течение 5 мин. Инактивируйте трипсин, добавив среду для культивирования клеток.
  5. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра камеры Нойбауэра или используйте эквивалентный метод. Центрифугировать клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
  6. Ресуспендируют клетки в буфере для электропорации, чтобы получить концентрацию 4 × 10 5 клеток на 100 мкл.
  7. Смешайте 100 мкл клеточной суспензии с флуоресцентной miRNA (конечная концентрация: 0,25 мкМ) в пробирке иЗагружают смесь в кювету электропорации.
    1. Эмпирически определите соответствующее количество miRNA, в зависимости от типа клетки.
  8. Выполните электропорацию с помощью устройства электропорации (см. Таблицу материалов ), используя программу «G-009».
  9. Добавьте 500 мкл предварительно нагретой клеточной культуральной среды и перенесите целую клеточную суспензию (4 × 10 5 клеток) в лунку 4-луночного стекла со стеклянным дном. Культуру клеток в течение 1 дня при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для анализа FRAP плотность клеток ~ 80% является оптимальной. Трансфекцию меченой miRNA следует выполнять исключительно электропорацией. Поскольку гомогенное распределение меченых молекул miRNA выгодно для измерения FRAP, трансфекция на основе реагентов не рекомендуется.

4. Применение микроскопии 3D-FRAP (3-й день)

  1. Разогрейте микроскоп-инкубатор до 37 °C и включите систему конфокального микроскопа не менее чем за 2 часа до измерения FRAP, чтобы установить тепловое равновесие и уменьшить вероятность дрейфа. Если возможно, поддерживайте 5% СО 2 -ную атмосферу.
  2. Вставьте камеру в держатель образца образца.
  3. Найдите кластер трансфицированных кардиомиоцитов с использованием масляного объектива 1,4 NA (увеличение 400X) и лазера с возбуждением 561 нм при низкой мощности лазера с диапазоном обнаружения 570-680 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Определение настроек FRAP, получение изображений и анализ проводились с использованием программного обеспечения для микроскопа (см. Таблицу материалов ).
  4. Активируйте кнопки «z-Stack», «Time Series», «Bleaching» и «Regions» в «Setup Manager».
  5. Определите параметры FRAP.
    1. Определите настройки получения изображения в меню «Режим сбора данных», установив «размер кадра4; До 512 x 512, «шаг линии» до 1 и «время сканирования» до <1 с.
    2. В меню «Каналы» отрегулируйте настройки мощности, смещения и усиления лазера, чтобы получить максимальную флуоресценцию от минимального лазерного возбуждения ( например, мощность лазера: 1-5%); Отрегулируйте, чтобы избежать насыщения интенсивности. Установите «размер отверстия» до 2 мкм.
    3. Затем в меню «Регионы» выберите «Инструмент рисования ROI» и используйте курсор для отметки целевой ячейки, контрольной ячейки и области фона. При необходимости выберите несколько целевых ячеек для фотообесцвечивания.
    4. Отрегулируйте параметры фотообесцвечивания в меню «Отбеливание» ( например, итерации: 9-14, мощность лазера для фотообесцвечивания: 100%, интервал получения изображения: 60 с, циклы: 15). Определите начало отбеливания после трех начальных сканирований.
    5. В меню «z-Stack» определите пределы для сбора z-стека в зависимости от толщины ячеек. Отрегулируйте «число oF z-layers "до 12 - 15.
    6. Запустите эксперимент FRAP и зарегистрируйте восстановление флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку настройки эксперимента FRAP зависят от типа ячейки, флуоресцентного красителя и системы микроскопа, лучше всего провести экспериментальные эксперименты для определения оптимальных параметров для FRAP. Отбеливание должно быть достаточным, чтобы уменьшить начальную интенсивность флуоресценции не менее чем на 50%. Как правило, восстановление флуоресценции следует регистрировать каждые 30-60 с до достижения фазы плато.

5. Анализ данных

  1. Создайте максимальные проекции полученных z-стеков и получите значения интенсивности флуоресценции отбеленных клеток-мишеней, контрольной ячейки и фона. Используя программное обеспечение, специфичное для микроскопа, нажмите «Обработка» → «Максимальная проекция интенсивности» → выберите файл → «Применить».
    1. В качестве альтернативы используйте инструмент анализа эквивалентного изображения ( например, ImageJ).
  2. Скопируйте данные интенсивности флуоресценции во все моменты времени из ячейки-мишени, фона и контрольной ячейки в электронную таблицу.
    1. Вычтите интенсивность фона и интенсивность эталонной ячейки из значений интенсивности ячейки-мишени, чтобы исправить фотообесцвечивание, вызванное в процессе получения. Выполните коррекцию фоновой и опорной ячейки для каждой временной точки.
    2. Нормализовать скорректированные данные FRAP до начальной интенсивности флуоресценции перед отбеливанием путем деления каждого значения на начальную флуоресценцию.
    3. Чтобы получить кривые FRAP, установите базовую линию на интенсивность флуоресценции сразу после отбеливателя путем вычитания из значений интенсивности каждой временной точки.

Результаты

Здесь мы представляем 3D-FRAP-микроскопию как неинвазивную методику для изучения щелевого взаимодействия с флуоресцентной miRNA в неонатальных кардиомиоцитах. Выделенные кардиомиоциты выявили типичную полосатую структуру α-актинина и содержали большие бляшки Cx43 вдоль ?...

Обсуждение

MiRNAs являются ключевыми игроками в клеточной физиологии и, как было показано, действуют как сигнальные молекулы, используя, среди прочего, GJ как путь межклеточного обмена 11 , 12 , 22 . Текущий протокол представляет собой метод визуализа?...

Раскрытие информации

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и исследований Германии (FKZ 0312138A и FKZ 316159), Государственным Мекленбург-Передняя Померания с Структурными фондами ЕС (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 и ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) и Германский сердечный фонд (F / 01/12). Кроме того, RD поддерживается Программой FORUN Медицинского центра Университета Ростока (889001), Фонда DAMP и BMBF (VIP + 00240).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
neonatal NMRI miceCharles River
GelatinSigma AldrichG70410.1% solution in PBS, sterilized
PBSPan BiotechP04-53500
Dulbecco´s modified mediumPan BiotechP04-03550
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serumPan BiotechP30-3306
Cell culture plasticTPP
Primary Cardiomyocyte Isolation KitThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blueThermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA MimicDharmaconCP-004500-01-05dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasicSigmaS3139
Sodium phosphate dibasicCarl RothT877.2
Potassium chlorideSigmaP9333
Magnesium chlorideServa28305.01
Sodium succinateCarl Roth3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solutionMerckL2153
4-well- Glass bottom chamber slidesIBIDI80827coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector IILonzaprogram G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 systemZeiss
Excel softwareMicrosoft
α-actinin antibodyAbcamab9465dilution 1:200
Connexin43 antibodySanta Cruzsc-9059dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibodyThermo Fisher ScientificA-11005dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibodyThermo Fisher ScientificA-11034dilution 1:300
Connexin43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
DAPI nuclear stainThermo ScientificD1306

Ссылки

  1. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
  4. Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
  5. Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
  6. Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  7. Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
  8. Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
  9. Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
  10. Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
  11. Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
  12. Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
  13. Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
  14. Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
  15. Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
  16. Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
  17. Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
  18. Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
  19. Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
  20. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  21. Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
  22. Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
  23. Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
  24. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
  25. Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
  26. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
  27. Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
  28. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
  29. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
  30. Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
  31. Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
  32. Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124miRNAFRAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены