ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

Summary

כאן, אנו מתארים את היישום של התאוששות מימדי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) לניתוח של צומת הפער התלוי תלוי של מירנה. בניגוד לשיטות מיושמות בדרך כלל, 3D-FRAP מאפשר כימות של העברה בין תאית של RNAs קטנים בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ספטיו- temporal.

Abstract

קטן RNAs antisense, כמו מירנה ו siRNA, לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגיה הסלולר פתולוגיה, יתר על כן, ניתן להשתמש סוכני טיפולית לטיפול במספר מחלות. הפיתוח של אסטרטגיות חדשות וחדשניות עבור טיפול מירנה / siRNA מבוסס על ידע נרחב של המנגנונים הבסיסיים. נתונים אחרונים מראים כי RNAs קטנים מוחלפים בין התאים בצורה תלויה בצומת הפער, ובכך גורם להשפעות גנטיות של הגן בתא הנמען. טכניקות ביולוגיות מולקולריות וניתוח cytometric זרימה משמשים בדרך כלל כדי ללמוד את חילופי בין תאיים של מירנה. עם זאת, שיטות אלה אינם מספקים רזולוציה גבוהה טמפורלית, אשר הכרחי כאשר לומדים את הפער השטף פער של מולקולות. לכן, כדי לחקור את ההשפעה של מירנה / siRNA כמו מולקולות איתות בין תאיים, כלים חדשים נדרשים שיאפשר ניתוח של אלה RNAs קטנים ברמה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את apPlication של התאוששות פלואורסצנטי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) מיקרוסקופ כדי להבהיר את צומת הפער תלוי החליפין של מולקולות מירנה בין תאים לבביים. חשוב לציין, זה פשוט ולא פולשני לחיות הדמיה גישה הדמיה מאפשרת הדמיה וכימות של shuttling פער junctional של RNAs קטן שכותרתו fluorescently בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ברזולוציה זמן. הנתונים המתקבלים על ידי 3D-FRAP מאשרים מסלול חדש של רגולציה גנים בין תאיים, כאשר RNA קטנים פועלים כמולקולות איתות בתוך הרשת הבין-תאית.

Introduction

קטנים RNAs noncoding הם שחקנים חשובים בתחום הרגולציה הגן הסלולרי. מולקולות אלה מורכבים 20-25 נוקליאוטידים כי לאגד mRNA מטרה מסוימת, המוביל לחסימה של תרגום או ל mRNA השפלה ^{1 , 2} . תהליך הרגולציה הגנטית שנעשה על ידי RNA קטנים, כגון מירנה ו siRNA, הוא מנגנון שמרני מאוד שנמצא במינים שונים רבים ³ . בפרט, מולקולות מירנה הם בעלי חשיבות מכרעת למגוון של תהליכים פיזיולוגיים, כולל התפשטות, דיפרנציאציה, התחדשות ^{4 , 5} . בנוסף, dysregulation הביטוי מירנה מיוחסת להפרעות פתולוגיות רבות. מקביל, miRNAs הוכחו להיות מתאים כמו סמנים ביולוגיים לאבחון כמו סוכני טיפולית עבור טיפול גנטי ^{6 , 7} .

צמתים הפער (GJs) הם מבנים חלבונים מיוחדים בקרום פלזמה של שני תאים סמוכים המאפשרים חילופי diffusional של מולקולות עם משקל מולקולרי של עד 1 kD. הם הוכחו כחשובים להתפתחות רקמות, דיפרנציאציה, מוות לתאים והפרעות פתולוגיות כגון סרטן או מחלות לב וכלי דם ^{8 , 9 , 10} . מספר מולקולות תוארו כמי שמסוגלות לחצות את ערוצי ה- GJ, כולל יונים, מטבוליטים ונוקליאוטידים. מעניין, GJs נמצאו גם לספק מסלול לתנועה בין תאיים של RNA קטנים ^{11 , 12} . לפיכך, miRNAs יכול לפעול לא רק בתוך התא שבו הם מיוצרים, אלא גם בתוך תאים הנמען. זה מדגיש את התפקיד של miRNAs במערכת interducellular transduction האות. יחד עם זאת, הנתונים להפגיןכי פער תקשורת intertellular פער קשורה קשר הדוק לתפקוד מירנה. בגלל ההשפעה המשמעותית של מירנה ו GJs על הומאוסטזיס רקמות, פתולוגיה, ואבחון, הבנה מקיפה של הפונקציה של GJs ואת הדינמיקה הבין תאיים הקשורים מירנה יעזור להבהיר את המנגנונים של מחלות מבוססות מירנה לפתח אסטרטגיות חדשות עבור טיפולים מירנה.

בהתאם להיקף של צימוד genctional הפער, העברת מולקולות מירנה בין התאים יכול להיות תהליך מהיר מאוד. לכן, מתודולוגיה המאפשרת הדמיה וכימות של תנועה בין תאנית מהירה של אלה מולקולות איתות רגולציה נדרשת. בדרך כלל, cytometry זרימה וטכניקות ביולוגיות מולקולריות יושמו כדי להדגים את shuttleling של RNAs קטנים ¹¹ , ^{12 , 13 , 14} . עם זאת, בניגוד micros FRAPלהעתיק, גישות אלה חסרים ברזולוציה טמפורלית גבוהה, אשר חובה בעת ניתוח החליפין של מירנה באמצעות GJs. יתר על כן, מיקרוסקופ FRAP הוא פולשני פחות ולכן מייצג חזק ורומנטי לחיות הדמיה תא טכניקה כדי להעריך את חילופי GJ תלויי של מולקולות במספר סוגי תאים ^{15 , 16 , 17} .

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את היישום של 3D-FRAP להעריך מירנה shuttling בין cardiomyocytes. לשם כך, cardiomyocytes היו transfected עם מירנה שכותרתו fluorescently. תא מסומן עם miRNA זה היה photobleached, ואת הפער פער miRNA מחדש של תאים סמוכים נרשמה באופן תלוי זמן. רזולוציה גבוהה של הניסויים FRAP מציע את האפשרות לבצע מחקרים קינטיים להערכה מדויקת של העברה בין תאיים של מירנה ו siRNA בין תאים חיים. מורוVer, כמו RNAs קטן ניתן להחליף באמצעות מנגנונים שונים עם קינטיקה שונה מאוד, מיקרוסקופ FRAP יכול לעזור להבהיר את מידת ההשתתפות של GJs בתהליכים Shuttleling בהתאמה ¹⁸ . בנוסף, 3D-FRAP ניתן להשתמש כדי לחקור שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים בחדירות GJ ואת השפעתה על העברת RNA קטן ^{15 , 19} .

Protocol

כל השלבים בפרוטוקול זה מעורבים עכברים בילודים בוצעו לפי הנחיות אתיות לטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי אוניברסיטת רוסטוק.

1. הכנת של תרבות תאים צלחות בינונית לתרבות cardiomyocyte

1. מעיל צלחת תרבות התא עם ג 'לטין 0.1% ב PBS ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר את הג'לטין ולאפשר לו להתייבש תחת זרימת אוויר סטרילית למינרית.
2. הכינו בינוני תרבות התא מורכב 50 מ"ל של DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). טרום חם עד 37 מעלות צלזיוס.

2. בידוד של Cardiomyocytes neonatal

1. להקריב עכברים neonatal (1-2 ימים) על ידי עריפת ראש עם מספריים סטריליים ולפתוח את החזה לאורך החזה. הסר את הלב באמצעות מלקחיים בזמן לחיצה קלה על החזה יחד ולהעביר את הלב לתוך צלחת 24-היטב המכיל HBSS קר כקרח(ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +} ).
2. הסר רקמות לא לב וכלי גדול באמצעות מלקחיים סטרילית. העברת לבבות לנקות לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל HBSS קר כקרח. השתמש מקסימום של 5 לבבות לכל צינור לעיכול אנזימטי.
3. מינס את הלבבות עם מספריים קטנים לתוך <0.5 ל 1 מ"מ חתיכות.
4. לשטוף את לבבות טחון עם HBSS פעמיים על ידי שאיפה / תוספת של HBSS באמצעות פיפטה 1-מ"ל microliter. הסר את HBSS לחלוטין לפני הוספת האנזימים.
5. לקבלת עיכול אנזימטי של לבבות ילודים, להשתמש בערכה זמינה מסחרית ופעל פרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים ). לנער את הצינור המכיל לבבות טחון כל 5 דקות תוך דוגרים עם אנזימים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות.
6. זרעים מושעה על תאים שאינם מצופים בתרבות תאים המכיל בינוני תרבות התא עבור 1.5-2 שעות כדי לאפשר את הדבקות של חלק cardiomyocyte שאינם. חזור על שלב זה אם טוהר גבוהשל cardiomyocytes יש צורך. אם תרצה, עוד התרבות את השבר שאינם cardiomyocyte.
   הערה: עבור ההשעיה התא של 15 לבבות, צעד מראש ציפוי יכול להתבצע על 75 ס"מ ² צלוחיות תרבות התא. בדרך כלל, ~ 5 x 10 ⁵ תאים מתקבלים בלב אחד neonatal.
7. איסוף supernatant בצינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם. Resuspend התאים 1 מ"ל של המדיום תרבות התא.
8. לספור את התאים עם hemocytometer Neubauer קאמרית, או להשתמש בשיטה המקבילה.
9. צלחת cardiomyocytes מבודד על 6 צלחות היטב עם צפיפות של 3 x 10 ⁵ תאים / ס"מ ². דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO ₂ .
   הערה: לחלופין, תאים יכולים גם להיות transfected בשלב זה. עם זאת, גדל הכדאיות נצפתה כאשר התאים היו מתורבת במשך יום אחד לפני היותו נתון electroporation.

3. transfection עם מירנה fluorescently תווית

1. מִרֹאשׁ-בינוני תרבות תאים חמים (ראה שלב 1.2) ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או מכשיר מקביל.
2. הכן פתרון מניות 20 מיקרומטר של מירנה ניאון במים סטרילי ללא RNase.
3. הכן חיץ electroporation המכיל 90 מ"מ Na ₂ HPO ₄ , 90 מ"מ NaH ₂ PO ₄ , 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl ₂ , ו 10 מ"מ נתרן succinate ולהתאים את ה- pH 7.2; חיץ electroporation ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
4. לנתק את התאים מהצלחת תרבות באמצעות 0.05% טריפסין במשך 5 דקות. להשבית את טריפסין על ידי הוספת בינוני תרבית תאים.
5. לספור את התאים עם hemocytometer Neubauer קאמרית, או להשתמש בשיטה המקבילה. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 10 דקות.
6. Resuspend התאים במאגר electroporation להשיג ריכוז של 4 x 10 ⁵ תאים לכל 100 μL.
7. מערבבים 100 μL ההשעיה התא עם מירנה ניאון (ריכוז סופי: 0.25 מיקרומטר) בצינור ולטעון את התערובת לתוך קובט electroporation.
   1. אמפירי לקבוע את הכמות המתאימה של מירנה, בהתאם לסוג התא.
8. בצע electroporation באמצעות מכשיר electroporation (ראה טבלה של חומרים ), באמצעות "G-009" התוכנית.
9. הוסף 500 μL של מדיום מראש חימם תרבות תאים ולהעביר את ההשעיה התא כולו (4 x 10 ⁵ תאים) לתוך באר של שקופיות קאמרית 4-היטב זכוכית התחתונה. תרבות התאים ליום 1 ב 37 מעלות צלזיוס באווירה 5% CO ₂ .
   הערה: עבור ניתוח FRAP, צפיפות התא של ~ 80% הוא אופטימלי. Transfection של מירנה שכותרתו צריכה להתבצע אך ורק באמצעות electroporation. מאז ההפצה הומוגנית של מולקולות מירנה שכותרתו מועיל למדידת FRAP, transfection מגיב מבוסס לא מומלץ.

4. החלת 3D-FRAP מיקרוסקופית (יום 3)

1. לחמם את החממה מיקרוסקופ ל 37 מעלות; C ו לעבור על מערכת מיקרוסקופ confocal לפחות 2 שעות לפני המדידה FRAP להקים שיווי משקל תרמי כדי להקטין את האפשרות להיסחף. אם אפשר, לשמור על 5% CO ₂ אווירה.
2. הכנס את השקופית קאמרית למחזיק מדגם הבמה.
3. מצא אשכול של cardiomyocytes transfected באמצעות המטרה שמן 1.4 NA (הגדלה 400X) ו 561 ננומטר אור עירור לייזר על כוח לייזר נמוך, עם טווח זיהוי של 570-680 ננומטר.
   הערה: ההגדרה של הגדרות FRAP, רכישת התמונה, והניתוח נעשו באמצעות תוכנה ספציפית מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים ).
4. הפעל את "Z-Stack", "Time Series", "Bleaching", ו "אזורים" לחצנים "מנהל ההתקנה".
5. הגדר את הפרמטרים FRAP.
   1. הגדר את הגדרות רכישת התמונה בתפריט "מצב רכישה" על ידי הגדרת "גודל המסגרת4; כדי 512 x 512, "צעד השורה" ל 1, ואת "זמן סריקה" כדי <1 s.
   2. בתפריט "ערוצים", להתאים את כוח הלייזר, לקזז, ולהשיג הגדרות כדי לקבל הקרינה מקסימלית מ עירור לייזר מינימלי ( למשל, כוח לייזר: 1-5%); להתאים כדי להימנע מרוויה בעוצמה. הגדר את "גודל חריר" עד 2 מיקרומטר.
   3. הבא, בתפריט "אזורים", בחר את "כלי ציור ROI" ולהשתמש הסמן כדי לסמן את התא היעד, תא התייחסות, ואת אזור הרקע. אם נדרש, בחר מספר תאים היעד photobleaching.
   4. התאם את הגדרות photobleaching בתפריט "הלבנה" ( לדוגמה, איטרציות: 9-14, כוח לייזר עבור photobleaching: 100%, מרווח של רכישת התמונה: 60 s, מחזורים: 15). הגדר את ההתחלה של הלבנה לאחר 3 סריקות ראשוניות.
   5. בתפריט "z- מחסנית", להגדיר את הגבולות של z- מחסנית הרכישה, בהתאם לעובי של התאים. התאם את "מספר oF z- שכבות "ל 12 - 15.
   6. הפעל את הניסוי FRAP ולתעד את ההתאוששות הקרינה.
      הערה: מאז ההגדרות של ניסוי FRAP תלויים בסוג התא, צבע ניאון, ואת מערכת המיקרוסקופ, עדיף לבצע ניסויים טייס כדי לקבוע את הפרמטרים האופטימליים עבור FRAP. הלבנה צריך להיות מספיק כדי להפחית את עוצמת הקרינה הראשונית על ידי לפחות 50%. בדרך כלל, התאוששות פלואורסצנטי צריך להיות מוקלט כל 30-60 s עד שלב הרמה הוא הגיע.

5. ניתוח נתונים

1. יצירת תחזיות מקסימום של z- ערימות שנרכשו ולקבל ערכים עוצמת הקרינה של תאים היעד מולבן, תא התייחסות, ואת הרקע. באמצעות תוכנה ספציפית מיקרוסקופ, לחץ על "עיבוד" → "מקסימום עוצמת הקרנה" → בחר קובץ → "החל".
   1. לחלופין, השתמש בכלי ניתוח תמונה מקביל ( לדוגמה, ImageJ).
2. העתק את נתוני עוצמת הקרינה בכל נקודות הזמן מתא המטרה, הרקע ותא הייחוס לגיליון אלקטרוני.
   1. הפחת את עוצמת הרקע ואת עוצמת התא התייחסות מערכי האינטראקציה של תא המטרה לתקן photobleaching שנגרם במהלך תהליך הרכישה. לבצע רקע ותיקונים התא התייחסות עבור כל נקודת זמן.
   2. לנרמל את הנתונים FRAP מתוקן על עוצמת הקרינה הראשונית לפני הלבנה על ידי חלוקת כל ערך על ידי הקרינה הראשונית.
   3. כדי להשיג עקומות FRAP, להגדיר את הבסיס לעוצמת הקרינה מיד לאחר אקונומיקה על ידי הפחתת מערכי העוצמה של כל נקודת זמן.

תוצאות

כאן, אנו מציגים 3D-FRAP מיקרוסקופית כמו טכניקה לא פולשנית ללמוד את הפער junctional הפער של מירנה ניאון בתוך cardiomyocytes בילוד. Cardiomyocytes מבודד חשף דפוס אופייני α actinin מבודד והכיל לוחות גדולים של Cx43 לאורך גבולות התא תא ( איור 1A , ראשי חץ לבנים), אשר אפ?...

Discussion

MiRNAs הם שחקני מפתח בפיזיולוגיה הסלולרית והוצגו כמולקולות איתות באמצעות שימוש - בין היתר - GJs כנתיב עבור חילופי בין תאיים ^{11 , 12 , 22} . הפרוטוקול הנוכחי מציג במבחנה לחיות תאים תא הדמיה טכניקה לאפיין את זה Shifting GJ תלו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
neonatal NMRI mice	Charles River
Gelatin	Sigma Aldrich	G7041	0.1% solution in PBS, sterilized
PBS	Pan Biotech	P04-53500
Dulbecco´s modified medium	Pan Biotech	P04-03550
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum	Pan Biotech	P30-3306
Cell culture plastic	TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Fisher Scientific	88281
HBSS	Thermo Fisher Scientific	88281	included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic	Dharmacon	CP-004500-01-05	dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S3139
Sodium phosphate dibasic	Carl Roth	T877.2
Potassium chloride	Sigma	P9333
Magnesium chloride	Serva	28305.01
Sodium succinate	Carl Roth	3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution	Merck	L2153
4-well- Glass bottom chamber slides	IBIDI	80827	coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II	Lonza		program G-009 was used for Electroporation
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Excel software	Microsoft
α-actinin antibody	Abcam	ab9465	dilution 1:200
Connexin43 antibody	Santa Cruz	sc-9059	dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11005	dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034	dilution 1:300
Connexin43 siRNA	Thermo Fisher Scientific	AM16708 ID158724	final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
CellTrace Calcein Red-Orange	Thermo Scientific	C34851
DAPI nuclear stain	Thermo Scientific	D1306