用于植物/微生物分子相互作用和信号的同时系统分析的水培共培养系统

摘要

所描述的水培共培养系统支持具有金属筛网的完整植物，并将其与细菌共培养。然后可以单独收集植物组织，细菌和分泌的分子用于下游分析，同时允许研究植物宿主和相互作用的微生物或微生物群的分子响应。

摘要

模拟天然植物 - 微生物相互作用的实验设计对于描绘复杂的植物 - 微生物信号传导过程非常重要。 拟南芥 - 根癌土壤杆菌 提供了一个优秀的模型系统来研究细菌发病和植物相互作用。以前对植物 - 土壤杆菌相互作用的研究在很大程度上依赖于植物细胞悬浮培养物，植物的人造伤害，或通过合成化学品人工诱导微生物毒力因子或植物防御。然而，这些方法与植物中的自然信号不同，其中植物和微生物以空间和时间的方式识别和响应。这项工作提出了一个水培共培养系统，其中完整的植物由金属筛网支持并与农杆菌共培养。在这种共培养系统中，没有合成的植物激素或诱导微生物的化学物质补充抗性毒性或植物防御。水培共培养系统非常类似于天然植物-微生物相互作用和在植物信号动态平衡。植物根部可以从含有农杆菌的培养基中分离出来，同时有效地研究植物宿主和相互作用的微生物的信号传导和反应。在任何给定的时间点/间隔，可以分别收集植物组织或细菌用于各种"omics"分析，证明该系统的功效和功效。水培共培养系统可以容易地适应于研究:1）不同植物 - 微生物系统的相互信号转导，2）植物宿主与多种微生物物种（ 即微生物菌群或微生物群落）之间的信号传导，3）营养物质和化学物质如何牵连在植物微生物信号传导中，以及4）微生物如何与植物宿主相互作用，并有助于植物对生物的耐受性非生物压力。

引言

植物相关微生物在生物地球化学循环，生物修复，减缓气候变化，植物生长和健康以及植物对生物和非生物胁迫的耐受方面起重要作用。微生物与两个直接通过植物细胞壁接触，并通过化学分泌间接和信令^1，2，3株植物相互作用。作为无生物，植物已经开发出直接和间接的机制来抵抗病原体的感染。直接防御包括结构防御和防御蛋白的表达，而间接防御包括次级代谢产物的植物的生产和生物拮抗对侵入病原体^4,5的吸引力。植物来源的根系分泌物，分泌物，粘液，粘液和裂解物改变根际的物理化学性质，以吸引或排斥微生物往其主人⁶ 。根分泌的化学成分是物种特异性的，从而作为选择性过滤器，其允许某些能够识别这些化合物的微生物在根际^6中繁殖。因此，相容的微生物物种可以被刺激以激活和增强它们的相互关系，这是为了植物宿主¹的益处或损害。

在根际理解植物-微生物相互作用的关键是增强植物生产力和生态系统功能，因为大多数微生物和化学暴露的发生在根部结构和土壤-空气界面^{2，6，7，8。}然而，考虑地下植物 - 微生物的相互作用和互惠的反应是一个挑战，因为它有趣的复杂和动态的性质，以及在紧密可控的生长条件下缺乏具有天然根结构和植物形态的合适的实验模型。作为研究最多的植物病原体之一， 农杆菌感染了广泛的农业和园艺重要植物，包括樱桃，苹果，梨，葡萄和玫瑰⁹ 。 农杆菌是了解植物病原体相互作用的一个重要的模式生物，是在植物转化和植物工程^{10，11，12，13，14}的有力工具。

分子植物 - 农杆菌相互作用已经被很好地研究了几十年，目前对农杆菌致病性的理解是广泛的^{9 ，}F"> ^{11，15，16。} 土壤杆菌的致病性在很大程度上归因于感知植物衍生的信号，从而导致在其毒力方案和细胞-细胞通信的精细调制的其演进能力，所谓群体感应^17. 土壤杆菌毒力程序由几种根际信号调节，涉及两组双组分系统，即ChvG / I系统和VirA / G系统，根际酸性条件激活了chvG / I ， virA / G的转录，以及涉及农杆菌致病性的其他几个基因，包括virE0 ， virE1 ， virH1 ， virH2和VI型分泌系统（T6SS）的基因^18。植物衍生的酚类化合物，包括乙酰丁香酮（4'-羟基-3'，5 '二甲氧基苯乙酮），激活VirA / G 2成分系统通过磷酸化信号传导机制¹⁹ 。 VirA / G然后激活整个vir调节子，导致将来自其肿瘤诱导（Ti）质粒的称为转移DNA（T-DNA）的〜20kb细菌DNA片段转移并整合到植物核^16中 。 T-DNA携带负责合成植物激素吲哚-3-乙酸（IAA）（ iaaM和iaaH ）和细胞分裂素（ ipt ）的基因 ，一旦在植物细胞中表达，就会产生大量的这些植物激素。这导致异常组织增殖和植物肿瘤的发展，被称为冠瘿病，这是植物^{9，11，20中}的慢性和复苏问题。 IAA还与水杨酸和γ-氨基丁酸共同作用以抑制农杆菌毒力或减少农杆菌米群体感应^{（QS）17，21，22。}为了对抗这种压制，T-DNA还携带基因冠瘿碱的合成，其激活农杆菌群体感应来促进土壤杆菌的致病性，并且还用作对于该病原体^22,23的营养源。

尽管对农杆菌 -植物相互作用的总体了解以及由此产生的T-DNA转移到植物宿主中，但在相互作用的初始阶段的复合信号传导事件了解甚少。这部分是由于传统方法调查农杆菌植物信号传导的局限性。植物细胞悬浮培养和人工位点特异性伤害通常用于研究分子植物 - 微生物相互作用^{24 ，}。EF"> ^26,27然而，细胞悬浮液缺乏典型植物形态学，特别是，植物悬浮细胞不具有根结构和根渗出物，其是用于激活微生物趋化性和毒力^28,29非常重要的植物形态学的维持。和根部结构已经通过人为伤害植物，这有利于特定于站点的感染，从而导致在检测诱导的植物防御相关基因的直接感染植物组织^30，31寻址的。然而，人工伤人是从病原体感染性质显著不同，特别是作为伤人导致茉莉酸（JA）的积累，其全身地与天然植物信令和防御²⁶干涉。另外，合成的化学物质通常用于人工诱导植物宿主反应或病原体毒力。虽然反射在植物中的浓度这样的化学化合物的补充是可行的，例如补充不占根分泌物扩散逐渐进入周围根际，其产生由微生物^28,32感测的趋化梯度。鉴于常规方法研究植物 - 微生物相互作用的局限性，所获得的数据的准确性和深度可能受到阻碍和限制，而常规方法产生的知识可能不会直接在植物中转化。植物 - 农杆菌信号传导的许多方面尚未完全了解，特别是在相互作用的早期阶段，当疾病症状尚未发展时。

为了修正常规方法的局限性，本文提出了一种廉价，可控的，灵活的水培c摄像系统，允许研究人员在分子植物 - 微生物相互作用的初始阶段更深入地了解复杂的信号和反应途径。水耕已被广泛用来研究植物营养素，根渗出物，生长条件，和金属毒性的植物^33，34的影响。水培模型有几个优点，包括小空间要求，各种植物组织的可及性，营养/环境条件的严格控制以及病虫害防治。与琼脂/植物电镀技术相比，水培系统对植物生长的限制也较少，其通常限制2-3周后的生长。重要的是，全植物结构的维护便于必要微生物趋化性和毒力感应^8,29自然根分泌。系统描述这里的床比其它的^33，34简单，劳动密集程度较低。它使用的部件较少，不需要标准剪刀以外的任何工具。它使用金属网（与尼龙³³相反）作为植物生长的强支撑和通过摇动以支持微生物生长的无菌条件下通气的简单方法。此外，该系统可以使用各种尺寸的金属网来支持植物生长，其适应不同植物物种而不限制其根部的宽度。

在这里介绍的水培共培养系统中，植物在无菌水培系统中培养，其中植物根分泌支持接种细菌生长的有机化合物。在这种共培养系统中，补充了人造化学物质，如植物激素，防御诱发剂或毒力诱导化学品，反映了天然细胞在植物 - 微生物相互作用期间进行稳态。利用这种水培共培养系统，可以同时测定农杆菌感染后的拟南芥 Col-0根组织中的基因表达，以及用拟南芥共培养的农杆菌基因的活化。进一步表明，该系统适用于研究农杆菌与植物根系的连接以及植物根系分泌物分布，与土壤杆菌共培养（感染）（ 图1 ）。

图1:具有样品分析的水培共培养系统概述。将植物生长在网格顶部（在网格上方的芽上），将根浸入水培培养基中，然后用细菌f或共培养。然后分离植物组织和细菌用于同时提取和分析。这个数字已经从参考文献^35中修改过。

研究方案

实验规划

1. 确定实验的具体目标。
2. 请阅读下面的整个协议。确定哪些部分与具体目标相关，以及是否需要进行任何修改。见下面的例子。
   1. 考虑实验是否将使用拟南芥植物和根癌土壤杆菌细菌，如下所述，或另一种植物 - 微生物组合。
      注意:虽然可以使用各种植物种类，植物根部的厚度可能需要不同尺寸的网格（步骤3.3），生长参数（步骤3.10-3.11和4.4）以及水培池尺寸和中等体积（步骤4.2）也可能需要调整（ 图2 ）。微生物可以容易地作为纯培养物，混合物种（财团）或环境样品（微生物）接种，但任何变化都可能影响方案，特别是第4.5步。
   2. 考虑一下将用于分析样品的实验类型。
      注意:荧光显微镜（步骤5）需要用荧光报告基因构建体标记的生物体。
3. 设计适当的控制。包括没有接种有对照细菌的幼苗的水栽池和没有接种细菌的对照幼苗。
4. 用适当数量的种子和水培池计划实验。考虑对照，生物重复（至少3个）和所有分析所需的组织量。
5. 确定实验目标的合适的共培养长度（步骤4.8）。
6. 根据需要修改以下任何步骤。

图2.在水培系统中可以栽培的其他植物的实例，由P支持金属网拉丝。一套用于各种植物种子和栽培的金属网的兼容性。 （ A ）不锈钢304型焊缝3×3目×.047" 蚕豆蚕丝（ B ）不锈钢304型焊缝4×4目×.035" 玉米线。 （C）不锈钢型304 weldmesh 4×4网格×0.032"直径导线对大豆 （大豆）。（D）不锈钢型304 weldmesh 6×6×网状0.047"直径导线对萝卜 （冬萝卜）。 （ E ）不锈钢304型焊缝6×6目×.047"用于小麦的直径线（ F ）不锈钢304型焊缝6×6目×.035" 黄瓜丝。这个数字已经从参考文献^35中修改过。955fig2large.jpg"target ="_ blank">请点击此处查看此图的较大版本。

2.植物种子表面灭菌

1. 在微量离心管中涡旋（高速）约200种拟南芥的种子和500μL的去离子水。对于具有较大种子的植物，使用大管来促进表面灭菌。
2. 在台式微量离心机中以约9,000 xg离心30秒钟。用移液器去除水（上清液）。
3. 向种子中加入300μL的2％次氯酸钠并涡旋。在室温下放置1分钟。对于具有较大种子的植物物种，使用较大体积来覆盖种子。
4. 在台式微量离心机中以约9,000 xg离心30秒。使用移液管去除次氯酸钠溶液。
5. 向种子中加入500μL无菌去离子水并涡旋。离心机约为9,000 xg30秒，并使用无菌移液器取出水。
6. 重复步骤2.5另外4次。
7. 向种子中加入500μL的70％乙醇，并涡旋。在室温下放置1分钟。
8. 在台式微量离心机中以约9,000 xg离心30秒。使用移液器去除70％乙醇。
9. 重复步骤2.5另外5次。
10. 将灭菌的种子重新悬浮于500μL无菌超纯水中。

3.植物种子萌发和半固体栽培

1. 制备半固体Murashige和Skoog（MS）培养基:2.165 g / L MS基础盐; 10g / L蔗糖; 0.25 g / L MES;和59mL / L B5维生素混合物，pH 5.75，具有4g / L植物药。
2. 高压灭菌MS培养基。倒入25毫升无菌深培养皿（100 x 25毫米² ）。
3. 对于每个培养皿，切出90×90平方毫米不锈钢网。
   注意: 拟南芥的推荐网格 /标准等级为304（标准级），网格数（每线性英寸的孔数）为40×40，线径为0.01"（0.0254cm），较大的水平槽需要较大的网格或更高的平台。
4. 弯曲每个正方形网格的角落就足够了，使网格适合Petri板。将角部以90°的角度弯曲到网格的大部分，以允许网格由角落支撑，为根部开发留下足够的空间（ 图3a ）。
5. 将切割的网格方格放入烧杯中，用铝箔盖住，并用30分钟的干燥循环通过高压灭菌灭菌。
6. 一旦培养基在培养皿中固化并且网状物是无菌的，则将每个消毒的网格方形放置在半固体培养基的顶部，使弯曲的角落朝下。
7. 推动网格，使角落穿透介质，大部分网状物接触介质的顶部表面（>图3b）。
8. 使用200μL转移移液器来绘制单个表面灭菌的拟南芥种子（种子将由于真空力而停留在移液管的尖端），并轻轻地将每个种子转移到网格顶部。放置种子，使其适当地适应实验需要（ 例如， 4 6个种子/板）。
9. 用盖子密封培养皿，将多孔手术胶带放在边缘周围。
10. 通过将整个培养皿放置在4℃，在黑暗中2 d（ 例如，包裹在锡箔中以模拟黑暗）来分层种子。
11. 在22-24℃培养培养皿中的种子16小时光周期10-14天（ 图3c ）。

图3:水培植物 - 微生物共培养系统。左边的nel是一个流程图，概述了组合和操作水培共培养系统的六个关键步骤。正确的小组演示了当研究拟南芥 - 农杆菌相互作用时水培共培养系统的实际实验材料，设备和操作程序。现在显示植物或细菌取样的接种步骤和最后步骤。这个数字已经从参考文献^35中修改过。 请点击此处查看此图的较大版本。

水培共培养系统

1. 制备液体Murashige和Skoog（MS）培养基:2.165g / L MS基础盐，10g / L蔗糖，0.25g / L MES和59mL / L B5维生素混合物，pH 5.75。
2. 高压灭菌介质。倒入18毫升的无菌圆柱形玻璃或透明塑料罐（结晶盘，100 x 80毫米2）用无菌盖。
   注意:通过将其包裹在铝箔中并进行高压灭菌来预防罐和盖。
3. 在灭菌的流动罩中，使用无菌钳子将每个网格平方从10-14天的幼苗从半固体培养基转移到水培圆柱形罐（ 图3d ）。使用多孔手术胶带将盖子密封在罐体上。
4. 在22-24℃下在槽中的网上培养72小时的幼苗，并在16小时光周期下振荡50rpm进行曝气（ 图3e ）。
   注意:这允许植物在与微生物接种（共培养）之前适应水培环境。这个等待期也将允许在接种之前意外的微生物污染是明显的。
   1. 在潜伏期结束前一天开始下一步。
5. 在AB培养基中培养A.根癌土壤杆菌（0.5％w / v酵母提取物，0.5％w / v胰蛋白胨，0.5％w / v蔗糖，50mM MgSO ₄ ，pH7.0）在28℃振荡过夜直到培养物在600℃达到1.0的最终光密度nm（OD ₆₀₀ ），使用分光光度计测量，未接种的AB培养基为空白。
   注意:1.0的OD ₆₀₀相当于约10 ^9个细胞/ mL。
6. 在等体积的0.85％NaCl中洗涤根癌土壤杆菌三次。重悬于等体积的无菌双蒸水中。
7. 在接种之前，仔细检查带有幼苗的罐，以确保没有污染;未受污染的坦克中的介质应清晰透明。
   1. 丢弃任何有混浊液体（污染物）的坦克，并对其余的坦克进行编号。从每个编号的罐中取少量（20μL）的水培培养基，并将其放在装有Luria肉汤（LB）的培养皿上。孵化菜在28°C。
8. 立即将50μL的根癌土壤杆菌悬浮液（大约5×10 ^7个细胞，从OD ₆₀₀估计）加入到每个编号的水培槽中。在22-24℃下用16小时光周期将培养拟南芥幼苗和根瘤农杆菌 ，并以50rpm摇动 （ 图3f ）。
   1. 从步骤4.7.1检查点样的LB板。 12和28小时孵化后验证坦克的不育性。如果有任何污染，请勿使用相应编号的罐（接种细菌）进一步下游测定。
9. 如果需要，通过从罐中移除培养基样品并用分光光度计测量OD ₆₀₀ ，从未接种对照的培养基作为空白，以规则的间隔监测根癌农杆菌的生长（ 图4 ）。
   没有TE:7 d后，植物病症状明显（ 图5 ）。
10. 通过提起网板从细菌悬浮液中分离拟南芥根;此步骤的时间取决于下游流程。详见步骤5-8。
11. 如果使用根进行后续分析，请立即用双蒸水冲洗根部。如果使用叶子或其他组织，切断组织。对于RNA分析，请立即执行步骤7.1。

图4:水培共培养系统中的农杆菌生长。每4小时监测植物宿主（ 拟南芥 ）存在或不存在的农杆菌生长。 农杆菌细胞在AB培养基O / N中生长，用0.85％NaCl洗涤3次，并接种到水培系统中，用或w没有拟南芥共培养，从初始OD ₆₀₀约0.1。 OD ₆₀₀值是三个生物重复的平均值，标准偏差（ OD ₆₀₀为1.0 = 1×10 ^9个细胞/ mL）。

图5:共培养期间的代表性植物表型和可观察到的疾病症状。在接种后4天内，与非接种植物（ B ）相比，没有可见的疾病症状（ A ）。在7天的共培养（感染）后，感染植物（ C ）中观察到疾病症状，而非接种的植物保持健康（ D ）。

荧光显微镜

1. 使用携带自体荧光蛋白的报道构建物的根瘤土壤杆菌在步骤4.5中进行协同设置。
   注意:在此使用表达pCherry的修饰的pJP2质粒，dsRed ³⁶的衍生物。
2. 在步骤4.8中进行适当的共培养（ 例如 48小时）后，使用无菌剪刀分离个体次生根（主根的侧枝）。
3. 用双蒸水冲洗根以去除松散结合的物质。将每根根在30微升的水中浸在显微镜载玻片上，盖上玻璃盖玻片。
4. 用指甲油密封盖玻片的边缘以防止根部脱水。
5. 通过荧光显微镜观察根癌农杆菌对拟南芥根的附着。
   注意:这里，使用来自氦氖（He-Ne）543/594nm激光器的激发的共聚焦显微镜在590-630nm下在倒数63X水透镜物镜上显现pCherry红色荧光，数值孔径为1.4（ 图6）。

图6:通过共聚焦显微镜测定的农杆菌根附着物。通过来自氦氖（He-Ne）543/594nm激光的激发，在590-630nm处观察pCherry红色荧光标记的农杆菌 。可视化在数值孔径为1.4的倒置63X水透镜物镜下进行。比例尺=11μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

细菌成绩单分析

1. 在步骤4.8中进行适当的共培养（ 例如 8小时）后，如步骤4.9那样将根与水培培养基分开。将1.5mL的水培培养基转移至1.5mL的微量离心管和离心机以12,000xg离心2分钟以沉淀细胞。
2. 去除上清液。将另外1.5 mL的水培培养基转移到相同的1.5 mL微量离心管中，并以12,000 g离心2分钟以沉淀细胞。
3. 去除上清液。
   注意:通过将样品冷冻至-80°C直至使用，此协议可暂停。
4. 使用标准方法³⁷或具有DNA酶处理的合适的商业RNA分离和纯化试剂盒从根癌农杆菌细胞中提取RNA以避免DNA污染。
   注意:通过在-80°C下将RNA的等分部分冻结直到使用，可以暂停该协议。
5. 使用分离的RNA进行各种分析，使用标准方法，包括以下内容。
   1. 根据制造商的方案使用商业微阵列来检测在共培养对照中差异表达的基因组文化。
   2. 使用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测特异性基因的表达或验证微阵列数据³⁸ 。

7.植物成绩单分析

1. 在步骤4.8中进行合适的共培养（ 例如 8小时）后，如步骤4.9中那样从水培培养基中分离根，或根据需要分开其它组织。立即将大约150毫克的根或其他植物组织置于液氮中。
   注意:通过将样品冷冻至-80°C直至使用，此协议可暂停。
2. 使用研钵和研杵将冷冻样品研磨成液氮粉末。
3. 使用标准方法³⁹或使用DNase处理的合适的商业RNA分离和纯化试剂盒从粉末中提取RNA，以避免DNA污染。
   注意:通过冻结RNA的等分试样，可以暂停该协议-80°C直到使用。
4. 使用分离的RNA进行各种分析，使用标准方法，包括以下内容。
   1. 根据制造商的方案使用商业微阵列检测在共培养对照植物中差异表达的基因组。
   2. 使用qRT-PCR检测特定基因的差异表达或验证微阵列数据³⁸ 。

8. Secretome分析

1. 在步骤4.8中进行适当的共培养（ 例如， 72小时）后，如步骤4.9那样将根与水培培养基分开。将18 mL的水培培养基通过0.2μm孔过滤器进行灭菌，使其成为50mL锥形管。
2. 在-80°CO / N下冷冻样品。
3. 松开50mL锥形管上的盖子并将其放在冷冻干燥机中36小时。继续存储或处理样品（如des用于HPLC分析和化合物检测。
   注意:协议可以在这里暂停。
4. 在可密封的试管中将每个样品重悬在5 mL双蒸水中。
5. 加入5mL乙酸乙酯，并将反应管混合数次。
6. 允许相在室温下分离5分钟。
7. 通过移液将顶部（有机相）转移到新的容器。如果需要，汇集多个有机部分。
8. 在温和的氮气流（约45分钟）下干燥。
9. 将样品重新悬浮在合适的HPLC溶液中（ 如 100％甲醇）。
10. 按照标准方法进行HPLC ⁴⁰ 。
11. 通过适当的方式检测化合物。
    注意:这里使用电喷雾离子化飞行时间质谱（ESI-TOF-MS） ⁴⁰ 。

结果

水培栽培系统的生长

根癌土壤杆菌 C58的生长曲线在共培养的初始16小时中显示出显着的滞后期，随后在与拟南芥 Col-0共培养时达到非常稳定的生长，直到约0.9的最大OD ₆₀₀开始于接种后48小时相比之下，在没有拟南芥的对照培养物中基本上没有观察到细菌生长（ 图4 ）。这些结果?...

讨论

鉴于根分泌的逐渐性质， 在植物中产生的毒力诱导化学物质的浓度及其对动植物 - 微生物相互作用的影响发生在空间和时间梯度上。在这种水培共培养系统中，不补充诱导微生物毒力或植物防御的合成植物激素或化学物质。相比之下，使用常规方法，添加合成化学品，如乙酰丁香酮，会产生突然的，人为的浓度峰值。因此，这种水培共培养系统更加模仿自然环境，微生物和宿主植物在空间...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0)	Arabidopsis Biological Resource Centre	CS7000	https://abrc.osu.edu/order-stocks
bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58)	University of Washington	N/A
labeled bacteria	in-house		optional, depends on downstream analyses
vortex	(various)
microcentrifuge tubes	(various)
microcentrifuge	(various)
5% sodium hypochlorite	(various)
double distilled water	(various)
autoclave	(various)
micropipette	(various)
70% ethanol	(various)
Murashige and Skoog (MS) basal salts	Sigma-Aldrich	M5524
sucrose	(various)
MES	(various)
B5 vitamin mix	Sigma-Aldrich	G1019
phytoagar	(various)
Deep Petri dishes	(various)
stainless steel mesh	Ferrier Wire Goods Company Ltd	N/A	grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01
micropore tape, 1"	3M	1530-1
diurnal growth chamber	(various)
cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm	Pyrex	3250	other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment
flow hood	(various)
forcepts	(various)
yeast extract	(various)
tryptone	(various)
MgSO4	(various)
shaking incubator	(various)
spectrophotometer	(various)
NaCl	(various)
shaker	(various)
scissors	(various)		optional, depends on downstream analyses
fluorescence microscope	(various)		optional, depends on downstream analyses
microscope slides and cover slips	(various)		optional, depends on downstream analyses
nail polish	(various)		optional, depends on downstream analyses
Bacterial RNA extraction kit	(various)		optional, depends on downstream analyses
plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit)	Qiagen	74903 or 74904	optional, depends on downstream analyses
material and equipment for qRT-PCR	(various)		optional, depends on downstream analyses
material and equipment for microarray analysis	(various)		optional, depends on downstream analyses
liquid nitrogen	(various)		optional, depends on downstream analyses
mortar and pestle	(various)		optional, depends on downstream analyses
0.2 µm pore filter	(various)		optional, depends on downstream analyses
50 mL conical tubes	(various)		optional, depends on downstream analyses
freeze dryer	(various)		optional, depends on downstream analyses
sealable test tubes	(various)		optional, depends on downstream analyses
ethyl acetate	(various)		optional, depends on downstream analyses
nitrogen gas	(various)		optional, depends on downstream analyses
material and equipment for HPLC	(various)		optional, depends on downstream analyses
material and equipment for ESI-TOF-MS	(various)		optional, depends on downstream analyses