JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описанная гидропонная система кокультивации поддерживает интактные растения с металлическими сетчатыми экранами и кокультивирует их бактериями. Растительные ткани, бактерии и секретируемые молекулы затем могут быть отдельно собраны для последующих анализов, одновременно позволяя исследовать молекулярные реакции как хозяев растений, так и взаимодействующих микробов или микробиомов.

Аннотация

Экспериментальная разработка, имитирующая естественные взаимодействия с растениями-микробами, очень важна для определения сложных процессов передачи сигналов микроорганизмов растений. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Обеспечивает отличную модельную систему для изучения бактериального патогенеза и взаимодействия растений. Предыдущие исследования взаимодействия растений -Агробактерий в значительной степени опирались на культуры суспензий растительных клеток, искусственное ранение растений или искусственную индукцию микробных факторов вирулентности или защиту растений синтетическими химическими веществами. Однако эти методы отличаются от естественной сигнализации в planta , где растения и микробы распознают и реагируют в пространственных и временных манерах. В этой работе представлена ​​гидропонная система кокультивации, в которой интактные растения поддерживаются сетками из металлической сетки и кокультивируются Agrobacterium . В этой системе кокультивации нет синтетического фитогормона или химического вещества, которое индуцирует micrБожественная вирулентность или защита растений дополняются. Гидропонная система кокультивации очень похожа на естественные взаимодействия растений и микробов и сигнализирует гомеостаз в пласте . Корни растений можно отделить от среды, содержащей Agrobacterium , и сигналы и реакции как хозяев растений, так и взаимодействующих микробов можно исследовать одновременно и систематически. В любой момент времени / интервал растительные ткани или бактерии могут собираться отдельно для различных анализов «омикшей», демонстрируя силу и эффективность этой системы. Гидропонная система кокультивации может быть легко адаптирована для изучения: 1) обратная сигнализация различных систем растений-микробов, 2) сигнализация между хозяином растения и несколькими видами микроорганизмов ( т.е. микробными консорциумами или микробиомами), 3) как связаны питательные вещества и химические вещества В сигнале растений-микробов и 4) как микробы взаимодействуют с хозяевами растений и способствуют устойчивости растений к биотическому oR абиотические стрессы.

Введение

Микроорганизмы, связанные с растениями, играют важную роль в биогеохимическом циклировании, биоремедиации, смягчении последствий изменения климата, роста растений и здоровья и устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам. Микроорганизмы взаимодействуют с растениями как непосредственно через контакт стенки стенки растения, так и косвенно через химическую секрецию и сигнализацию 1 , 2 , 3 . В качестве сидячих организмов растения разработали прямые и косвенные механизмы противодействия инфекции патогенами. Прямые защитные средства включают структурную защиту и экспрессию защитных белков, тогда как косвенная защита включает в себя вторичное производство метаболитов растений и привлечение организмов, антагонистических к вторгающимся патогенам 4 , 5 . Вырожденные корневым экссудатом, выделениями, слизи, мусигелем и лизатами изменяют физико-химические свойства ризосферы для привлечения или отталкиванияМикробов к их хозяевам 6 . Химический состав секреции корней является видоспецифичным, тем самым выступая в качестве селективного фильтра, который позволяет некоторым микроорганизмам, способным распознавать такие соединения, процветать в ризосфере 6 . Таким образом, совместимые микробные виды могут стимулироваться для активации и усиления их ассоциаций либо в пользу, либо в ущерб хозяину растения 1 .

Понимание взаимодействия растений и микробов в ризосфере является ключевым фактором повышения производительности растений и функционирования экосистем, поскольку большинство микробных и химических воздействий происходит в корневой структуре и почвенно-воздушном интерфейсе 2 , 6 , 7 , 8 . Тем не менее, изучение взаимодействия подземных растений и микробов и ответных реакций было проблемой из-за его интригующей Сложный и динамичный характер и отсутствие подходящих экспериментальных моделей с естественной структурой корней и морфологией растений в условиях жестко контролируемого роста. В качестве одного из наиболее интенсивно изучали фитопатогенов, Agrobacterium заражает широкий ассортимент растений с сельскохозяйственной и садоводческой значение, в том числе вишни, яблони, груши, виноград и розы 9. Agrobacterium - важный модельный организм для понимания взаимодействия растений с патогенами и является мощным инструментом в трансформации растений и инженерии растений 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .

Молекулярное растение-взаимодействие Agrobacterium хорошо изучено в течение нескольких десятилетий, а современное понимание патогенности Agrobacterium обширно 9 ,F "> 11 , 15 , 16. Патогенность Agrobacterium в значительной степени объясняется его развитыми возможностями восприятия сигналов, полученных из растений, что приводит к тонкой модуляции его программы вирулентности и связи между клетками, так называемому восприятию кворума 17 . Программа вирулентности Agrobacterium регулируется несколькими сигналами, доступными в ризосфере, и включает в себя два набора 2-компонентных систем, систему ChvG / I и систему VirA / G. Кислотные условия в ризосфере активируют транскрипцию chvG / I , virA / G , И несколько других генов, участвующих в патогенезе Agrobacterium , включая virE0 , virE1 , virH1 , virH2 и гены системы секреции типа VI (T6SS) 18. Фенольные соединения растительного происхождения, включая ацетозиригон (4'-гидрокси-3 ', 5 '-диметоксиацетофенон), активировать VIrA / G 2-компонентная система через механизмы сигнализации фосфорилирования 19 . Затем VirA / G активирует весь регулятор vir , что приводит к переносу и интеграции бактериального фрагмента ДНК размером 20 кБ, называемого передаточной ДНК (Т-ДНК) из его индуцирующей опухоль (Ti) плазмиды в ядро ​​растения 16 . Т-ДНК несет гены, ответственные за синтез растительных гормонов индол-3-уксусной кислоты (IAA) ( iaaM и iaaH ) и цитокинина ( ipt ), и один раз экспрессируется в растительных клетках, образуется большое количество этих фитогормонов. Это приводит к аномальной пролиферации тканей и развитию опухоли растений, известной как болезнь коронального желчного пузыря, что является хронической и нерегулярной проблемой для растений 9 , 11 , 20 . IAA также действует совместно с салициловой кислотой и гамма-аминомасляной кислотой, чтобы подавить вирулентность Agrobacterium или уменьшить Agrobacteriu М кворум (QS) 17 , 21 , 22 . Чтобы противостоять этой репрессии, Т-ДНК также несет гены для биосинтеза опиона, который активирует чувствительность кворума Agrobacterium, чтобы способствовать патогенности Agrobacterium, а также служит источником питательных веществ для патогена 22 , 23 .

Несмотря на полное глубокое понимание взаимодействия Agrobacterium- plant и результирующей передачи Т-ДНК в хозяин растения, сложные сигнальные события на начальной стадии взаимодействия менее понятны. Это частично связано с ограничениями обычных подходов к исследованию сигнализации Agrobacterium- plant. Культуры суспензии клеток растений и искусственное рандование, специфичное для конкретного участка, обычно используются для изучения молекулярных взаимодействий с микроорганизмами 24 ,Ef "> 26 , 27. Однако клеточные суспензии не имеют типичной морфологии растений, в частности, суспензионные клетки растений не имеют корневых структур и корневых экссудатов, которые очень важны для активации микробного хемотаксиса и вирулентности 28 , 29. Содержание морфологии растений И корневая структура была устранена искусственно ранившимися растениями, что облегчает сайт-специфическую инфекцию, что приводит к обнаружению индуцированных генов, связанных с защитой растений, в непосредственно инфицированной растительной ткани 30 , 31. Однако искусственное ранение значительно отличается от патогенной инфекции в природе , В частности, поскольку ранение приводит к накоплению жасмоновой кислоты (JA), которое системно препятствует передаче сигналов естественного растения и защите 26. Кроме того, синтетические химикаты обычно используются для искусственного стимулирования реакции хозяина растенийИли вирулентности патогена. Хотя возможно добавление таких химических соединений, отражающих концентрацию в плазме, такое добавление не учитывает диффузию корневых экссудатов постепенно в окружающую ризосферу, которая генерирует хемотаксический градиент, определяемый микробами 28 , 32 . Учитывая ограничения обычных подходов к изучению взаимодействий растений и микробов, точность и глубина полученных данных могут быть затруднены и ограничены, а знания, полученные из обычных подходов, могут не переводить непосредственно в planta . Многие аспекты сигнальной передачи растений - Agrobacterium еще не полностью поняты, особенно на ранней стадии взаимодействия, когда симптомы болезни еще не развиты.

Чтобы изменить ограничения обычных подходов, эта работа представляет собой недорогую, жестко контролируемую и гибкую гидропонику cКоторая позволяет исследователям глубже проникнуть в сложные сигнальные и ответные пути на начальном этапе взаимодействия молекулярных растений с микробами. Гидропоника широко используется для изучения питательных веществ растений, корневых экссудатов, условий роста и воздействия металлической токсичности на растения 33 , 34 . Существует несколько преимуществ гидропонных моделей, в том числе небольшие пространственные требования, доступность различных растительных тканей, жесткий контроль над питательными / экологическими условиями и борьба с вредителями / болезнями. Гидропонические системы также менее ограничивают рост растений по сравнению с методами агара / фитогара, которые обычно ограничивают рост через 2-3 недели. Важно отметить, что содержание цельнозерновых структур способствует естественной корневой секреции, необходимой для микробного хемотаксиса и индукции вирулентности 8 , 29 . Система descriПостель здесь проще и менее трудоемко, чем альтернативы 33 , 34 . Он использует меньше деталей и не требует каких-либо инструментов, кроме стандартных ножниц. Он использует металлическую сетку (в отличие от нейлона 33 ) в качестве сильной поддержки роста растений и простой метод аэрации в стерильных условиях путем встряхивания для поддержки роста микроорганизмов. Кроме того, система может использовать металлическую сетку различных размеров для поддержки роста растений, в которой размещаются разнообразные виды растений, не ограничивая ширину их корней.

В представленной здесь системе гидропонной кокультивации растения выращивают в стерильной гидропонной системе, где корни растений выделяют органические соединения, поддерживающие рост инокулированных бактерий. В этой системе кокультивации никакие искусственные химические вещества, такие как растительные гормоны, защитный элиситор или вызывающие вирулентность химические вещества, не дополняются, что отражает естественную клетку-сигнальный гомеостаз во время взаимодействия растений с микробами. С помощью этой гидропонной системы кокультивации можно было одновременно определить экспрессию гена в корневой ткани Arabidopsis thaliana Col-0 при инфицировании Agrobacterium , а также активацию генов Agrobacterium при кокультивации с Arabidopsis . Кроме того, было продемонстрировано, что эта система подходит для изучения присоединения Agrobacterium к корням растений, а также к профилю секреторного корня растения, при кокуляции (инфекции) Agrobacterium ( рис. 1 ).

figure-introduction-11204
Рисунок 1: Обзор системы гидропонной кокультивации с анализом проб. Растения выращивают поверх сетки (побеги над сеткой), причем корни погружаются в гидропонную среду, которая затем инокулируется бактериями fИли сокультура. Затем растительные ткани и бактерии разделяют для одновременных экстракций и анализов. Эта цифра была изменена из ссылки 35 .

протокол

1. Экспериментальное планирование

  1. Определите конкретные цели эксперимента.
  2. Прочитайте весь протокол ниже. Определите, какие разделы имеют отношение к конкретным целям и должны ли быть сделаны какие-либо изменения. Ниже приведены примеры.
    1. Рассмотрим, будут ли в экспериментах использовать растения A. thaliana и бактерию A. tumefaciens , как показано ниже, или другую комбинацию растений-микробов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя можно использовать различные виды растений, толщина корней растений может потребовать сетку разного размера (шаг 3.3) и параметры роста (этапы 3.10-3.11 и 4.4) и размер гидропонного резервуара и средний объем (этап 4.2) также может потребовать корректировки ( рисунок 2 ). Микробы могут быть легко привиты как чистые культуры, смешанные виды (консорциумы) или из образцов окружающей среды (микробиомы), но любые изменения могут повлиять на протокол, особенно на этапе 4.5.
    2. РассмотримТипы экспериментов, которые будут использоваться для анализа образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Флуоресцентная микроскопия (этап 5) требует организмов, которые помечены флуоресцентной репортерной конструкцией.
  3. Создайте соответствующие элементы управления. Включите гидропонные резервуары без проростков, которые привиты контрольными бактериями и резервуарами с контрольными проростками, которые не привиты бактериями.
  4. Планируйте эксперименты с соответствующим количеством семян и гидропонных резервуаров. Рассмотрите контроль, биологические повторы (минимум 3) и количество ткани, необходимое для всех анализов.
  5. Определите соответствующую длину кокультивации для экспериментальных целей (шаг 4.8).
  6. При необходимости измените все шаги ниже.

figure-protocol-1895
Рисунок 2. Примеры других растений, которые можно культивировать в гидропонной системе, поддерживаемые P Латекс металлической сетки. Совместимость набора металлических сеток для различных семян растений и выращивания. ( A ) Сварная сетка из нержавеющей стали типа 304 3 × 3 меш × .047 «Диаметр проволоки для Vicia faba . ( B ) Сварная сетка из нержавеющей стали типа 304 с проволокой диаметром 4 × 4 меш × 0,20 дюйма для Zea mays . (С) Нержавеющая сталь 304 weldmesh 4 × 4 × сетка .032" диам проволоки для Glycine макс (сои). (D) из нержавеющей стали типа 304 weldmesh 6 × 6 × 0,047" меш диаметр проволоки для Raphanus Sativus (зима редьки). ( E ) Сварная сетка из нержавеющей стали типа 304 6 × 6 меш × .047 «Диаметр проволоки для Triticum spp. ( F ) Сварная сетка из нержавеющей стали типа 304 с сеткой 6 × 6 меш × 0,355 мм для Cucumis sativus . Эта цифра была изменена из ссылки 35 .955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Стерилизация поверхности семян растений

  1. Вихрь (на высокой скорости) приблизительно 200 семян A. thaliana с 500 мкл деионизированной воды в микроцентрифужной пробирке. Для видов растений с более крупными семенами используйте большую трубку для облегчения поверхностной стерилизации.
  2. Центрифуга это примерно 9000 xg в течение 30 с в настольной микроцентрифуге. Удалите воду (супернатант) с помощью пипетки.
  3. Добавьте 300 мкл 2% гипохлорита натрия в семена и вихрь. Оставьте при комнатной температуре в течение 1 мин. Для видов растений с более крупными семенами используйте большие объемы для покрытия семян.
  4. Центрифугируют приблизительно 9000 мкг в течение 30 с в настольной микроцентрифуге. Удалите раствор гипохлорита натрия с помощью пипетки.
  5. Добавьте 500 мкл стерильной деионизированной воды в семена и вихрь. Центрифуга при приблизительно 9000 мкг для30 с и удалите воду с помощью стерильной пипетки.
  6. Повторите шаг 2.5 дополнительно 4 раза.
  7. Добавьте 500 мкл 70% этанола в семена и вихрь. Оставьте при комнатной температуре в течение 1 мин.
  8. Центрифугируют приблизительно 9000 мкг в течение 30 с в настольной микроцентрифуге. Удалите 70% этанол с помощью пипетки.
  9. Повторите шаг 2.5 дополнительно 5 раз.
  10. Ресуспендируют стерилизованные семена в 500 мкл стерильной, ультрачистой воды.

3. Прорастание семян и полутвердое выращивание растений

  1. Подготовьте полутвердую среду Murashige и Skoog (MS): 2.165 г / л MS базальные соли; 10 г / л сахарозы; 0,25 г / л MES; И 59 мл / л B5-витаминной смеси, pH 5,75, с фитогагаром 4 г / л.
  2. Автоклав среды MS. Вылейте 25 мл его в каждую стерильную глубокую чашку Петри (100 х 25 мм 2 ).
  3. Для каждой чашки Петри вырежьте квадрат 90 х 90 мм из сетки из нержавеющей стали.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуемая сетка для A. thaliana < / Em> имеет класс 304 (стандартная оценка), количество ячеек (количество отверстий на линейный дюйм) 40 x 40 и диаметр провода 0,01 дюйма (0,0254 см). Для больших гидропиновых резервуаров требуется более крупный квадрат сетки Или более высоких платформах.
  4. Согните углы каждой квадратной сетки достаточно, чтобы сетка помещалась внутри пластины Петри. Согните углы под углом 90 ° к основной части сетки, чтобы позволить сетке подпираться по углам, оставляя достаточное пространство ниже для развития корня ( рис. 3а ).
  5. Поместите квадраты срезанных ячеек в стакан, накройте алюминиевой фольгой и стерилизуйте автоклавированием с использованием 30-минутного сухого цикла.
  6. Когда среда затвердевает в чашках Петри, а сетка стерильна, поместите каждый стерилизованный квадрат сетки поверх полутвердой среды, а изогнутые углы обращены вниз.
  7. Надавите на сетку так, чтобы углы проникали в среду, и основная часть сетки касалась верхней поверхности среды (> Рисунок 3b).
  8. Используйте пипетку 200 мкл для приготовления отдельных стерилизованных на поверхности семян A. thaliana (семена останутся на кончике пипетки из-за силы вакуума) и аккуратно перенесите каждое семя поверх сетки. Поместите семена так, чтобы они были распределены соответствующим образом для экспериментальных потребностей ( например, 4 6 семян / плита).
  9. Запечатайте пластины Петри крышками, поместив по краю пористую хирургическую ленту.
  10. Стратифицируйте семена, поместив всю чашку Петри при 4 ° C в течение 2 дней в темноте ( например, оберните фольгой для имитации темноты).
  11. Культивировать семена в чашке Петри при 22-24 ° C с 16-часовым фотопериодом в течение 10-14 дней ( рисунок 3c ).

figure-protocol-7054
Рисунок 3: Гидропонная система культивирования микроорганизмов. Левая частьNel представляет собой блок-схему, в которой излагаются шесть основных этапов сборки и эксплуатации системы гидропонной совместной культивации. Правая панель демонстрирует фактические экспериментальные материалы, оборудование и рабочие процедуры для системы гидропонной кокультуры при изучении взаимодействий Arabidopsis-Agrobacterium . В настоящее время показаны шаг инокуляции и конечная стадия отбора растений или бактерий. Эта цифра была изменена из ссылки 35 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Система гидропонной кокультивации

  1. Приготовить жидкую среду Мурашиге и Скуга (MS): 2.165 г / л MS базальные соли, 10 г / л сахарозы, 0,25 г / л MES и 59 мл / л B5 витаминной смеси, pH 5,75.
  2. Автоклав среды. Налейте 18 мл его в каждое стерильное цилиндрическое стекло или прозрачный пластиковый резервуар (кристаллизационные блюда, 100 х 80 мм2) со стерильными крышками.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Предварительно очистите емкости и крышки, обернув их алюминиевой фольгой и автоклавированием.
  3. В стерилизованном вытяжном шкафу используйте стерильные щипцы, чтобы аккуратно перенести каждый квадрат сетки с 10-14-дневных проростков из полутвердой среды в гидропонный цилиндрический резервуар ( рис. 3d ). Уплотните крышки на цистерны, используя пористую хирургическую ленту.
  4. Культивировать сеянцы на сетке в баке в течение 72 часов при 22-24 ° C, с 16-часовым фотопериодом и встряхиванием при 50 об / мин для аэрации ( рисунок 3е ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это позволяет растениям адаптироваться к гидропонной среде до инокуляции (кокультивации) микроорганизмами. Этот период ожидания также позволит случайному микробному загрязнению проявиться до инокуляции.
    1. Начните следующий шаг за день до окончания периода инкубации.
  5. Растите A. tumefaciens в среде AB(0,5% мас. / Об. Дрожжевого экстракта, 0,5% мас. / Об. Триптона, 0,5% мас. / Об. Сахарозы, 50 мМ MgSO 4 , рН 7,0) при 28 ° С сотрясанием в течение ночи до достижения конечной оптической плотности 1,0 при 600 Нм (OD 600 ), как измерено с помощью спектрофотометра, с неинокулированной средой AB в виде заготовки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: OD 600 1,0 составляет примерно 10 9 клеток / мл.
  6. Промывают A. tumefaciens три раза в равном объеме 0,85% NaCl. Ресуспендируют в равном объеме стерильной двойной дистиллированной воды.
  7. Перед инокуляцией тщательно осмотрите резервуар с саженцами, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения; Среда в незагрязненных резервуарах должна быть прозрачной и прозрачной.
    1. Отбросьте любой резервуар с облачной жидкостью (загрязнение) и укажите оставшуюся часть резервуаров. Проведите небольшое количество (20 мкл) гидропонной среды из каждого пронумерованного резервуара и нанесите его на чашку Петри, заполненную бульоном Luria (LB). высиживатьБлюдо при 28 ° C.
  8. Немедленно добавьте 50 мкл суспензии A. tumefaciens (приблизительно 5 × 10 7 клеток, оцененной по OD 600 ) в каждый пронумерованный гидропонный резервуар. Кокультивировать проростки A. thaliana и A. tumefaciens при 22-24 ° C с 16-часовым фотопериодом и встряхивание со скоростью 50 об / мин ( рис. 3f ).
    1. Осмотрите пятнистую пластину LB с шага 4.7.1. После 12 и 28 ч инкубации для проверки стерильности резервуаров. Если есть какое-либо загрязнение, не используйте соответствующий пронумерованный резервуар (инокулированный бактериями) для последующих анализов ниже по течению.
  9. При желании контролировать рост A. tumefaciens через регулярные интервалы путем удаления образца среды из резервуара и измерения OD 600 с использованием спектрофотометра со средой из не-инокулированного контроля в качестве заготовки ( рисунок 4 ).
    НЕТTE: Симптомы заболевания растений должны проявляться через 7 дней ( рис. 5 ).
  10. Разделите A. thaliana корни из бактериальной суспензии, подняв сетчатую пластину; Время этого шага зависит от последующих процессов. Подробнее см. Шаги 5-8.
  11. Если вы используете корни для последующего анализа, быстро промойте корни в двойной дистиллированной воде. При использовании листа или другой ткани отрежьте ткань. Для анализа РНК немедленно перейдите к шагу 7.1.

figure-protocol-12005
Рисунок 4: Рост Agrobacterium в системе гидропонной кокультивации. Наблюдался рост абробактерии в присутствии или в отсутствие хозяина растения ( Arabidopsis ) каждые 4 часа. Ячейки Agrobacterium выращивали в среде AB O / N, промывали 3 раза 0,85% NaCl и инокулировали в гидропонную систему с или wБез совместного использования Arabidopsis , от первоначального OD 600 около 0,1. Значения OD 600 являются средствами трех биологических копий со стандартными отклонениями ( OD 600 1,0 = 1 × 10 9 клеток / мл).

figure-protocol-12787
Рисунок 5: Типичные растительные фенотипы и наблюдаемые симптомы заболевания во время кокультивации. В течение 4 дней после инокуляции симптомы болезни не видны ( А ) по сравнению с неинфицированными растениями ( В ). После 7 дней кокультивации (инфекции) симптомы болезни наблюдаются у инфицированных растений ( C ), в то время как неинфицированные растения остаются здоровыми ( D ).

5. Флюоресцентная микроскопия

  1. Используйте A. tumefaciens, укрывающую репортерную конструкцию для аутофлуоресцентного белка дляНастройку кокультивации на этапе 4.5 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь используется модифицированная pJP2-плазмида, экспрессирующая pCherry, производная от dsRed 36 .
  2. После соответствующего совместного культивирования ( например, 48 часов) на стадии 4.8 отдельные отдельные вторичные корни (боковые ветви основного корня) используют стерильные ножницы.
  3. Промойте корни в двойной дистиллированной воде, чтобы удалить слабосвязанный материал. Погрузите каждый корень в 30 мкл воды на слайде микроскопа и накройте стеклянным покровным стеклом.
  4. Уплотните края покровного стекла лаком для ног, чтобы предотвратить обезвоживание корней.
  5. Визуализируйте прикрепление A. tumefaciens к корням A. thaliana флуоресцентной микроскопией.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь конфокальный микроскоп с возбуждением из гелия-неона (He-Ne) 543/594 нм-лазера используется для визуализации красной флуоресценции pCherry при 590-630 нм при перевернутом объективе с линзой 63X с числовой апертурой 1,4 ( Рисунок 6).

figure-protocol-14695
Рисунок 6: Корневое добавление Agrobacterium , определяемое методом конфокальной микроскопии. Маркированный красной флуоресценцией Agrobacterium pCherry визуализировали при 590-630 нм с возбуждением от гелия-неона (He-Ne) 543/594 нм лазера. Визуализация проводилась под перевернутым объективом объектива 63X с числовой апертурой 1,4. Шкала шкалы = 11 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Анализ бактериальных транскриптов

  1. После соответствующей совместной культивации ( например, 8 ч) на стадии 4.8 отделите корни от гидропонной среды, как на этапе 4.9. Перенесите 1,5 мл гидропонной среды на 1,5 мл микроЦентрифугировать и центрифугировать при 12000 мкг в течение 2 мин для осаждения клеток.
  2. Удалите супернатант. Перенесите еще 1,5 мл гидропонной среды в ту же 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при 12000 г в течение 2 мин для осаждения клеток.
  3. Удалите супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Протокол можно приостановить здесь, замораживая образцы при -80 ° C до использования.
  4. Извлеките РНК из клеток A. tumefaciens с использованием стандартных методов 37 или подходящего коммерческого комплекса для выделения и очистки РНК с обработкой ДНКазой, чтобы избежать загрязнения ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Протокол можно приостановить здесь, замораживая аликвоты РНК при -80 ° C до использования.
  5. Используйте изолированную РНК для различных анализов с использованием стандартных методов, включая следующее.
    1. Используйте коммерческий микрочип в соответствии с протоколом изготовителя для обнаружения наборов генов, которые дифференциально экспрессируются в кокультивированных по сравнению с контролемкультура.
    2. Используйте количественную реакцию полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) для определения экспрессии конкретных генов или для проверки данных микрочипов 38 .

7. Анализ транскрипции растений

  1. После соответствующей кокультивации ( например, 8 ч) на стадии 4.8 отделите корни от гидропонной среды, как на этапе 4.9, или выделите другие ткани по мере необходимости. Немедленно поместите приблизительно 150 мг корней или другой растительной ткани в жидкий азот.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Протокол можно приостановить здесь, замораживая образцы при -80 ° C до использования.
  2. Измельчите замороженные образцы до порошка в жидком азоте, используя раствор и пестик.
  3. Извлеките РНК из порошка стандартными методами 39 или подходящим комплексом для выделения и очистки коммерческой РНК с обработкой ДНКазой, чтобы избежать загрязнения ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Протокол можно приостановить здесь путем замораживания аликвот РНК при-80 ° C до использования.
  4. Используйте изолированную РНК для различных анализов с использованием стандартных методов, включая следующее.
    1. Используйте коммерческий микрочип в соответствии с протоколом производителя для обнаружения наборов генов, которые дифференциально экспрессируются в совместно культивируемых и контрольных растениях.
    2. Используйте qRT-PCR для обнаружения дифференциальной экспрессии конкретных генов или для проверки данных микрочипов 38 .

8. Профилирование секретности

  1. После соответствующей совместной культивации ( например, 72 ч) на стадии 4.8 отделите корни от гидропонной среды, как на этапе 4.9. Стерилизовать 18 мл гидропонной среды, пропустив ее через фильтр пор 0,2 мкм в 50 мл конических пробирок.
  2. Заморозьте образцы при -80 ° CO / N.
  3. Ослабьте колпачки на 50 мл конических пробирках и поместите их в сушильную машину для замораживания в течение 36 часов. Продолжайте хранить или обрабатывать образцы (как desНиже) для анализа ВЭЖХ и обнаружения соединений.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Протокол можно приостановить здесь.
  4. Повторно суспендируйте каждый образец в 5 мл дважды дистиллированной воды в герметичной пробирке.
  5. Добавляют 5 мл этилацетата и перемешивают, переворачивая трубку несколько раз.
  6. Дайте фазам разделиться при комнатной температуре в течение 5 мин.
  7. Перенесите верхнюю (органическую фазу) в новый контейнер путем пипетирования. Если необходимо, объедините несколько органических фракций.
  8. Сушат под небольшим потоком газообразного азота (~ 45 мин).
  9. Повторно суспендируйте образец в подходящем растворе для ВЭЖХ ( например, 100% метанола).
  10. Выполнять ВЭЖХ в соответствии со стандартными методами 40 .
  11. Обнаружение соединений с помощью соответствующих средств.
    ПРИМЕЧАНИЕ: здесь используется масс-спектрометрия времени рассеяния с электрораспылением (ESI-TOF-MS) 40 .

Результаты

Рост в гидропонной системе совместного культивирования

Кривая роста A. tumefaciens C58 продемонстрировала значительную лаг-фазу в первые 16 ч кокультивации, а затем очень стабильный рост при совместном культивировании с A. thaliana Col-0 до ...

Обсуждение

Учитывая постепенный характер секреции корней, концентрация вызывающих вирулентность химических веществ, продуцируемых в planta, и их влияние на динамические взаимодействия растений и микробов происходят в пространственных и временных градиентах. В этой системе гидропонной совме...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Брайана Веселовского и Александра У. Истмана за помощь и полезную дискуссию. Мы также хотели бы поблагодарить доктора. Юджин Нестер, Лингруй Чжан, Хайтао Шен, Юхай Цуй и Грег Торн за помощь, полезные обсуждения и критическое чтение рукописи. Это исследование было профинансировано сельским хозяйством и агропродовольственной Канадой, Growing Forward-AgriFlex (RBPI № 2555) и проектом «Рост вперед II» № 1670, проведенным авторами в рамках их обязанностей. Это исследование было также частично профинансировано Советом по исследованиям естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC) RGPIN-2015-06052, присуждаемым ZC Yuan.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0)Arabidopsis Biological Resource CentreCS7000https://abrc.osu.edu/order-stocks
bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58)University of WashingtonN/A
labeled bacteriain-houseoptional, depends on downstream analyses
vortex(various)
microcentrifuge tubes(various)
microcentrifuge(various)
5% sodium hypochlorite(various)
double distilled water(various)
autoclave(various)
micropipette (various)
70% ethanol(various)
Murashige and Skoog (MS) basal saltsSigma-AldrichM5524
sucrose(various)
MES(various)
B5 vitamin mixSigma-AldrichG1019
phytoagar(various)
Deep Petri dishes(various)
stainless steel meshFerrier Wire Goods Company LtdN/Agrade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01
micropore tape, 1"3M1530-1
diurnal growth chamber(various)
cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm Pyrex3250other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment
flow hood(various)
forcepts(various)
yeast extract(various)
tryptone(various)
MgSO4(various)
shaking incubator(various)
spectrophotometer(various)
NaCl(various)
shaker(various)
scissors(various)optional, depends on downstream analyses
fluorescence microscope(various)optional, depends on downstream analyses
microscope slides and cover slips(various)optional, depends on downstream analyses
nail polish(various)optional, depends on downstream analyses
Bacterial RNA extraction kit(various)optional, depends on downstream analyses
plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit)Qiagen74903 or 74904optional, depends on downstream analyses
material and equipment for qRT-PCR(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for microarray analysis(various)optional, depends on downstream analyses
liquid nitrogen(various)optional, depends on downstream analyses
mortar and pestle(various)optional, depends on downstream analyses
0.2 µm pore filter(various)optional, depends on downstream analyses
50 mL conical tubes(various)optional, depends on downstream analyses
freeze dryer(various)optional, depends on downstream analyses
sealable test tubes(various)optional, depends on downstream analyses
ethyl acetate(various)optional, depends on downstream analyses
nitrogen gas(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for HPLC(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for ESI-TOF-MS(various)optional, depends on downstream analyses

Ссылки

  1. Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
  2. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
  3. Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
  4. Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  5. Zhang, J., Zhou, J. -. M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
  6. Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
  7. Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
  8. Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
  9. Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
  11. Binns, A. N., Costantino, P., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. , (1998).
  12. Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M., Lindsey, K. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. , (1998).
  13. Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
  14. Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
  15. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  16. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  17. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
  18. Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
  19. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
  20. Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
  21. Yuan, Z. -. C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
  22. Yuan, Z. -. C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
  23. Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
  24. Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
  25. Veena, ., Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
  26. León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J. Wound signalling in plants. J. Exp. Bot. 52 (354), 1-9 (2001).
  27. Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
  28. Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
  29. Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
  30. Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
  31. Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
  32. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
  33. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
  34. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
  35. Nathoo, N. . Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , (2015).
  36. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  37. Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
  38. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  39. Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
  40. Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
  41. Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
  42. Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
  43. Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
  44. Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

125tumefaciens

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены