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要約

記載された水耕共培養システムは、金属メッシュスクリーンを有する完全な植物を支持し、それらを細菌と共培養する。植物組織、細菌、および分泌された分子は、下流の分析のために別々に採取することができ、同時に植物宿主および相互作用する微生物または微生物の両方の分子応答を調べることができる。

要約

自然な植物 - 微生物相互作用を模倣する実験デザインは、複雑な植物 - 微生物シグナル伝達プロセスを描写するために非常に重要である。 シロイヌナズナ - アグロバクテリウム・ツメファシエンス 細菌の病原性および植物相互作用を研究するための優れたモデルシステムを提供します。植物 - アグロバクテリウム相互作用の以前の研究は、植物細胞浮遊培養、植物の人工的創傷、または合成化学物質による微生物毒性因子または植物防御の人為的誘発に大きく依存していた。しかし、これらの方法は、植物および微生物が空間的および時間的な仕方で認識し応答する、植物の天然シグナル伝達とは異なる。この研究は、インタクトな植物が金属メッシュスクリーンによって支持され、 アグロバクテリウムと共培養された水耕共培養系を提示する。この共存系において、micrを誘導する合成植物ホルモンまたは化学物質は存在しない陰茎毒性または植物防御が補われる。水耕性共培養系は、植物の微生物との自然な相互作用および植物のシグナル伝達ホメオスタシスに非常に類似している。植物根は、 アグロバクテリウムを含む培地から分離することができ、植物宿主および相互作用する微生物の両方のシグナル伝達および応答を同時にかつ系統的に調べることができる。任意の時点/間隔で、植物組織または細菌を様々な「オミックス」分析のために別々に収穫することができ、このシステムの効力および効力を実証する。水耕共培養系は、1）多様な植物微生物系の相反するシグナル伝達、2）植物宿主と複数の微生物種（ すなわち微生物のコンソーシアムまたは微生物）との間のシグナル伝達、3）栄養素および化学物質の関与方法植物微生物シグナル伝達における微生物、および4）微生物が植物宿主とどのように相互作用し、生物的Oに対する植物耐性に寄与するかr非生物的ストレス。

概要

植物関連微生物は、生物地球化学サイクル、バイオレメディエーション、気候変動の緩和、植物の成長と健康、生物的および非生物的ストレスに対する植物耐性において重要な役割を果たす。微生物は直接植物細胞壁の接触を介して間接的に化学分泌を介して1、2、3シグナリングの両方の植物と相互作用します。固着生物として、植物は病原体による感染に抵抗する直接的および間接的メカニズムを開発してきた。間接的な防御は、二次植物代謝物の生産と病原体4,5の侵入に対する拮抗生物の魅力を含むのに対し、直接防御は、構造的な防御および防御タンパク質の発現を含みます。植物由来の滲出液、分泌物、粘液、ムシゲル、および溶解物は、根圏の物理化学的特性を変化させて誘引または反発する宿主に向かって微生物6 。根分泌物の化学組成は種特異的であり、それによって、そのような化合物を認識することができる特定の微生物が根圏6で繁殖することを可能にする選択的フィルターとして役立つ。したがって、適合性の微生物種は、植物宿主1の有益性または有害性のいずれかに、それらの関連性を活性化および強化するように刺激され得る。

微生物および化学的暴露の大部分は、ルート構造と土壌エアインタフェース2、6、7、8で起こるからである。根圏における理解植物微生物相互作用は、植物生産性と生態系の機能を強化するための鍵でありますしかしながら、地下の植物 - 微生物相互作用および相反応答の試験は、その興味深いことに複雑かつ動的な性質、および厳密に制御可能な増殖条件下での天然根構造および植物形態を有する適切な実験モデルの欠如を含む。最も頻繁に研究植物病原の一つとして、 アグロバクテリウムは桜、リンゴ、ナシ、ブドウなどの農園芸重要性を持つ植物の広い範囲に感染し、9ローズ 。 アグロバクテリウムは理解植物-病原体相互作用のための重要なモデル生物であり、植物の形質転換および植物工学10、11、12、13、14における強力なツールです。

分子は、 アグロバクテリウムの相互作用が十分に数十年にわたって研究されている、およびアグロバクテリウム病原性の現在の理解は9広範であるプラント-F "> 11、15、16。 アグロバクテリウムの病原性は、主に17を感知する、植物由来の信号を感知その毒性プログラムおよび細胞間通信の細かい調節をもたらす、いわゆる定足数のその進化能力に起因する。ザアグロバクテリウムの病原性プログラムは根圏で利用可能ないくつかの信号によって調節され、2成分系、は、chvg / Iシステムとビラ/ Gシステムの2つのセットを含むている。根圏における酸性条件は、 は、chvg / I、 ビラ/ Gの転写を活性化します、およびvirE0 、 virE1 、 virH1 、 virH2 、およびVI型分泌系（T6SS） 18の遺伝子を含むアグロバクテリウムの病原性に関与するいくつかの他の遺伝子が含まれる。アセトシリンゴン（4'-ヒドロキシ-3 '、5 ' - ジメトキシアセトフェノン）、Vリン酸化シグナル伝達機構によるirA / G二成分系19 。その後、VirA / Gはvirレギュロン全体を活性化し、その結果、腫瘍誘導性（Ti）プラスミドからトランスファーDNA（T-DNA）と呼ばれる約20kbのバクテリアDNA断片を植物核16に移入して組み込む。 T-DNAは、植物ホルモンインドール-3-酢酸（IAA）（ iaaMおよびiaaH ）およびサイトカイニン（ ipt ）の合成に関与する遺伝子を保有し、一旦植物細胞で発現すると、これらの植物ホルモンが大量に産生される。これは、植物9、11、20のために慢性および復活問題であるクラウンゴール病として知られる異常な組織増殖および植物腫瘍発達、もたらします。 IAAは、 アグロバクテリウムビルレンスを抑制するために、またはアグロバクテリウムを減少させるために、サリチル酸およびγ-アミノ酪酸と一緒に作用する m個のクオラムセンシング（QS）17、21、22。この抑制に対抗するために、T-DNAはまた、 アグロバクテリウムの病原性を促進するために、 アグロバクテリウムクオラムセンシングを活性化し、病原体22,23のための栄養源となるオピンの生合成のための遺伝子を運びます。

アグロバクテリウム -プラント相互作用の全体的な深い理解と、植物宿主への得られたT-DNA転移にもかかわらず、相互作用の初期段階での複雑なシグナル伝達事象はあまり理解されていない。これは、部分的に、 アグロバクテリウム -植物シグナル伝達を調べるための従来のアプローチの限界に起因する。植物細胞懸濁液培養および人工部位特異的創傷は、分子植物 - 微生物相互作用を研究するために一般的に使用されている24 、。EF "> 26、27はしかし、細胞懸濁液は、一般的な植物の形態に欠け、特に、植物の懸濁細胞は、微生物の走化性および病原性28、29を活性化するために非常に重要なルート構造と根の滲出液を、持っていない植物の形態の維持。ルート構造が直接感染した植物組織30、31に誘導される植物防御関連遺伝子の検出結果として、サイト固有の感染を容易に人為的に負傷植物によって対処されてきた。しかし、人工的な創傷は、自然の中で病原体感染と大きく異なっています特に、創傷がジャスモン酸（JA）の蓄積をもたらし、天然植物のシグナル伝達と防御を全身的に妨害する26。また、合成化学物質は、人工的に植物宿主応答を誘導するために使用される26 。または病原体の病原性である。 植物体中の濃度を反映するような化学物質の補充が可能であるが、そのような補充は徐々に微生物28、32によって検知された走化性勾配を生成取り囲む根圏へ根滲出液の拡散を考慮していません。植物 - 微生物相互作用を研究する従来のアプローチの限界を考えると、得られたデータの精度と深さは妨げられ、制限され、従来のアプローチから生成された知識は植物に直接翻訳されない可能性がある。植物 - アグロバクテリウムシグナリングの多くの局面は、特に、疾患の症状がまだ発症していない初期の相互作用の段階では、完全には理解されていない。

従来のアプローチの限界を修正するために、この研究は、安価で、しっかりと制御可能で、柔軟な水耕性のc研究者が分子植物 - 微生物相互作用の初期段階で複雑なシグナル伝達経路と応答経路に深い洞察を得ることを可能にする。水耕栽培は広く植物栄養素、根の滲出液、成長条件、および植物33、34上の金属毒性の影響を研究するために使用されてきました。水耕栽培モデルには、小さな空間的要件、様々な植物組織の接近可能性、栄養素/環境条件の厳密な制御、害虫/病害の制御などのいくつかの利点があります。水耕栽培システムはまた、典型的には2〜3週間後に成長を制限する寒天/フィトアガルめっき技術と比較して、植物の生育を制限するものではない。重要なのは、全体のプラント構造物の維持管理は、微生物の走化性および病原性の誘導8、29のために必要な自然なルート分泌を促進します。システムの説明ここでのベッドは選択肢33、34よりも簡単かつ少ない労働集約的です。これは、より少ない部品を使用し、標準はさみ以外の工具を必要としません。それは、植物生長の強力な支持体としての金属メッシュ（ナイロン33とは対照的に）と、微生物増殖を助けるための振盪による無菌条件下での単純な通気方法を使用する。さらに、このシステムは、根の幅を制限することなく多様な植物種に適応する、植物成長をサポートするために様々なサイズの金属メッシュを使用することができる。

ここに提示されている水耕共培養系では、接種された細菌の増殖を支える有機化合物を植物の根が分泌する無菌水耕システムで植物を栽培する。この共培養システムでは、植物ホルモン、防御エリシター、または病原性誘導化学物質などの人工化学物質は補充されず、自然細胞を反映する植物 - 微生物相互作用中のホメオスタシスシグナル。この水耕共培養システムでは、同時に遺伝子、アグロバクテリウムによる感染時シロイヌナズナ COL-0根組織における発現、ならびにシロイヌナズナとの共培養時にアグロバクテリウム遺伝子の活性化を決定することが可能でした。このシステムは、 アグロバクテリウム （ Agrobacterium ）との同時培養（感染）の際に、植物根へのアグロバクテリウムの付着および植物根の分泌のプロファイルを研究するのに適していることがさらに実証された（ 図1 ）。

figure-introduction-5605
図1：サンプル分析を用いた水耕共培養系の概要。植物をメッシュの上に成長させる（メッシュの上に芽を入れる）が、水耕培地に浸漬され、その後、バクテリアfまたは共培養する。次いで、植物組織および細菌を分離して、同時に抽出および分析する。この数字は参考文献35から変更されています。

プロトコル

1.実験計画

  1. 実験の具体的な目標を決定する。
  2. 以下のプロトコル全体を読んでください。特定の目標に関連するセクションと、変更が必要かどうかを判断します。例は下記を参照してください。
    1. A. thaliana植物とA. tumefaciens細菌、以下のような実験、または別の植物 - 微生物の組み合わせを実験で使用するかどうかを検討する。
      注：さまざまな植物種を使用することができますが、植物の根の厚さは、異なるサイズのメッシュ（ステップ3.3）、および増殖パラメータ（ステップ3.10-3.11および4.4）および水耕栽培タンクサイズおよび培地容量（ステップ4.2）も調整を必要とする可能性がある（ 図2 ）。微生物は、純粋な培養物、混合種（コンソーシアム）、または環境サンプル（微生物）から簡単に接種することができますが、変更はプロトコール、特にステップ4.5に影響します。
    2. 考慮するサンプルを分析するために使用される実験の種類。
      注：蛍光顕微鏡（ステップ5）は、蛍光レポーター構築物で標識された生物を必要とする。
  3. 適切なコントロールを設計する。コントロールバクテリアとバクテリアを接種していないコントロール苗をタンクに接種した苗を持たない水耕液タンクを含める。
  4. 適切な数の種子と水耕栽培タンクを用いて実験を計画する。対照、生物学的反復（最低3回）、およびすべての分析に必要な組織の量を考慮する。
  5. 実験目標（ステップ4.8）の同時培養の適切な長さを決定する。
  6. 必要に応じて、以下の手順を改訂してください。

figure-protocol-906
図2.養液栽培システムで栽培可能な他の植物の例金属メッシュの格子。様々な植物種子と栽培のための金属メッシュセットの互換性。 （A）ステンレススチールタイプ.047" ×304 weldmesh 3×3メッシュソラマメ用DIAワイヤ。（B）ステンレス鋼タイプ0.035" ×304 weldmesh 4×4メッシュゼアはメイズ用DIAワイヤ。 （C）ステンレス鋼タイプ304 weldmesh 4×4メッシュ0.032" × ダイコン用DIA線（DIAワイヤダイズ （ダイズ）。（D）ステンレス鋼タイプ304 weldmesh 6×6メッシュ0.047" ×冬だいこん）。 （E）ステンレス鋼タイプ304 weldmesh 6×6メッシュ0.047" × コムギ属用DIAワイヤ。（F）ステンレス鋼タイプ304 weldmesh 6×6メッシュ0.035" × キュウリのためのDIAワイヤ。この数字は参考文献35から変更されています。955fig2large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

2.植物種子表面の滅菌

  1. 微量遠心分離管内で500μLの脱イオン水を含むA. thalianaの約200の種子を（高速で）ボルテックスする。大きな種子の植物種については、表面の滅菌を容易にするために大きなチューブを使用してください。
  2. これを約9,000 xgで30秒間、卓上マイクロ遠心分離機で遠心します。ピペットを用いて水（上清）を除去する。
  3. 2％の次亜塩素酸ナトリウム300μLを種と渦に加える。室温で1分間放置する。より大きな種子を持つ植物種については、種を覆うためにより大きな量を使用する。
  4. 卓上マイクロ遠心分離機で30秒間約9,000×gで遠心分離する。ピペットを用いて次亜塩素酸ナトリウム溶液を除去する。
  5. 500μLの滅菌脱イオン水を種と渦に加えます。約9,000 xgの遠心分離機滅菌ピペットを使用して水を除去する。
  6. ステップ2.5をさらに4回繰り返します。
  7. 種子およびボルテックスに70％エタノール500μLを加える。室温で1分間放置する。
  8. 卓上マイクロ遠心分離機で30秒間約9,000×gで遠心分離する。ピペットを用いて70％エタノールを除去する。
  9. ステップ2.5をさらに5回繰り返します。
  10. 滅菌した種子を500μLの滅菌超純水に再懸濁する。

3.植物の種子発芽と半固体栽培

  1. 半固体のMurashige and Skoog（MS）培地を調製する：2.165g / LのMS基礎塩; 10g / Lスクロース; 0.25g / L MES;および5g / Lのフィトアガールを含む59mL / LのB5ビタミンミックス、pH5.55。
  2. MS培地をオートクレーブする。各滅菌深いペトリ皿（100×25 mm 2 ）に25 mLを注ぎます。
  3. それぞれのペトリ皿のために、90×90mm四方のステンレススチールメッシュを切り取ってください。
    注： A. thalianaの推奨メッシュ< / em>はグレード304（標準グレード）、メッシュ数（線形インチ当たりの穴数）40 x 40、ワイヤー直径0.01 "（0.0254 cm）です。またはそれ以上のプラットフォーム。
  4. メッシュがペトリプレートの内側に収まるように、各正方形メッシュの角をちょうど曲げます。コーナーをメッシュのバルクに対して90°の角度で曲げて、コーナーでメッシュを上にして、ルート展開のために十分なスペースを残します（ 図3a ）。
  5. 切断されたメッシュの四角をビーカーに入れ、アルミホイルで覆い、30分間の乾式サイクルを用いてオートクレーブで滅菌する。
  6. 培地がペトリ皿で凝固し、メッシュが滅菌されたら、曲がったコーナーを下に向けて、滅菌メッシュの正方形を半固体培地の上に置きます。
  7. コーナーが媒体を貫通し、メッシュの大部分が媒体の上面に接触するようにメッシュを押す。>図3b）。
  8. 200μLの移送ピペットを使用して、個々の表面滅菌A. thaliana種子（種子は真空力によってピペットの先端に留まる）を作り、各種子をメッシュの上に静かに移す。実験的な必要性のために適切に間隔を置くように種を置く（ 例えば、 4 6種子/プレート）。
  9. ペトリプレートを蓋でシールし、多孔質の外科用テープを端に置く。
  10. ペトリ皿全体を暗所で2℃で4℃に置くことにより種を層別化する（ 例えば、暗色を模倣するためにはすずめんを包む）。
  11. ペトリ皿中の種子を22〜24℃で16時間の光周期で10〜14日間培養する（ 図3c ）。

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図3：水耕植物 - 微生物共培養システム。左翼nelは、水耕栽培共生システムの組み立てと操作の6つの重要なステップを概説するフローチャートを表しています。右のパネルは、 シロイヌナズナとアグロバクテリウムの相互作用を研究する際の、水耕共培養システムの実際の実験材料、装置、および操作手順を示しています。植物または細菌のサンプリングのための接種工程および最終工程を示す。この数字は参考文献35から変更されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

4.水耕共培養システム

  1. 液体のMurashige and Skoog（MS）培地：2.165g / L MS基礎塩、10g / Lスクロース、0.25g / L MES、および59mL / L B5ビタミン混合物、pH5.75を調製する。
  2. 培地をオートクレーブします。各滅菌円筒ガラスまたは透明プラスチックタンクに18 mLの溶液を注ぎます（結晶化皿、100 x 80 mm2）滅菌蓋を使用してください。
    注：タンクと蓋をアルミ箔で包み、オートクレーブで予備滅菌します。
  3. 滅菌フローフードで、滅菌鉗子を使用して、10〜14日齢の苗を各メッシュの正方形に半固体培地から水耕栽培の円筒形タンクに静かに移す（ 図3d ）。多孔質手術用テープを使用して蓋をタンクに密封する。
  4. タンク内のメッシュ上の苗を22-24℃、72時間、16時間の光周期で栽培し、通気用に50rpmで振盪する（ 図3e ）。
    注：これは、植物が微生物による接種（共培養）前に水耕環境に適応することを可能にする。この待機期間はまた、接種前に偶発的な微生物汚染が明らかになるようにする。
    1. インキュベーション期間の終了前日に次のステップを開始します。
  5. AB培地中のA.ツメファシエンスを増殖させる培養物が600℃で1.0の最終光学濃度に達するまで、28℃で一晩振盪しながら（0.5％w / v酵母抽出物、0.5％w / vトリプトン、0.5％w / vスクロース、50mM MgSO 4 、pH7.0）ブランクとして未接種のAB培地を用いて分光光度計を使用して測定した場合の、10nm（OD 600 ）である。
    注：1.0のOD 600は約10 9細胞/ mLに相当する。
  6. A. tumefaciensを等量の0.85％NaClで3回洗浄する。同量の滅菌二重蒸留水に再懸濁する。
  7. 接種の前に、苗を注意深く調べて汚染がないことを確認する。汚染されていないタンク内の培地は透明で透明でなければならない。
    1. 濁った液体（汚染）が入っているタンクはすべて廃棄し、残りのタンクに番号を付けます。各番号付きタンクから少量（20μL）の水耕培地をサンプリングし、それをLuriaブロス（LB）で満たしたペトリ皿上にスポットする。インキュベート28℃で皿。
  8. 直ちに、 A. tumefaciens懸濁液（OD 600から推定される約5×10 7細胞） 50μLを各番号の水耕槽に加える。 シロイヌナズナの実生およびA.ツメファシエンスを22〜24℃で16時間の光周期および50rpmで振とうして共培養する （ 図3f ）。
    1. ステップ4.7.1のスポットされたLBプレートを調べる。 12時間および28時間のインキュベーション後にタンクの無菌性を確認した。汚れがある場合は、さらに下流のアッセイに対応する番号付きのタンク（バクテリアを接種したもの）を使用しないでください。
  9. 必要に応じて、定期的にA. tumefaciensの増殖を、タンクから培地のサンプルを取り出し、非接種対照の培地を含む分光光度計を用いてブランクとしてOD 600を測定することによりモニターする（ 図4 ）。
    NOTE：植物病害の症状は7日後に明らかにすべきである（ 図5 ）。
  10. メッシュプレートを持ち上げて細菌懸濁液からA.thalianaの根を分離する;このステップのタイミングは下流プロセスに依存する。詳細については、手順5-8を参照してください。
  11. その後の分析に根を使用する場合は、二重蒸留水で素早くすすいでください。葉などの組織を使用している場合は、組織を切断します。 RNA分析の場合は、直ちにステップ7.1に進んでください。

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図4：水耕性共培養システムにおけるアグロバクテリウムの増殖。植物宿主（ シロイヌナズナ ）の存在下または非存在下でのアグロバクテリウムの増殖を4時間ごとにモニターした。 アグロバクテリウム細胞をAB培地O / N中で生育させ、0.85％NaClで3回洗浄し、水耕栽培システムに接種した。シロイヌナズナの共培養なしに、約0.1の初期OD 600から。 OD 600値は、3つの生物学的複製の平均であり、標準偏差（1.0のOD 600 = 1×10 9細胞/ mL）を有する。

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図5：共培養中の代表的な植物の表現型および観察可能な疾患の症状。接種後4日以内に、接種されていない植物（ B ）と比較して病徴は見られない（ A ）。共感染（感染）の7日後、感染した植物（ C ）では病徴が認められ、非接種の植物は健康なままである（ D ）。

5.蛍光顕微鏡

  1. 自己蛍光タンパク質のためのレポーター構築物を有するA.ツメファシエンスをステップ4.5の共培養設定。
    注：ここでは、dsRed 36の誘導体であるpCherryを発現する改変pJP2プラスミドを使用します。
  2. ステップ4.8で適切な共培養（ 例えば、 48時間）後、滅菌はさみを用いて個々の二次根（主根の側枝）を分離する。
  3. 二重蒸留水で根をすすいで、ゆるく結合した物質を除去する。顕微鏡スライド上に30μLの水に各根を沈め、ガラスカバースリップで覆う。
  4. 根の脱水を防ぐために、カバースリップの縁をマニキュアでシールする。
  5. 蛍光顕微鏡によるシロイヌナズナの根にA. tumefaciensの添付ファイルを可視化します。
    注：ここでは、ヘリウム - ネオン（He-Ne）543/594nmレーザーからの励起を伴う共焦点顕微鏡を使用して、開口数1.4の反転63X水レンズ対物レンズの下で590-630nmのpCherry赤色蛍光を視覚化する図6）。

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図6：共焦点顕微鏡法で測定したアグロバクテリウム根の付着。 pCherry赤色蛍光標識アグロバクテリウムは、ヘリウム - ネオン（He-Ne）543/594nmレーザーからの励起で、590〜630nmで視覚化された。視覚化は、開口数1.4の逆数63X水レンズ対物レンズの下で行った。スケールバー=11μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

6.細菌転写物分析

  1. ステップ4.8で適切な共培養（ 例えば、 8時間）後、ステップ4.9のように水耕培地から根を分離する。 1.5mLの水耕培地を1.5mLのマイクロチューブを遠心分離し、12,000×gで2分間遠心分離して細胞をペレット化する。
  2. 上清を除去する。別の1.5mLの水耕培地を同じ1.5mL微量遠心管に移し、12,000gで2分間遠心分離して細胞をペレット化する。
  3. 上清を除去する。
    注記：プロトコールは、使用するまで-80℃でサンプルを凍結させることで一時停止することができます。
  4. DNA汚染を避けるために、標準的な方法37またはDNase処理を伴う適切な市販のRNA単離および精製キットを使用して、 A.tumefaciens細胞からRNAを抽出する。
    注記：このプロトコールは、使用するまで-80℃でRNAのアリコートを凍結することにより一時停止することができます。
  5. 以下のような標準的な方法を用いて、様々な分析に単離されたRNAを使用してください。
    1. 共培養した対照と対照とで差異的に発現する遺伝子セットを検出するために製造業者のプロトコールに従って市販のマイクロアレイを使用する文化。
    2. 特定の遺伝子の発現を検出するために、またはマイクロアレイデータ38を検証するために、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を使用します。

7.植物転写物分析

  1. ステップ4.8で適切な同時培養（ 例えば 8時間）後、ステップ4.9のように水耕培地から根を分離し、または必要に応じて他の組織を分離する。直ちに約150mgの根やその他の植物組織を液体窒素に入れます。
    注記：プロトコールは、使用するまで-80℃でサンプルを凍結させることで一時停止することができます。
  2. 凍結したサンプルを乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉末に粉砕する。
  3. DNA汚染を避けるために、標準的な方法39またはDNase処理を伴う適切な市販のRNA単離/精製キットを使用して、粉末からRNAを抽出する。
    注：RNAの一部を凍結することでプロトコールを一時停止することができます。-80℃で使用するまで。
  4. 以下のような標準的な方法を用いて、様々な分析に単離されたRNAを使用してください。
    1. 市販のマイクロアレイを製造業者のプロトコールに従って使用して、対照植物に対して共培養されたもので差次的に発現される遺伝子セットを検出する。
    2. qRT-PCRを使用して、特定の遺伝子の差次的な発現を検出するか、マイクロアレイデータを検証します38 。

8.秘密のプロファイリング

  1. ステップ4.8で適切な共培養（ 例えば、 72時間）後、ステップ4.9のように水耕培地から根を分離する。 0.2mLの細孔フィルターを通して50mLのコニカルチューブに通すことにより、18mLの水耕培地を滅菌する。
  2. サンプルを-80℃CO / Nで凍結する。
  3. 50 mLコニカルチューブ上のキャップを緩め、凍結乾燥機に36時間置いてください。サンプルの保管または処理を続行する（desHPLC分析および化合物検出のために以下に記載する）。
    注記：ここではプロトコルを一時停止することができます。
  4. シール可能な試験管内で、各サンプルを5mLの二重蒸留水に再懸濁する。
  5. 酢酸エチル5 mLを加え、チューブを数回反転させて混合する。
  6. 相を室温で5分間分離させる。
  7. 上部（有機相）をピペットで新しい容器に移す。必要に応じて、複数の有機物画分をプールする。
  8. 穏やかな窒素気流下で乾燥させる（約45分）。
  9. HPLC用の適切な溶液（ 例えば、 100％メタノール）中でサンプルを再懸濁する。
  10. 標準的な方法40に従ってHPLCを行う。
  11. 適切な手段で化合物を検出する。
    注：エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析（ESI-TOF-MS） 40がここで使用されます。

結果

水耕栽培共生システムの成長

A. tumefaciens C58の増殖曲線は、同時培養の最初の16時間で有意なラグ期を示し、 A. thaliana Col-0と共生培養したときに非常に安定した増殖、約0.9の最大OD 600まで48時間後に接種する。対照的に、本質的に細菌増殖はA. thalianaのない対照培養で観察されなかった（

ディスカッション

根分泌の漸進的な性質を考慮すると、 プラナで生産されたビルレンス誘発化学物質の濃度および動的植物 - 微生物相互作用に対するそれらの効果は、空間的および時間的勾配において生じる。この水耕栽培共生システムでは、微生物毒性または植物防御を誘​​導する合成植物ホルモンまたは化学物質は補充されない。対照的に、従来のアプローチを用いて、アセトシリンゴン...

開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

Brian WeselowskiとAlexander W. Eastmanに感謝し、彼らの助けと役に立つ議論をしていただきたいと思います。私たちはDrsにも感謝したいと思います。 Eugene W. Nester、Lingrui Zhang、Haitao Shen、Yuhai Cui、Greg Thornの協力を得て、有用な議論と原稿の批評を読んだ。この研究は、農業および農業食品カナダ、Growing Forward-AgriFlex（RBPI番号2555）およびGrowing Forward IIプロジェクト番号1670（その職務の一環として著者が実施したもの）によって資金提供されました。この研究はまた、ZC Yuanに授与されたカナダの自然科学・工学研究評議会（NSERC）Discovery Grant RGPIN-2015-06052によって部分的に資金提供された。

資料

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plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0)Arabidopsis Biological Resource CentreCS7000https://abrc.osu.edu/order-stocks
bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58)University of WashingtonN/A
labeled bacteriain-houseoptional, depends on downstream analyses
vortex(various)
microcentrifuge tubes(various)
microcentrifuge(various)
5% sodium hypochlorite(various)
double distilled water(various)
autoclave(various)
micropipette (various)
70% ethanol(various)
Murashige and Skoog (MS) basal saltsSigma-AldrichM5524
sucrose(various)
MES(various)
B5 vitamin mixSigma-AldrichG1019
phytoagar(various)
Deep Petri dishes(various)
stainless steel meshFerrier Wire Goods Company LtdN/Agrade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01
micropore tape, 1"3M1530-1
diurnal growth chamber(various)
cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm Pyrex3250other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment
flow hood(various)
forcepts(various)
yeast extract(various)
tryptone(various)
MgSO4(various)
shaking incubator(various)
spectrophotometer(various)
NaCl(various)
shaker(various)
scissors(various)optional, depends on downstream analyses
fluorescence microscope(various)optional, depends on downstream analyses
microscope slides and cover slips(various)optional, depends on downstream analyses
nail polish(various)optional, depends on downstream analyses
Bacterial RNA extraction kit(various)optional, depends on downstream analyses
plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit)Qiagen74903 or 74904optional, depends on downstream analyses
material and equipment for qRT-PCR(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for microarray analysis(various)optional, depends on downstream analyses
liquid nitrogen(various)optional, depends on downstream analyses
mortar and pestle(various)optional, depends on downstream analyses
0.2 µm pore filter(various)optional, depends on downstream analyses
50 mL conical tubes(various)optional, depends on downstream analyses
freeze dryer(various)optional, depends on downstream analyses
sealable test tubes(various)optional, depends on downstream analyses
ethyl acetate(various)optional, depends on downstream analyses
nitrogen gas(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for HPLC(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for ESI-TOF-MS(various)optional, depends on downstream analyses

参考文献

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