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요약

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

초록

복잡한 식물 - 미생물 신호 처리 과정을 묘사하기 위해서는 자연 식물 - 미생물 상호 작용을 모방 한 실험 설계가 매우 중요합니다. 애기 장대 - Agrobacterium tumefaciens 박테리아의 병인 및 식물 상호 작용을 연구하기위한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 식물 - 아그로 박테 리움 상호 작용에 대한 이전의 연구는 주로 식물 세포 현탁 배양, 식물의 인공 상처 또는 합성 화학 물질에 의한 미생물 독성 인자 또는 식물 방제 의 인공 유도에 크게 의존해왔다. 그러나 이러한 방법은 식물과 미생물이 공간적, 시간적 방식으로인지하고 반응하는 식물의 자연 신호 와 구별된다. 이 작품은 손상되지 않은 식물이 금속 메쉬 스크린에 의해지지되고 아그로 박테 리움 과 함께 배양되는 수경 공동 배양 시스템을 제시합니다. 이 공동 배양 시스템에서, 합성 피토 호르몬 또는 micr을 유도하는 화학 물질obial 독성 또는 식물 방어는 보충된다. hydroponic cocultivation 시스템 은 planta의 자연 식물 - 미생물 상호 작용 및 신호 항상성과 매우 유사합니다. 식물 뿌리는 아그로 박테 리움을 함유하는 배지로부터 분리 될 수 있고, 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물의 신호 및 반응은 동시에 체계적으로 조사 될 수있다. 특정 시점 / 간격에서, 식물 조직 또는 박테리아는 다양한 "omics"분석을 위해 별도로 수확 될 수있어이 시스템의 효능과 효과를 입증합니다. 수경 공동 배양 시스템은 1) 다양한 식물 미생물 시스템의 상호 신호 전달, 2) 식물 숙주와 여러 미생물 종 ( 예 : 미생물 협회 또는 미생물) 간의 신호 전달, 3) 영양소와 화학 물질의 관련성 연구 4) 미생물이 식물 숙주와 어떻게 상호 작용하고 생물학적 인 o에 대한 식물 내성에 기여하는지r 비 생물 적 스트레스.

서문

식물과 관련된 미생물은 생물 지구 화학적 순환, 생물학적 복원, 기후 변화 완화, 식물 성장 및 건강, 생물학적 및 비 생물 적 스트레스에 대한 식물 내성에 중요한 역할을한다. 미생물은 식물 세포 벽 접촉을 통해 간접적으로 화학 분비 및 신호 1 , 2 , 3을 통해 식물과 상호 작용합니다. 침착성 유기체로서 식물은 병원균에 의한 감염을 막기위한 직접 및 간접적 인 기작을 개발해 왔습니다. 직접 방어에는 구조적 방어와 방어 단백질의 발현이 포함되지만 간접 방어에는 2 차 식물 대사 산물 생성 및 침입 병원체에 대항하는 유기체의 인력이 포함됩니다 4 , 5 . 식물에서 추출한 뿌리 삼출물, 분비물, 점액, 점액 및 용 해물은 rhizosphere의 물리 화학적 성질을 변화시켜 끌어들이거나 밀어 낸다.그들의 숙주에 대한 미생물 6 . 뿌리 분비물의 화학적 조성은 종 특이 적이며, 이로 인해 rhizosphere에서 이러한 화합물을 인식 할 수있는 특정 미생물을 허용하는 선택 필터 역할을합니다 6 . 따라서, 호환 가능한 미생물 종은 자극되어 식물 숙주 1 의 이익 또는 손상에 대한 그들의 결합을 활성화시키고 향상시킬 수있다.

근권에서 식물 - 미생물 상호 작용을 이해하는 것은 미생물 및 화학 물질 노출의 대부분이 뿌리 구조와 토양 - 공기 경계 2 , 6 , 7 , 8 에서 발생하기 때문에 식물 생산성과 생태계 기능을 향상시키는 데 중요합니다. 그러나 지하 식물의 미생물 상호 작용과 상호 반응에 대한 조사는 흥미롭게도 복잡하고 역동적 인 성질 및 단단히 조절 가능한 성장 조건 하에서의 천연 뿌리 구조 및 식물 형태와 적합한 실험 모델의 결여. 가장 많이 연구 phytopathogens 중 하나 인 아그로 박테 리움 체리, 사과, 배, 포도를 포함한 농업과 원예 중요성, 식물의 넓은 범위를 감염, 9 상승했다. 아그로 박테리아 는 식물 - 병원체 상호 작용을 이해하는 중요한 모델 유기체이며 식물 형질 전환 및 식물 공학 10 , 11 , 12 , 13 , 14 에서 강력한 도구입니다.

분자 공장 - 아그로 박테 리움 상호 작용은 물론, 수십 년 동안 연구 및 아그로 박테 리움의 병원성의 현재 이해는 9 광범위 한F "> 11, 15, 16. 아그로 병원성은 대부분 17 센싱 그 독성 프로그램 및 세포 간 통신의 미세 조정의 결과, 식물 유래의 신호를 지각의 발전 능력에 소위 정수를 때문이다. 아그로 박테 리움 독성 프로그램은 rhizosphere에서 이용 가능한 몇 가지 신호에 의해 조절되며 ChvG / I 시스템과 VirA / G 시스템의 2 가지 세트로 구성된다. rhizosphere의 산성 조건은 chvG / I , virA / G 의 전사를 활성화시킨다 , virE0 , virE1 , virH1 , virH2 및 VI 형 분비 시스템 (T6SS) 18의 유전자를 포함한 Agrobacterium 병원성에 관여하는 여러 다른 유전자를 포함한다. 아세토 오손 (acetosyringone) (4'- 히드 록시 -3 ', 5 '- 디메 톡시 아세토 페논), V인산화 신호 전달 메커니즘을 통한 irA / G 2- 성분 시스템 19 . VirA / G는 전체 vir 레 귤론을 활성화시켜 종양 유도 (Ti) 플라스미드에서 전사 핵 (T-DNA)으로 알려진 ~ 20kb의 박테리아 DNA 조각을 식물 핵 16 으로 옮기고 통합시킵니다. T-DNA는 식물 호르몬 인 indole -3-acetic acid (IAA) ( iaaM 과 iaaH )와 cytokinin ( ipt )의 합성에 관여하는 유전자를 가지고 있으며 일단 식물 세포에서 발현되면 많은 양의 식물 호르몬이 생산됩니다. 이것은 비정상적인 조직 증식과 식물 종양 발달을 일으키는데 이는 크라운 담즙병 (crown gall disease)으로 알려져 있으며 이는 식물 9 , 11 , 20 의 만성적이고 재발적인 문제입니다. IAA는 아그로 독성을 억제하거나 감소 Agrobacteriu 살리실산 및 감마 - 아미노 부티르산으로 집단적 행동 m 쿼럼 감지 (QS) ( 17 , 21 , 22) . 이 억압 카운터, T-DNA는 아그로 병원성을 촉진 아그로 정수 감지를 활성화하고, 또한 병원체 22, 23 영양원 역할 의견을 갖다 생합성을위한 유전자를 운반한다.

아그로 박테 리움 - 식물 간 상호 작용에 대한 전반적인 깊은 이해와 식물 숙주로의 T-DNA 전달로 인해 초기 상호 작용에서 복잡한 신호 전달 사건이 덜 잘 이해된다. 이것은 Agrobacterium -plant signaling을 조사하기위한 기존의 접근법의 한계로 인해 부분적으로 발생합니다. 식물 세포 현탁 배양 및 인공 사이트 별 상처는 일반적으로 분자 식물 - 미생물 상호 작용 (24)을 연구하는 데 사용됩니다. EF "> (26), (27)는 그러나, 세포 현탁액은 일반적인 식물의 형태를 부족, 특히 식물 서스펜션 세포가 미생물 화성 및 독성 (28), (29) 활성화를위한 매우 중요한 루트 구조와 뿌리 삼출물을하지 않아도 식물 형태의 유지 보수. 루트 구조는 직접 감염된 식물 조직 (30), (31)에 의한 식물 방어 관련 유전자의 검출 결과, 사이트 별 감염을 용이하게 인위적으로 상처를 입는 식물에 의해 해결되었습니다. 그러나, 인공 상처는 자연의 병원균 감염 큰 차이가 특히 상처가 자스몬 산 (JA) 축적을 유도하여 천연 식물 신호 전달 및 방어를 체계적으로 방해한다 .26 또한 합성 화학 물질은 인공적으로 식물 숙주 반응을 유도하는데 사용된다또는 병원체 독성. 란타에서의 반사 농도와 같은 화학 물질의 보충이 가능하지만, 이러한 보충 서서히 미생물 (28), (32)에 의해 감지 화성 구배를 생성 주변 근권로 루트 배설물의 확산을 고려하지 않는다. 식물 - 미생물 상호 작용, 정확성과 방해하고 제한 될 수 얻은 데이터의 깊이, 그리고 란타에서 직접 번역하지 않을 수 있습니다 기존의 접근 방식에서 생성 된 지식을 연구하는 기존의 접근 방식의 한계를 감안할 때. 식물 - 아그로 박테 리움 신호 전달의 많은 양상은 아직 완전히 이해되지 않았는데, 특히 질병 증상이 아직 나타나지 않은 초기 상호 작용 단계에서 그렇다.

종래의 접근법의 한계를 수정하기 위해,이 연구는 저렴하고, 단단히 조절 가능하며, 유연한 수경 첨가제 인 c연구원이 분자 식물 - 미생물 상호 작용의 초기 단계에서 복잡한 신호 전달 및 반응 경로에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있도록하는 시스템입니다. 수경법은 식물 영양소, 뿌리 삼출물, 성장 조건 및 식물에 금속 독성의 영향을 연구하기 위해 널리 사용되었습니다 33 , 34 . 작은 공간 요구 사항, 다양한 식물 조직의 접근 가능성, 영양 / 환경 조건의 엄격한 제어 및 해충 / 질병 통제를 포함하여 수경법 모델의 몇 가지 장점이 있습니다. 수경 시스템은 한천 / 피토 아르 (phytoagar) 도금 기술과 비교하여 식물 생장을 제한하지 않으며, 2-3 주 후에 성장을 제한합니다. 중요한 것은, 전체 공장 구조의 유지 보수는 미생물 화성 및 독성 유도 (8), (29)에 필요한 천연 루트 분비를 촉진한다. 시스템 설명여기 침대는 대안 33 , 34 보다 간단하고 노동 집약적입니다. 더 적은 부품을 사용하고 표준 가위 이외의 도구를 필요로하지 않습니다. 이 제품은 식물 성장에 대한 강력한 지지제이자 미생물 성장을 지원하기위한 흔들림을 통한 멸균 조건 하에서의 단순 통기 방법 인 금속 망 (나일론 33 과 대조적으로)을 사용합니다. 또한이 시스템은 뿌리의 너비를 제한하지 않으면 서 다양한 식물 종을 수용 할 수있는 식물 성장을 지원하기 위해 다양한 크기의 금속 망을 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 수경 공동 배양 시스템에서, 식물은 접종 된 박테리아의 성장을지지하는 유기 화합물을 식물 뿌리가 분비하는 무균 수경계에서 재배된다. 이 공동 배양 시스템에서는 식물 세포 내 호르몬, 방어력 유발 물질 또는 독성 유발 화학 물질과 같은 인공 화학 물질이 보완되지 않으며 자연 세포를 반영합니다식물 - 미생물 상호 작용 동안 신호 항상성. 이 수경 공동 배양 시스템에 의해, 동시에 유전자를 아그로 박테 리움에 의한 감염에 따라 애기 장대 골-0 뿌리 조직에서의 발현뿐만 아니라, 애기 장대와 공동 배양시 아그로 유전자의 활성을 결정할 수 있었다. 이 시스템은 아그로 박테 리움 ( Agrobacterium )과 동시 배양 (감염)시 식물 뿌리의 분비 프로파일뿐 아니라 식물 뿌리에 대한 아그로 박테 리움의 부착을 연구하는데 적합하다는 것이 추가로 증명되었다 ( 그림 1 ).

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그림 1 : 샘플 분석과 함께 수경 공동 배양 시스템의 개요. 식물은 메쉬 (메쉬 위의 ​​싹)의 꼭대기에서 자랍니다. 수경 재배액에 담근 다음 뿌리를 수경 재배 배지에 넣고 박테리아 f또는 공동 배양. 식물 조직과 박테리아는 동시에 추출 및 분석을 위해 분리됩니다. 이 수치는 참고 35 에서 수정되었습니다.

프로토콜

1. 실험 계획법

  1. 실험의 구체적인 목표를 결정하십시오.
  2. 아래의 전체 프로토콜을 읽으십시오. 특정 목표와 관련된 섹션과 수정이 필요한지 여부를 결정하십시오. 예제는 아래를 참조하십시오.
    1. 실험에서 A. thaliana 식물과 A. tumefaciens 박테리아 (아래 참조) 또는 다른 식물 - 미생물 조합을 사용할 것인지 고려하십시오.
      참고 : 다양한 식물 종을 사용할 수 있지만 식물 뿌리의 두께는 다른 크기의 메쉬 (단계 3.3) 및 성장 매개 변수 (단계 3.10-3.11 및 4.4)와 수경 재배 탱크 크기 및 중간 체적 (단계 4.2)도 조정이 필요할 수 있습니다 ( 그림 2 ). 미생물은 순수 배양 물, 혼합 종 (컨소시엄) 또는 환경 시료 (미생물)로 쉽게 접종 할 수 있지만, 변경 사항은 프로토콜, 특히 4.5 단계에 영향을 줄 수 있습니다.
    2. 고려하다샘플을 분석하는 데 사용할 실험 유형
      참고 : 형광 현미경 (단계 5)은 형광 리포터 구조로 분류 된 유기체를 필요로합니다.
  3. 적절한 컨트롤을 디자인하십시오. 제어 박테리아와 박테리아가 접종되지 않은 제어 묘목이있는 탱크를 접종 한 모종이없는 수경 재배 탱크를 포함하십시오.
  4. 적절한 수의 씨앗과 수경 조로 실험을 계획하십시오. 대조군, 생물학적 복제물 (최소 3 개) 및 모든 분석에 필요한 조직의 양을 고려하십시오.
  5. 실험 목표를위한 적절한 양의 배양 기간을 결정하십시오 (단계 4.8).
  6. 필요한 경우 아래 단계를 수정하십시오.

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그림 2. P에 의해 지원되는 수경 시스템에서 재배 될 수있는 다른 식물의 예 금속 메쉬의 latform입니다. 다양한 식물 씨앗과 재배를위한 금속 망의 호환성. ( A ) Vicia faba 용 스테인레스 스틸 304 형 메쉬 3 × 3 메쉬 × .047 "다이아 본 와이어. ( B ) 스테인레스 스틸 304 형 메쉬 메쉬 4 × 4 메쉬 × 0.035"다이아 와이어 ( Zea mays 용) . ( C ) 스텐레스 강 304 형 메쉬 메쉬 4 × 4 메쉬 × Glycine max (대두) 용 .032 "다이아 본. ( D ) 스테인레스 스틸 304 형 메쉬 메쉬 6 × 6 메쉬 × .047 " 다이아몬드 와이어 ( Raphanus sativus) 무). ( E ) 스테인리스 강 304 형 용접 메쉬 6 × 6 메쉬 × 0.047 "다이아 와이어 ( Triticum spp.) ( F ) Cucumis sativus 용 스테인레스 스틸 304 형 용접 메쉬 6 × 6 메쉬 × .035"직경 와이어. 이 수치는 참고 35 에서 수정되었습니다.955fig2large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 식물 씨앗 표면 살균

  1. microcentrifuge tube에 500 μL의 탈 이온수를 넣은 A. thaliana 약 200 개의 종자를 (고속으로) 와동. 더 큰 씨를 가진 식물 종을 위해, 표면 멸균을 촉진하기 위하여 큰 관을 이용하십시오.
  2. 탁상용 미세 원심 분리기에서 30 초 동안 약 9,000 xg로 원심 분리하십시오. 피펫을 사용하여 물 (뜨는)를 제거합니다.
  3. 씨앗과 소용돌이에 2 % 차아 염소산 나트륨 300 μL를 넣으십시오. 실온에서 1 분간 방치한다. 더 큰 씨를 가진 식물 종을 위해, 더 큰 양을 씨를 포함하기 위하여 이용하십시오.
  4. 탁상용 미세 원심 분리기에서 30 초 동안 약 9,000 xg로 원심 분리하십시오. 피펫을 사용하여 차아 염소산 나트륨 용액을 제거합니다.
  5. 씨앗과 소용돌이에 멸균, 탈 이온수 500 μL를 추가합니다. 약 9,000 xg의 원심 분리기멸균 피펫을 사용하여 물을 제거합니다.
  6. 2.5 단계를 추가로 4 회 반복하십시오.
  7. 씨앗과 와동에 70 % 에탄올 500 μL를 첨가하십시오. 실온에서 1 분간 방치한다.
  8. 탁상용 미세 원심 분리기에서 30 초 동안 약 9,000 xg로 원심 분리하십시오. 피펫을 사용하여 70 % 에탄올을 제거합니다.
  9. 2.5 단계를 추가로 5 번 반복하십시오.
  10. 멸균 된 씨앗을 무균의 초순수 500 μL에 Resuspend.

3. 식물의 종자 발아 및 반고체 재배

  1. 반고체 Murashige and Skoog (MS) 매체 준비 : 2.165 g / L MS 기초 염; 10 g / L 수 크로스; 0.25 g / L MES; 및 5 g / L phytoagar와 함께 59 mL / L B5 비타민 믹스, pH 5.75.
  2. MS 매체를 오토 클레이브하십시오. 각 멸균 깊은 페트리 접시 (100 X 25mm 2 )에 그것의 25 ML을 부어.
  3. 각 페트리 접시에 스테인레스 스틸 메쉬 90 x 90 mm 사각형을 잘라냅니다.
    참고 : A. thaliana 의 권장 메쉬 < / em>은 304 등급 (표준 등급), 메쉬 수 (40mm x 40mm), 와이어 직경이 0.01 인치 (0.0254cm)입니다. 대형 수력 판 탱크의 경우 더 큰 메쉬 사각형이 필요합니다 또는 높은 플랫폼.
  4. 메쉬가 페 트리 플레이트 안에 들어갈 수 있도록 각 사각형 메쉬의 모서리를 구부리십시오. 모서리를 모서리에 90 ° 각도로 구부려서 모서리에 메쉬를 올려 놓고 뿌리 발달을 위해 충분한 공간을 남겨 둡니다 ( 그림 3a ).
  5. 비이커에 잘라 메쉬 사각형을 넣고, 알루미늄 호일로 덮고, 30 분 건조 사이클을 사용하여 고압 증기 멸균으로 멸균합니다.
  6. 배지가 페트리 접시에서 고형화되고 메쉬가 멸균되면, 구부린 모서리를 아래로 향하게하여 반고체 매질 위에 각각의 살균 된 메쉬 사각형을 놓습니다.
  7. 모서리가 매체를 관통하고 메쉬의 대부분이 매체의 윗면에 닿도록 메쉬를 밀기 (> 그림 3b).
  8. 개별 표면 멸균 된 A. thaliana 종자 (종자는 진공 력으로 인해 피펫의 끝 부분에 머무를 것임)를 그리기 위해 200 μL 이동 피펫을 사용하고 메쉬 상단에 각 종자를 부드럽게 옮깁니다. 씨앗을 실험적 필요에 맞게 적절하게 간격을 두도록 배치합니다 ( 예 : 4 6 개 / 플레이트).
  9. 페트리 플레이트를 뚜껑으로 봉합하여 다공성 외과 용 테이프를 모서리 주변에 배치하십시오.
  10. 어둠 속에서 2 일 동안 4 ℃에서 전체 페트리 접시를 놓아 씨를 계층화하십시오 ( 예 : 어둠을 시뮬레이트하기 위해 은박 줄에 감싸십시오).
  11. 페트리 접시에있는 종자를 22 ~ 24 ℃에서 16 시간 동안 10-14 일간 배양한다 ( 그림 3c ).

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그림 3 : 수경 식물 - 세균 공동 배양 시스템. 왼쪽 파nel은 수경법 공동 재배 시스템을 조립하고 운영하는 6 가지 주요 단계를 개략적으로 나타낸 흐름도입니다. 오른쪽 패널은 Arabidopsis-Agrobacterium 상호 작용을 연구 할 때 hydroponic cocultivation 시스템의 실제 실험 재료, 장비 및 작동 절차를 보여줍니다. 플랜트 또는 세균 샘플링을위한 접종 단계 및 최종 단계가 이제 표시됩니다. 이 수치는 참고 35 에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 수경 공동 배양 시스템

  1. 액체 무라시 및 스쿠크 (MS) 배지 : 2.165 g / L MS 기초 염, 10 g / L 수 크로스, 0.25 g / L MES 및 59 mL / L B5 비타민 믹스, pH 5.75를 준비합니다.
  2. 매체를 오토 클레이브하십시오. 멸균 된 원통형 유리 또는 투명 플라스틱 탱크 (결정화 접시, 100 x 80 mm)에 18 mL를 붓습니다.2) 멸균 뚜껑.
    참고 : 탱크와 뚜껑을 알루미늄 호일 및 고압 증기 멸균기로 포장하여 사전 살균합니다.
  3. 멸균 흐름 두건 있음, 부드럽게 부드럽게 수경 원통형 탱크 ( 그림 3d )에 반 고체 매체에서 10-14 일 오래 묘목과 각 메쉬 사각형을 전송하는 무균 포셉을 사용합니다. 다공성 외과 용 테이프를 사용하여 뚜껑을 탱크에 밀봉하십시오.
  4. 탱크의 메쉬에있는 묘목을 22-24 ℃에서 72 시간 동안, 16 시간의 광주기를 사용하여 통기를 위해 50 rpm으로 흔들어 주면서 배양하십시오 ( 그림 3e ).
    참고 : 이것은 식물이 미생물을 접종 (공동 배양)하기 전에 수경 환경에 적응하도록 허용합니다. 이 대기 기간은 접종 전에 우발적 인 미생물 오염이 명백하게 드러나게합니다.
    1. 잠복기가 끝나기 하루 전에 다음 단계를 시작하십시오.
  5. AB 배지에서 A. tumefaciens 를 자라십시오 .배양이 600 1.0의 최종 광학 밀도에 도달 밤새까지 진탕 28 ° C에서 (0.5 % / V 효모 추출물을 0.5 % w / v를 트립 톤, w 0.5 % / V 자당, 50mM의 황산, pH가 7.0 w) 나노 (OD 600), 빈 등 uninoculated AB 매체, 분광 광도계를 사용하여 측정한다.
    참고 : 1.0의 OD 600 은 약 10 9 세포 / mL와 동일합니다.
  6. A. tumefaciens를 같은 양의 0.85 % NaCl에서 3 번 씻으십시오. 같은 양의 무균 이중 증류수에 Resuspend.
  7. 접종하기 전에 모종으로 탱크를 조심스럽게 검사하여 오염이 없는지 확인하십시오. 오염되지 않은 탱크의 매체는 깨끗하고 투명해야합니다.
    1. 흐린 액체 (오염)가있는 탱크를 버리고 나머지 탱크의 번호를 매 깁니다. 각 번호가 매겨진 탱크에서 소량의 수경 재배 액을 채취하여 Luria broth (LB)가 채워진 페트리 접시에 담그십시오. 품다28 ° C에서 요리.
  8. 즉시, 각 번호가 매겨진 수경 조에 A. tumefaciens 현탁액 (OD 600 에서 추정 된 약 5 x 10 7 세포) 50 μL를 첨가합니다. A. thaliana 묘목과 A. tumefaciens 를 22 ~ 24 ℃에서 16 시간 동안 광양 기간과 50 rpm으로 흔들어 주십시오 ( 그림 3f ).
    1. 4.7.1 단계에서 발견 된 LB 플레이트를 검사하십시오. 12 시간 및 28 시간 배양 한 후 탱크의 무균 성을 확인 하였다. 오염이 있으면 더 많은 하류 분석을 위해 번호가 매겨진 해당 탱크 (박테리아 접종)를 사용하지 마십시오.
  9. 원하는 경우 탱크에서 배지 샘플을 꺼내어 비 접종 대조구에서 배지가있는 분광 광도계를 사용하여 OD 600 을 공시하여 일정한 간격으로 A. tumefaciens 의 성장을 관찰하십시오 ( 그림 4 ).
    아니TE : 식물 질병 증상은 7 일 후에 분명해야합니다 ( 그림 5 ).
  10. 메쉬 플레이트를 들어 올리면 A. thaliana 뿌리를 세균 현탁액에서 분리합니다. 이 단계의 타이밍은 다운 스트림 프로세스에 따라 다릅니다. 자세한 내용은 5-8 단계를 참조하십시오.
  11. 후속 분석을 위해 뿌리를 사용하는 경우, 두 번 증류수에서 뿌리를 빠르게 헹구십시오. 잎이나 기타 조직을 사용하는 경우 조직을 잘라냅니다. RNA 분석을 위해서는 즉시 단계 7.1로 진행하십시오.

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그림 4 : 수경 공동 배양 시스템에서의 Agrobacterium 성장. 식물 숙주 ( Arabidopsis )의 존재 또는 부재하에 Agrobacterium의 성장을 4 시간마다 모니터링 하였다. 아그로 박테 리움 세포를 AB 배지 O / N에서 재배하고, 0.85 % NaCl로 3 회 세척하고, 또는 수경 계에 접종 하였다Arabidopsis co-cultivation없이, 약 0.1의 초기 OD 600 에서. OD 600 값은 표준 편차 (1.0의 OD 600 = 1 x 10 9 세포 / mL)를 갖는 3 가지 생물학적 복제의 수단이다.

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도표 5 : Cocultivation 도중 대표적인 식물 표현형 및 Observable 질병 증후. 예방 접종 후 4 일 이내에 접종하지 않은 식물 ( B )에 비해 병의 증상은 보이지 않는다 ( A ). Cocultivation (감염) 7 일 후에 감염된 식물에서 질병 증상이 관찰되고 ( C ), 접종되지 않은 식물은 건강 상태로 유지된다 ( D ).

5. 형광 현미경

  1. A. autofluorescent 단백질을위한 리포터 구조를 갖는 A. tumefaciens 를단계 4.5 의 공동 배양 설정.
    참고 : dsRed 36 의 유도체 인 pCherry를 발현하는 변형 된 pJP2 플라스미드가 여기에 사용됩니다.
  2. 단계 4.8에서 적절한 공동 재배 ( 예, 48 시간) 후, 무균 가위를 사용하여 개별적인 2 차 뿌리 (주 뿌리의 측 가지)를 분리한다.
  3. 느슨하게 결합 된 물질을 제거하기 위해 이중 증류수로 뿌리를 헹구십시오. 현미경 슬라이드에 30 μL의 물에 각 뿌리를 담그고 유리 커버 슬립으로 덮으십시오.
  4. 뿌리의 탈수를 방지하기 위해 매니큐어로 coverslip의 가장자리를 봉인.
  5. 형광 현미경으로 A. thaliana 뿌리에 A. tumefaciens 의 첨부 파일을 시각화.
    참고 : 여기서, 헬륨 - 네온 (He-Ne) 543/594 nm 레이저로부터의 여기가있는 공 촛점 현미경을 사용하여 숫자 구멍이 반전 된 63X 물 렌즈 대물 렌즈 아래 590-630 nm에서 pCherry 빨간색 형광을 시각화합니다 (1.4 그림 6).

figure-protocol-8903
그림 6 : 공 촛점 현미경으로 결정된 Agrobacterium 루트 첨부. pCherry 적색 형광 표지 된 Agrobacterium 은 헬륨 - 네온 (He-Ne) 543/594 nm 레이저로부터의 여기와 함께 590-630 nm에서 가시화되었다. 시각화는 개구 수가 1.4 인 역전 된 63X 물 렌즈 대물 렌즈 하에서 수행되었다. 스케일 바 = 11 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 세균 대본 분석

  1. 단계 4.8에서 적절한 공동 배양 ( 예 : 8 시간) 후, 단계 4.9에서와 같이 수경 재배에서 뿌리를 분리합니다. 수경법 배지 1.5 mL를 1.5 mL 마이크로로 옮긴다.튜브를 원심 분리하고 12,000 xg에서 2 분간 원심 분리하여 세포를 펠렛 화한다.
  2. 뜨는을 제거합니다. 동일한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브와 수분 측정 매체 1.5 ML 다른 세포를 펠렛에 2 분 12,000 g에서 전송합니다.
  3. 뜨는을 제거합니다.
    참고 :이 프로토콜은 사용하기 전까지 샘플을 -80 ° C에서 정지시켜 일시 중지 할 수 있습니다.
  4. DNA 오염을 피하기 위해 DNase 처리 된 표준 방법 37 또는 적합한 상업용 RNA 분리 및 정제 키트를 사용하여 A. tumefaciens 세포에서 RNA를 추출합니다.
    참고 : 프로토콜은 사용할 때까지 -80 ° C에서 RNA의 얼리 포츠를 동결하여 여기에서 일시 중지 할 수 있습니다.
  5. 다음과 같은 표준 방법을 사용하여 다양한 분석을 위해 분리 된 RNA를 사용하십시오.
    1. cocultivated 대 대조군에서 차별적으로 발현되는 유전자 세트를 검출하기 위해 제조업 자의 프로토콜에 따라 상용 마이크로 어레이를 사용한다문화.
    2. 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 사용하여 특정 유전자의 발현을 검출하거나 마이크로 어레이 데이터를 검증 할 수 있습니다 38 .

7. 식물 대본 분석

  1. 단계 4.8에서 적절한 공동 배양 ( 예 : 8 시간) 후, 단계 4.9에서와 같이 수경 재배에서 뿌리를 분리하거나 필요에 따라 다른 조직을 분리합니다. 즉시 대략 150mg의 뿌리 또는 다른 식물 조직을 액체 질소에 넣으십시오.
    참고 :이 프로토콜은 사용하기 전까지 샘플을 -80 ° C에서 정지시켜 일시 중지 할 수 있습니다.
  2. 박격포와 유봉을 사용하여 냉동 된 시료를 액체 질소로 분쇄합니다.
  3. DNA 오염을 피하기 위해 DNase 처리 된 표준 방법 39 또는 적합한 상업용 RNA 분리 및 정제 키트를 사용하여 분말로부터 RNA를 추출하십시오.
    참고 :이 프로토콜은 여기에서 일시 중지 할 수 있습니다.사용하기 전까지 -80 ° C.
  4. 다음과 같은 표준 방법을 사용하여 다양한 분석을 위해 분리 된 RNA를 사용하십시오.
    1. 공동 제조 대 대조 식물에서 차별적으로 발현되는 유전자 세트를 검출하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 마이크로 어레이를 사용하십시오.
    2. qRT - PCR을 사용하여 특정 유전자의 발현 차이를 탐지하거나 마이크로 어레이 데이터를 확인하십시오 38 .

8. Secretome Profiling

  1. 단계 4.8에서 적절한 공동 배양 ( 예, 72 시간) 후, 단계 4.9에서와 같이 수경 재배에서 뿌리를 분리한다. 50 ML 원뿔 튜브에 0.2 μm의 기공 필터를 통과하여 hydroponic 매체 18 ML을 소독.
  2. -80 ° CO / N에서 샘플을 고정 시키십시오.
  3. 50 mL 원추형 튜브의 뚜껑을 풀고 36 시간 동결 건조기에 넣으십시오. 샘플을 저장하거나 처리하기 위해 계속 진행하십시오 (desHPLC 분석 및 화합물 검출에 대해서는 아래에 기재).
    참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다.
  4. 밀봉 가능한 테스트 튜브에 두 번 증류수 5 ML에 각 샘플을 Resuspend.
  5. 에틸 아세테이트 5 mL를 넣고 여러 번 튜브를 뒤집어서 섞는다.
  6. 실온에서 5 분간 상을 분리시킨다.
  7. 피펫 팅으로 상단 (유기상)을 새 용기로 옮깁니다. 필요한 경우 여러 유기물 분획을 모으십시오.
  8. 질소 가스 (약 45 분)의 부드러운 스트림 하에서 건조시킨다.
  9. HPLC ( 예 : 100 % 메탄올)에 적합한 용액으로 시료를 재 현탁하십시오.
  10. 표준 방법 40 에 따라 HPLC를 수행하십시오.
  11. 적절한 방법으로 화합물을 검출하십시오.
    참고 : Electrospray Ionization 비행 시간 질량 분석 (ESI-TOF-MS) 40 이 여기에 사용됩니다.

결과

수경 재배 동시 재배 시스템의 성장

A. tumefaciens C58의 성장 곡선은 초기 16 시간의 동시 배양에서 유의 한 지연 단계를 나타내었고, A. thaliana Col-0과 공동 재배 할 때 매우 안정한 성장을 보였으며, 최대 OD 600 은 48 h postinoculation. 대조적으로 A. thaliana가 없는 대조 배양에서는 본질적으로 박테리아 성장이...

토론

뿌리 분비의 점진적인 특성을 감안할 때, planta에서 생산 된 독성 유발 화학 물질의 농도와 역동적 인 식물 - 미생물 상호 작용에 미치는 영향은 공간적 및 시간적 변화에 따라 발생합니다. 이 수경 재성 공동 재배 시스템에는 미생물 독성이나 식물 방어를 유도하는 합성 식물 호르몬이나 화학 물질이 보충되지 않습니다. 대조적으로, 종래의 접근법을 사용하여, 아세토 독 온온 (acetosyr...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

그들의 도움과 유용한 토론에 대해 Brian Weselowski와 Alexander W. Eastman에게 감사드립니다. 우리는 또한 Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui, Greg Thorn의 도움을 받았고 유용한 토론과 원고를 읽었습니다. 이 연구는 농업 및 농업 식품 캐나다 (Agriculture and Agri-Food Canada), Growing Forward-AgriFlex (RBPI 번호 2555) 및 Growing Forward II 프로젝트 번호 1670의 자금 지원을 받아 작성되었습니다. 이 연구는 또한 ZC Yuan에게 수여 된 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 디스커버리 그랜트 RGPIN-2015-06052에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0)Arabidopsis Biological Resource CentreCS7000https://abrc.osu.edu/order-stocks
bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58)University of WashingtonN/A
labeled bacteriain-houseoptional, depends on downstream analyses
vortex(various)
microcentrifuge tubes(various)
microcentrifuge(various)
5% sodium hypochlorite(various)
double distilled water(various)
autoclave(various)
micropipette (various)
70% ethanol(various)
Murashige and Skoog (MS) basal saltsSigma-AldrichM5524
sucrose(various)
MES(various)
B5 vitamin mixSigma-AldrichG1019
phytoagar(various)
Deep Petri dishes(various)
stainless steel meshFerrier Wire Goods Company LtdN/Agrade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01
micropore tape, 1"3M1530-1
diurnal growth chamber(various)
cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm Pyrex3250other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment
flow hood(various)
forcepts(various)
yeast extract(various)
tryptone(various)
MgSO4(various)
shaking incubator(various)
spectrophotometer(various)
NaCl(various)
shaker(various)
scissors(various)optional, depends on downstream analyses
fluorescence microscope(various)optional, depends on downstream analyses
microscope slides and cover slips(various)optional, depends on downstream analyses
nail polish(various)optional, depends on downstream analyses
Bacterial RNA extraction kit(various)optional, depends on downstream analyses
plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit)Qiagen74903 or 74904optional, depends on downstream analyses
material and equipment for qRT-PCR(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for microarray analysis(various)optional, depends on downstream analyses
liquid nitrogen(various)optional, depends on downstream analyses
mortar and pestle(various)optional, depends on downstream analyses
0.2 µm pore filter(various)optional, depends on downstream analyses
50 mL conical tubes(various)optional, depends on downstream analyses
freeze dryer(various)optional, depends on downstream analyses
sealable test tubes(various)optional, depends on downstream analyses
ethyl acetate(various)optional, depends on downstream analyses
nitrogen gas(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for HPLC(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for ESI-TOF-MS(various)optional, depends on downstream analyses

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