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摘要

相分离巨 unilamellar 囊泡 (GUVs) 的实验常忽略生理溶液的条件。本文研究了盐缓冲液在荷电多组分 GUVs 中液体液相分离中的作用, 作为反式膜溶液不对称和温度的函数。

摘要

相分离的巨型 unilamellar 囊泡 (GUVs) 表现为共存的液序和液体无序域, 是研究脂筏假说的常用生物物理工具。然而, 许多研究忽视了生理解决条件的影响。在该帐户上, 目前的工作提出了盐缓冲和反式膜溶液不对称的影响, 液液相分离的 GUVs 生长从 dioleylphosphatidylglycerol, 鸡蛋磷脂, 胆固醇。研究了等温和不同温度条件下的影响。

本文介绍了在对称和非对称盐溶液条件下, 适用于监测带电泡中共存液域稳定性的设备和实验策略。这包括在高温盐缓冲液中制备带电的多组分 GUVs 的方法。该协议要求在最小化囊泡稀释的同时, 通过一个简单的稀释步骤来进行局部交换的外部溶液的选择。另一种方法是利用微流体设备, 允许一个完整的外部解决方案交换。在不同温度下, 对相分离的溶液效应也进行了研究。为此, 我们提出了一个 in-house 内置温度控制室的基本设计和实用。此外, 我们还考虑了对老爹阶段状态的评估、与之相关的陷阱以及如何绕过它们。

引言

自从用荧光显微镜观察液液相分离巨 unilamellar 泡 (GUVs) 中的微米畴后, GUVs 已被用作研究脂筏假说的模型系统1,2,3. 由于它们的独立双层的区域位于从生物细胞的范围内, 它们是适合假设的筏的等离子体膜的模拟。大量的研究对这种 GUVs 已进行了泡在纯净水, 蔗糖或盐分解决方案4,5,6,7,8。然而, 这些条件并不反映生物膜对盐环境和反式膜溶液不对称性的生理相关暴露, 这是细胞的条件。

在这项工作和在我们的小组的早先出版物9, 被审查的被充电的多组分 GUVs 的阶段状态作为盐和解答不对称的存在的作用在细胞膜。GUVs 是从不同比例的 dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), 鸡蛋磷脂 (eSM), 和胆固醇 (在蔗糖溶液 (与渗透 210 mOsm/千克) 或盐缓冲 (100 毫米氯化钠, 10 毫米三, pH 7.5, 210 的混合物制备。mOsm/千克)。脂质选择由在这个混合物的相图已经获得的数据辩解了6,8。

在文献10,11,12 (注意, 在这里, 我们将不考虑那些涉及脂质从油基转移到水相的方法)。13,14因为膜中剩余的油残留物可能会影响相行为的固有危险。盐缓冲区中 GUVs 的制备与特定的挑战有关。对于低离子强度的解决方案, electroformation 方法15,16提供了一种快速的方法来准备 GUVs 的高收益率和小缺陷10,17。该方法的基础是在导电表面 (电极) 上沉积一层脂质, 将其烘干, 并在应用交流电场时用水溶液对其进行保湿。但是, 如果盐水存在于水溶液18,19中, 则此方法需要进行调整。假定 electroformation 的泡生长驱动力为电16 , 在高电导率20中受阻。因此, GUVs 在盐溶液中的 electroswelling 不是一个简单的方法, 因为它需要对溶胀溶液中存在的不同盐浓度进行优化。凝胶辅助囊泡肿胀21,22是一个潜在的替代 electroformation 与更快速的形成时间。这种方法建立在增强的脂质膜水合时, 凝胶 (琼脂糖或聚乙烯醇 (PVA)) 作为基板使用。然而, 这些方法, 在 agarose-based 肿胀23和/或温度限制的情况下, 出现膜污染的风险, 如 PVA-based 肿胀。同样, 在纤维素纸基材上生长 GUVs 的协议最近已经建立了24。该方法的一般问题是缺乏对基质纯度的控制以及大量的脂质的使用。在这项工作中, 我们将介绍和提出的优势, 最传统的方法为老爹准备, 即自发肿胀方法25,26。它包括在拒水基板上干燥一个脂质层, 在水汽的大气中使其水化, 并在所需的溶胀溶液中随后膨胀 (请参见图 1和协议部分中的详细信息)。这种方法不提供控制的囊泡大小分布和结果的整体较小的小泡相比, 方法的生产是辅助的电场, 聚合物基板或微流控手段。然而, 囊泡的质量和大小是适当的检查膜相状态的探讨这里。

在囊泡膜的溶液之间产生不对称也与某些挑战有关。一个常用的方法是直接稀释泡悬浮在所需的外部解决方案27,28。然而, 这也减少了囊泡分布密度。另一种策略是在流单元的底部缓慢地交换外部解决方案, GUVs 可以解决 in-and outflux。为了避免干扰或甚至失去流动的小泡, 低流速应用了8, 这使得这种方法 time-inefficient。此外, 这两种方法都不能保证完全的外部解决方案交换。一个明显的解决办法是固定囊泡以避免在外部溶液交换过程中失去它们。例如, 化 GUVs 可以被拴在一个亲和涂层的表面29上。然而, 这种方法可能导致在粘附的和因此 non-adhered 膜段30,31的成分变化。磁场或电场在陷阱泡中的应用导致膜张力32。使用光镊诱捕囊泡需要有一个手柄附加 (即珠), 而光学担架的用途可能涉及局部加热33。GUVs 的捕获也可以通过在没有最终剥离34的情况下在铂线上生长来实现。然而这导致囊泡没有被隔绝, 并且通常连接到导线或其他小泡由稀薄的油脂管 (系)。

所介绍的工作突出了克服上述限制的战略。我们首先介绍了自适应和优化的自发肿胀法的 GUVs 在盐缓冲区生产的详细描述。然后, 我们引入了两种方法, 通过简单的稀释或利用微流体设备来有效地创建非对称的溶液条件。由于我们的目标是分析 GUVs 在不同的溶液条件下的膜相状态, 随后的章节描述了成功的统计分析的标准, 并提出了避免错误分类的提示。

在等温条件下以及在不同温度下进行了分析。温度 c控制是普遍使用的, 关于实验温度控制室的细节很少被描述。在这里, 一个 in-house 建立在不同温度条件下观察 GUVs 的设置。

研究方案

1. GUVs 的自发性肿胀

注: 氯仿是一种有害物质, 具有很高的挥发性。在通风柜下执行所有涉及氯仿的操作。不要使用塑料实验室如吸管提示或塑料容器来转移和/或储存氯仿溶液。氯仿溶解塑料, 这会污染溶液。改用玻璃注射器和玻璃容器。此外, 尽可能清洁的工作, 以避免引入杂质, 因为它们可能与膜相互作用。请注意, 在最后的老爹制剂中典型的脂质浓度是在 micromolar 范围内, 因此在该浓度范围内的杂质可能对膜的行为有很强的影响.

  1. 除基本设备外, 请准备好以下项目.
    1. 准备一个聚四氟乙烯 (聚四氟乙烯, 俗称特氟龙) 板的脂质沉积大小〜1.5 厘米 x 1.5 厘米和适当的厚度。用细砂纸把盘子粗糙在一边.
      注: PTFE 为拒水, 如果平滑, 则不会被氯仿溶液润湿。PTFE 板的两侧可以粗糙, 以避免混淆正确的一面, 为油脂沉积。应选择板材厚度以便于操作, 例如 它不太灵活, 并且可以很容易地由水合解决方案覆盖 (请参见 图 1 )。在这里, 我们使用了〜2毫米厚度的板材。一旦粗糙, PTFE 板可用于新的实验后, 适当的清洁 (步骤 1.3).
    2. 为最终的脂质膜水化和囊泡生长准备一个合适容积 (约15毫升) 的密封玻璃瓶.
    3. 准备一个密封的玻璃容器, 其中〜15毫升玻璃瓶适合; 它将用于创建一个水的气氛脂质膜 pre-swelling, 请参见 图 1 .
  2. 在 12-油- sn -磷脂-3-磷-(1 和 #39 的预期比率中准备4毫米脂质股;-甘油) (钠盐) (DOPG), 鸡蛋磷脂 (eSM) 和胆固醇 (含), 额外的0.1 摩尔11和 #8242;-dioctadecyl-3, 33 和 #8242;, 3 和 #8242;-tetramethylindocarbocyanine 高氯酸盐 (DiIC 18 ), 总脂浓度为4毫米。用氯仿作为溶剂。请参见 材料表 .
  3. 用商用洗洁精、乙醇和氯仿彻底冲洗 PTFE 板和玻璃容器, 最后将其烘干.
  4. 使用玻璃注射器, 沉积和均匀地分布 10-15 和 #181; L 的脂质库存到粗糙一侧的 PTFE 板, 以创建一个统一的脂质膜。使用注射器针, 以传播的解决方案, 如果需要.
  5. 将 PTFE 板放在干净的表面上, 并将其与沉积的脂膜枯萎在一起, 在60和 #176; C 去除氯仿。为了方便起见, 在干燥过程中, 将盘子放入清洁的和未密封的15毫升玻璃容器中.
    注: 高温确保脂膜在所有后续步骤中均处于均匀 single-liquid 状态.
  6. 干燥后, 将 pre-swelling 玻璃容器与去离子水填充到不允许浮力撞击〜15毫升玻璃瓶 (~ 1 厘米) 的水平, 请参见 图 1 .
  7. 将15毫升的玻璃瓶与 PTFE 板放入容器中, 并将其覆盖, 以使水的大气层出现, 请参见 图 1B .
    注: 冷凝水在内容器墙壁为成功的水汽饱和提供了一个好征兆.
  8. 让沉积的脂膜在60和 #176 的封闭玻璃容器内 pre-swell; C 为4小时。在这时间期间准备期望肿胀解答.
    注: 对于可以在较低温度下进行的囊泡制剂, 这一次可以非常 shortened-down 到几分钟-如果热水氮气或氩用于 pre-swelling 代替。
    1. 准备200毫米蔗糖或100毫米氯化钠, 10 毫米三, pH 7.5 与 HCl 一起调整, 热到60和 #176; C 来制造溶胀溶液.
  9. 在 pre-swelling 后, 从容器中取出带聚四氟乙烯板的 ~ 15 毫升玻璃。用注射器连接到0.45 和 #181; m 过滤器, 增加〜5毫升的肿胀溶液到15毫升玻璃瓶水合物的脂质膜.
    注: 将针固定在过滤器上可以减轻肿胀溶液的插入。预热的注射器和过滤器可能是可取的, 以确保 single-liquid 相状态的脂膜, 而增加肿胀溶液。过滤解决方案可最大限度地减少细菌或盐沉淀的有机污染物 等
  10. 密封15毫升的玻璃小瓶, 在 PTFE 板上保持水合脂质膜, 以减少蒸发。如果需要, 使用石蜡薄膜加强密封。将水合的脂质膜留在60和 #176; C 隔夜为最后的老爹肿胀.

2。收获 GUVs

注意: GUVs 的聚集和从 PTFE 基体中分离出来的结果在一个小 (约1毫米) 云状丛可见的眼睛。当没有使用荧光染料时, 它显得发白。否则, 它是根据荧光吸收光谱着色的。添加 DiIC 18 将呈现云粉红色 (请参见 图 2 )。囊泡集中在骨料中, 收获最大的囊泡产量.

  1. 将小泡的温度降低到1小时内的室温, 将活塞吸管塑料尖端的尖端切到 1/10, 使其能够通过孔口.
    注: 当固液相分离时, 冷却速率尤其重要, 因为它会改变固体的大小。在这里, 为了减慢冷却速度, 我们将样品与直径 5 cm x 9.5 cm x 7.5 cm (H x L x W) 的金属块进行接触, 在1小时内冷却到室温.
  2. 将簇上的吸管与适当的溶胀液量一起向上移 (请参见 图 2 )。重新暂停膨胀溶液中的骨料, 以创建对称溶液条件, 或任何所需的 iso 渗透溶液, 以创建不对称的溶液条件.
    注: 体积的下限受完全收获的骨料大小的限制。外部溶液被稀释, 为了评估精确浓度, 必须考虑囊泡溶液的体积.

3。荧光显微镜观察 GUVs 的位相状态评估方法

注意: GUVs 被掺杂 DiIC 18 作为荧光标记。这荧光优先地划分入液体无序 (Ld) 阶段。这允许荧光显微镜观察的领域产生的相分离在 GUVs。我们用 epi 荧光显微镜进行了相位状态评估。原则上, 这些观察也是可行的使用共焦激光扫描显微镜 (CLSM), 这也允许信号量化 ( 例如 , 以确定膜 unilamellarity)。然而, 在任何情况下, CLSM 需要更精密的设备和 (通常) 的 epi 荧光观察.

  1. 确定一个目标 ( 例如, 在此处使用的0.6 数字光圈 (NA) 的40X 放大倍数) 来观察 GUVs, 并在比较不同解决中相同成分的相态时使用它。n 条件。使用适当的激发和发射波长过滤器, 以使荧光观测与使用的荧光 ( 例如 励磁在560和 #177; 40 nm 和630和 #177; 75 nm 与 585 nm 的光束分配器之间, 用于 DiIC 18 ).
    注意: 相图中的相状态边界将取决于目标实现的分辨率, 因为它定义了要检测的微域的最小大小.
  2. 用于分析, 仅选择符合以下质量标准的 GUVs.
    1. 通过视觉观察不同的囊泡并比较其强度, 以确保 unilamellarity 膜的大小; 具有最低荧光发射强度的囊泡最有可能 unilamellar.
      注意: 自发肿胀可能会产生囊泡, 大量的巨囊不 unilamellar.
    2. 通过量化假想 unilamellar 巨泡的荧光发射强度, 并检查相应的信号在人群中的散射来进行额外检查。如果没有观察到不同 GUVs 之间的整数差异, 则它们都可能是 unilamellar 的.
      注意: 如果从常规脂质中制备出的囊泡是用一种固定的方法, 如自发性肿胀, 那么上述用于检测 unilamellar 囊泡的方法就足够了。如果建立一个新的老爹准备协议或使用非常规的血脂, 将需要更详细的研究来确认 unilamellarity。例如, 新协议制备的标记泡的膜荧光信号可与已建立方法制备的 GUVs 相比较;或膜孔隙蛋白和 #945;-溶血素可插入囊泡膜 24 。添加到囊外的染料, 然后进入他们的内部或不, 取决于存在的单或多层泡, 分别.
    3. 确保对域的老大有一个合理的最小直径仍然是可识别的.
    4. 确保老大有 (几乎) 没有瑕疵, 如突出或黏附的零件或内部结构.
  3. 将分悬挂在显微镜滑轨上并将其正确密封。准备一个观察室.
  4. 将样品存放在显微镜滑梯上。环绕它由一个有机硅垫片与中央圆形保险开关。为避免污染, 请确保垫片与样品不接触。通过在硅胶垫片的顶部放置一个盖子滑动来密封内部.
    注: 而不是硅胶垫片, 你可以使用硅脂或自制的 polydimethysiloxane (硅橡胶) 间隔。密封室确保样品的最小蒸发, 并保持 iso 渗条件.
  5. 将示例保留5分钟以 re-equilibration 可能的域.
    注: 从移的机械应力可能混合膜域, 需要时间进行改革.
  6. 将显微镜幻灯片与样品放到显微镜阶段, 并在统计方法中分析老大批次的相状态。每个批次观察超过 30 GUVs, 并根据以下标准确定其相状态: DiIC 18 ( 图 3 ).
    注: 在生长后, 囊泡可能会因 (例如) 畴芽脱落或通过纳米管交换膜材料而改变各自的成分。因此, GUVs 在同一批 35 中展示了组合变体。
    1. 单液相是液体有序 (Lo) 或液体无序 (Ld): 确保整体的老大形状是球形和平滑的, DiIC 的 18 在膜上均匀分布 (第一个图像在上部和底部面板中强类 = "xfig" > 图 3 ).
    2. 两阶段 Lo + Ld 共存状态: 确保囊泡呈现出具有平滑边界的圆形区域; 根据 DiIC 18 分区行为域是亮红色 (Ld) 或暗红色/黑色 (Lo) (第二个图像在上部和 图 3 中的底部面板, 以假颜色。检查这些域是否可以在囊泡表面上自由扩散并能合并.
    3. 两相固态 + 液态 (s + Lo 或 s + Ld) 共存状态: 确保域可能出现手指状或圆, 但具有角度边界 (在图 3 中的上、下面板中为第三个图像)。在不显示扩散的实心 (黑色) 背景上观察液体域 (红色)。相反, 实心 (黑色) 域将在液体背景中自由扩散 (红色).
    4. 三相 + Lo + Ld 共存: 观察出现的三种类型的域: (i) 有角的黑色域, 嵌入在 (ii) 暗淡 (Lo) 和 (iii) 亮 (ld) 红色域中.
  7. 将 GUVs 的填充归因于在随机抽样中被确定为占主导地位的阶段状态, 如以下示例所示:
      如果 20 single-liquid GUVs 和 15 Lo GUVs, 则将该批视为single-liquid 阶段.
    1. 如果十年代 + L GUVs、30 lo + Ld GUVs 和 25 single-liquid GUVs 被观察到, 请考虑批处理为 lo + Ld.

4。微流控设备中的老大观察

注意: 首先制作微流控装置; 微流体器件设计和组件的详细信息已在其他地方得到了 36 , 37 ;有关简短说明, 请参见 图 4 .

  1. 准备新的老爹肿胀溶液 (根据步骤1.8.1 的盐或蔗糖), 并通过0.45 和 #181; m 过滤器.
    注: 流动溶液中的任何杂质都可能堵塞微流控装置.
  2. 剪切200和 #181; L 活塞吸管的塑料提示, 并把它们放在孔中的一个设备的硅橡胶部分。增加100和 #181; l 和5和 #181; l 的新鲜和过滤膨胀液的水库 (见 图 5A ) 和每一个切割吸管提示, 分别。离心机的整个设备在 900 x g 为10分钟的摆动转子离心机填充的设备和消除空气.
  3. 预填充1毫升玻璃注射器和附加油管与膨胀液, 并将柱塞位置移动到0毫升.
  4. 将油管放入设备的流体出口, 并将注射器放入注射器泵中.
    注: 注射器和注射器品牌的选择并不重要。然而, 玻璃注射器更精确, 泵应该能够在和 #181 的操作; L/分钟的流量范围.
  5. 将自定义压力控制单元连接到微流体控制层的8入口 (请参见 图 5A )。将压力控制单元设置为 3 bar (空气、氮气或氩气), 但将阀门设置为微流体设备到关闭位置.
  6. 将微流控设备, 现在连接到注射器泵和压力控制单元, 在一个倒置共焦显微镜阶段.
    1. 使用与大容量观测期间相同的放大率和 NA 的目标。如果使用另一个目标来避免基于不同分辨率的观察工件, 则控制如果步骤3.7 中所述的阶段状态统计信息仍保持不变.
  7. 将 GUVs 加载到设备中.
    1. 首先, 移除了25到50和 #181 的所有解决方案。添加150和 #181; L 的老爹解决方案 (无论是蔗糖或盐根据步骤 1.8.1, 但匹配的 解决方案, 用于填充的设备在步骤 4.1) 到水库和混合的温柔移。将注射器设置为10和 #181; 在撤退模式下的 L/分钟流速约20分钟或直到超过90% 的陷阱被占领.
      注: 水库不应允许运行干燥。如果发生这种情况, 气泡将进入微通道。向 reservoi 添加更多的老爹解决方案r 在加载时, 但注意不要引入气泡时, 移到设备.
  8. 打开所有的压力控制单元阀门, 以关闭 GUVs 周围的微流体环阀。将注射器泵设置为0和 #181;1小时后, 观察 GUVs 并记录共焦图像。根据所使用的荧光激发和检测 GUVs ( 例如 激发在 561 nm, 检测介于 580-620 nm 之间, DiIC 18 )。使用步骤 3.6 中的相同选择条件, 并注意记下每个老大的位置 ( 即 列和行号, 见 图 4 )
  9. 交换解决方案 周围的 GUVs.
    1. 将注射器泵设置为0和 #181; l/分钟和吸管离开所有, 但25到50和 #181; l 从水库的老爹解决方案。添加150和 #181; L 第二解答 (在蔗糖或盐根据步 1.8.1, 根据期望解答在 GUVs 外面) 到水库和由柔和的移混合。移除25至50和 #181; 从水库的缓冲液的 L.
      注: 此解决方案必须使用0.45 和 #181; m 过滤器进行过滤.
  10. 重复上一步至少5次以彻底替换库中的解决方案。将注射器设置为10和 #181; 提取模式下的 L/分钟流率为〜10分钟, 以更换微通道中的解决方案.
  11. 将流量降低到1和 #181; L/分钟打开8压力控制单元阀2秒, 再次关闭 (导致微流体环阀的开闭)。将流率设置为0和 #181; 再一次.
  12. 1 小时后, 观察 GUVs 并记录共焦图像。再次, 注意记录每个老大所在的微腔的列和行, 以便在外部缓冲交换之前和之后对同一老大进行比较.

5。温度控制箱的设计与标定

注意: 一个合适的温度控制室可以获得商业或国产。温度控制通常是通过热耦合的会议厅与老爹样品的水浴或一个珀尔耳元件。在这里, 我们描述了一个国产温度控制室的设计和性能与外部水恒温器操作。这种恒温器可在许多实验室中使用, 也可以从诸如激光器或光谱仪等旧设备中抢救出来.

  1. 在这里组装一个热流室, 由一个铝块组成, 连接到水浴, 如 图 6 所示。密封的顶部和底部的开口, 并使明亮的现场观察的样品, 通过胶水盖眼镜块.
  2. 翻转流室的一侧的样品将放置和吸管一滴约100和 #181; L 的解决方案使用的实验根据步骤1.8.1。(可选) 插入光纤温度探头 ( 例如 FISO FTI-10) 或在适当浓度下添加温度敏感染料, 例如 500 和 #181; M 罗丹明 B.
  3. 将老爹观察室装配在环形形状或其它一些垫片 (PTFE 或橡胶) 上, 用0.17 和 #181 的硅脂封盖。确保下落不与密封剂或垫片接触, 避免杂质的引入.
  4. 缓慢地将组件倒置, 并将外部水恒温器与适当的油管连接起来。特别注意漏水.
  5. 设置外部水温恒温器上的最低期望温度, 并让系统平衡直到温度传感器读数稳定为止; 平衡所需的时间将给出系统最小响应时间的估计.
  6. 在开始使用会议厅之前至少执行一次控制实验.
    1. 测量解决方案温度 ( 例如, 使用玻璃纤维探头), 并将其与温度范围内的恒温读数进行比较.
    2. 检查从恒温读数和测量温度的线性度的最小偏移量.
    3. 使用温度敏感染料检查观察室内的温度梯度。通过荧光强度或荧光寿命成像显微镜 (电影) 测量溶液温度, 从底部覆盖滑动 40 进行不同的距离。另外, 检查是否有任何温度梯度在老大观察区域, 如 图 7 所示.

6。不同温度下的老爹观察

注意: 通常情况下, 对于 GUVs 的膜可能相分离, 而且在观察温度下似乎是均匀的, T obs , 相分离将在 T obs 下面引起的 (是否被观察到取决于所调查的温度范围)。反之, 相分离的泡应在高于 T obs 的温度下变得均匀。然而, 这并不需要一个特定的 (复杂) 脂质组成的情况, 它可能是有趣的总是扫描整个可访问的温度范围 38 。相变温度的观测和评估协议不依赖于温度控制的具体方法.

  1. 根据 5 节 组装温度观察室, 省略光纤温度探头或温度敏感荧光.
  2. 将外部水浴设置为室温 (23 和 #176; C), 并让系统平衡10-15 分钟.
  3. 使用步骤3.6 中的标准计算相分离的囊泡的数量; 总体阶段状态的老爹将给出一个关于该区域的过渡温度的系统。如果阶段状态横跨囊泡人口是相当异种的直接地进入步骤 6.5.
  4. 增加 (如果大多数囊泡是相分离的) 或减少 (如果大多数囊泡是均匀的) 温度在粗区间 ( 如 1-2 和 #176; C), 并让系统平衡约2分钟. 重新评估的阶段状态老爹的人口通过随机抽样和变化的温度, 直到囊泡的人口显示一个异构的阶段状态.
  5. 一旦种群接近相变点 ( 即 单个 GUVs 之间的相位状态相当不均匀), 请减少温度区间 ( (如 0.5 和 #176; C) 以增加分辨率。让系统平衡2分钟, 并通过随机抽样重新评估老大种群的相位状态.
  6. 一旦传递了相变点, 就保持温度的变化, 直到所有的 GUVs 都是均匀的或相分离的.
  7. 检查迟滞以评估平衡时间是否足够.
    1. 更改温度扫描的方向, i。e. 如果扫描是为了提高温度, 则通过降低温度来进行扫描.
    2. 选择至少一个温度子集来评估老爹的总体相状态比率 ( 例如 80% 相分离).
    3. 如果两个方向之间的实质性偏差在相状态比率表明滞后, 减少温度步大小和/或增加平衡时间在步骤6.4 和 6.5.
    4. 如果没有相等比率表示的滞后, 请考虑增加步长和/或平衡时间.
  8. 根据温度绘制相状态比率。为了量化, 请将数据适合于适当的模型 ( 图 8 ).
    注: 相变曲线通常以 sigmoidal 轨迹为特征, sigmoidal 玻尔兹曼模型提供适当的管接头参数集:
    figure-protocol-10071
    y :均匀/相分离 GUVs 的分数
    一个 1 : 初始分数值
    2 : 最后分数值
    : 温度
    t 混合 : 温度在 half-maximal y
    由于 y 是均匀 GUVs 的分数, 因此 a 1 和 2 应分别固定为0和1。当混合相变被假定为 sigmoidal, 一旦分数值被测量为0在一定的温度下, 温度范围的所有分数值都被认为是0。反之亦然, 一旦分数值是1在一个特定的温度, 所有的分数值的温度范围以上被假定为 1.

结果

老爹肿胀

在这里描述的自发肿胀的方法, GUVs 组成的 DOPG, eSM, 并在一夜之间生长210毫米蔗糖或100毫米氯化钠, 10 毫米三, pH 7.5 形成一个可见的总和。收获的总和确保高泡的产量。悬浮在溶胀溶液中产生了对称的反式膜溶液条件。为了创建非对称条件, 聚合体分别在 iso-渗蔗糖或盐溶液中悬浮 (图 2)。由此产生的稀释对应于一个 quasi-external 的溶液交换, 同时尽量减少 GUVs 的稀释次数。

用荧光显微镜研究 GUVs 的相图映射

在 GUVs 中存在0.1 摩尔的相位特异性 DiIC18 , 可以通过广域荧光显微镜观察其相状态。通过 63 x/1.2NA 观察到的囊泡表现为 S + L 相分离, 能够解决结构精细的手指状区域。对于所有剩余的病例, 使用了 40 x/0.6 NA 目标。为了避免工件在 GUVs 的视觉检查和最大限度的再现性, 确定了一些标准, 决定了哪些囊泡要考虑的阶段状态分析 (协议步骤 3.6)。

GUVs 制备的三元 DOPG/eSM/与广泛的比例在蔗糖或盐溶液中肿胀的混合物, 在室温下观察到均匀的 lo 或 ld 阶段, lo + ld, 和 S + L 相分离, 请参见图 3。 图 9显示 exemplarily 缺陷的囊泡, 不应包括在数据分析中, 也显示了如何识别多层囊泡。

由于其未知的历史, GUVs 很可能会出现在批次成分变化35。因此, 在统计方法中确定了某一特定成分的整体阶段状态。某种脂质组成的老大群被归因于在一个随机抽样中被观察到占主导地位的相位状态 (协议步骤 3.6)。然而, 靠近 Lo + Ld 共存区的组合物通常会产生批次, 而占主导地位的相状态占少数。对于这种模糊的情况, 目视检查重复了至少三独立样本。在随机样本中, 具有相同相位状态 (如显示 Lo + Ld 相分离) 的小泡的分数平均超过了作为最终结果 (图 10) 的试验次数。

所描述的协议导致在 DOPG、eSM 和盐和蔗糖溶液中的不同比例的大范围内有足够的老大生长。三元相图中的广泛区域可以在对称和非对称盐解条件 (图 11) 下映射。在不同的溶液条件下观察到的囊泡相行为的差异在其他地方详细讨论了9。

用微流控法进行完全缓冲交换后的相行为观察

通过稀释产生不对称溶液的条件会导致外溶胀液的残留。我们的微流控方法允许一个完整的外部解决方案交换。图 5A显示了在共聚焦显微镜舞台上与流体出口和压力控制入口完全组装在一起的微流控设备。管子通过90°金属管子连接, 允许空间从上面传送光成像。

在微流控装置内进行观察, 采用 63 x/1.2NA 水浸物镜的共聚焦显微镜。与以前的观察散装, DiIC18被用来染色的膜。在对被困在装置中的 GUVs 的相状态进行观察时, 必须注意不要曲解数据。由于 GUVs 与柱子的接近, 励磁和发射光路可能被部分阻碍由由的被导致错误出现的领域 (图 12)。在这里, 透射光检测是有用的检查的位置, GUVs 在员额。这种不必要的影响是特别突出的小 GUVs 小于10µm 直径。在这些情况下, 数据被拒绝。在图 13A中的共焦图像显示了一个平面的泡状部分, 它横跨在老爹泡上的 Lo 域上。在这种情况下, 平面剖面扫描进一步高于或低于该节将没有显示的领域, 因为它的小规模相比, 老大, 这就是为什么它会被忽略和囊泡被认为是在同一阶段的状态。因此, 应该使用一个共焦 z 栈来检查整个老爹的表面。对于广域显微镜, 这可能不是一个问题, 因为整个囊泡可以立即成像。

最后, 给出了 GUVs 在外部解的交换之前和之后的例子, 其中清楚地说明了膜的相状态 (图 14)。每台设备有60个腔室 (每台都有一对柱子来诱捕单个的老大), 每台设备允许进行数十次实验 (参见图 4)。但是, 一些 GUVs 可能会在外部解决方案交换过程中丢失。这可以通过以下步骤最小化: 1) 使用牛血清白蛋白 (BSA) 涂层, 以防止在柱子上的老爹粘连/破裂;涂层是通过将腔壁暴露给20毫克/毫升 BSA 进行60分钟的, 随后用工作缓冲器冲洗。另一个可以使用的粘合剂分子是聚 (l-赖氨酸)-接枝聚 (乙二醇)39。2) 仔细的渗透匹配的内外解决方案, 以避免弛缓性 GUVs, 这可能会通过中心的职位或爆裂的 GUVs。3) 优化老爹的准备程序, 以获得直径大于 ~ 8 µm 的囊泡, 以防止通过柱子中心的通道。

温度控制室的设计与表征

我们设计了一个简单的流室, 它具有与外部水温调节器的连接 (图 6)。我们获得了由铝块铣削的室。一般而言, 室内材料不需要热传导, 因为样品是耦合到水浴由较低的盖玻璃, 如图所示, 6B和6C。

独立于精确的设计, 应评估分庭的性能。具体地说, 我们检查了样品温度的线性度与 externally-set 温度, 任何系统的温度偏移量, 并在会议厅内的温度梯度。前两点通过光纤温度探头 (例如FISO FTI-10) 在燃烧室内进行直接温度测量来解决。我们还检查了一个温度梯度在老大悬挂。这种梯度可以从热量流向腔室的外部。空间分辨温度测量可以通过温度敏感荧光40获得, 请参阅图 7。

用于获取相分离的 GUVs 的T混合的数据绘制和拟合

在观测到的温度范围内, 绘制均匀 GUVs 的分数, 形成 sigmoidally 形状的数据点轨迹。我们将数据与玻尔兹曼模型 (协议节 6.8) 相匹配, 从中可以推断出T混合的(图 8)。

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图 1: 自发肿胀协议 (顶部面板) 中的实验步骤 (下面板) 与相应的囊泡生长阶段.(a) 均匀的脂质膜分布在粗糙的聚四氟乙烯板上, 并从任何溶剂中干燥。(B) 干燥的脂质膜在封闭容器内的水气氛中 pre-swollen, 以促进双层水化。空玻璃瓶包含 PTFE 板, 并保持开放在这个水化步骤。(C) pre-swollen 脂膜最终通过将所需的溶胀液添加到玻璃小瓶内的脂涂层 PTFE 板上而完全水合。为了避免蒸发, 玻璃瓶在夜间孵化过程中被正确密封。为了使批次中的成分变化最小化, 所有的步骤都需要在脂质混合物完全混溶的温度下进行。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 2: 老大收割.(a) 一个沉积的脂质膜, 由 DOPG/eSM/在摩尔比率为 20/60/20 与0.1 摩尔 DiIC18是肿胀的盐缓冲组成的100毫米氯化钠, 10 毫米三, pH 7.5。玻璃容器的盖子另外被密封了与石蜡影片。放大的感兴趣区域包含所产生的老爹集合。它的红色外观是 DiIC18存在的结果。(B) GUVs 是用截断的吸管尖端收割的。在这张图中, 聚合体与50µL 溶胀液一起 pipetted, 并被转移到一个新鲜的瓶子里。(C) 创建不对称的反式膜溶液条件时, 聚合体被稀释在另一个等渗外部溶液中。在这里, 聚合连同50µL 溶胀溶液是悬浮在950µL 蔗糖溶液, 导致20x 稀释溶胀溶液。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 3: 老爹影像.GUVs 掺杂0.1 摩尔 DiIC18的广域荧光图像在对称盐或蔗糖溶液中制备和观察, 由 DOPG、eSM 和正离子的不同比例 (在盐缓冲中, 从左到右:40/20/40; 50/20/30; 30/60/10;蔗糖, 从左到右:30/30/40;20/60/20;40/50/10)。图像描述 GUVs 在不同的 (共存) 阶段状态根据标准在协议步骤3.6 评估。在这里, 囊泡通过 40 x/0.6 NA 目标成像。缩放栏 = 5 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

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图 4: 微流控通道设计的布局.GUVs 通过储层下方的入口进入较低的射流层 (轮廓通道)。过滤器阻止设备中不需要的碎片。然后, 他们输入一个60室 (8 行和15列) 的数组, 每个包含一个单老大捕获的帖子 (参见 insert)。每个腔室都可以被隔离在一个控制层 (填充黑色通道) 驱动的环形阀内的流体层之上。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 5: 微流体设备(a) 用于捕获单个 GUVs 的微流体设备的照片, 并完全交换外部解决方案。标签指示水库添加解决方案 (1), 8 x 压力入口连接到压力控制单元 (2), 以及与注射器和泵 (3) 连接的流体出口。面板 (B) 显示的压力控制单元, 每个调节1管连接到微流控装置的8阀。在这里阀门 #1 和 #2 是开放的, 因此相应的环形阀门是闭合的。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 6: 温度控制室.(A) 分庭在程序集之前。(B) 组装室 (正面朝上), 2 毫米的盖子玻璃粘在顶部和底部。橙色橡胶间隔测量0.5 毫米的高度和密封的0.17 毫米的盖子滑动, 以观察封闭的老大悬挂。在这个图象温度探针入为定标目的 ( 褐色纤维退出房间在右边 ) 。(C) 在无温度探头的倒置显微镜的舞台上进行最终组装。橙色橡胶垫片现在正向下。橡胶是足够的粘合剂来保持样品到位。请注意, 光可以通过样品进行传输, 同时能进行 epi 荧光和明亮的野外观察。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 7: 温度敏感染料的电影测量所获得的观察室内的空间解析温度数据(这里: 500 µM 罗丹明 B)40. 在底部盖板上方的0、10、30、300和400µm 获得的数据点。分别对30° c 和12° c 设置的水浴温度测量了红色和蓝色数据点。黑色数据点表明, 水浴左到平衡到室温。整个会议厅的温度变化较小, 但保持在0.5 ° c 以下 (灰色条)。总房间高度是大约500µm 根据间隔厚度 (参见上述)。误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 8: 查找混溶温度.该图显示了同质 (single-liquid 状态) 的单个数据点, 从 DOPG/eSM/GUVs 的比例 30/40/30 掺杂与0.1 摩尔 DiIC18从三独立随机抽样 (N = 20-40) 的分数。误差线表示标准的方法误差。数据点安装在步骤 6.8 (连续黑线) 中描述的玻尔兹曼模型上, 根据 sigmoidal 的半最大值推导出域混合温度T混合(按照红色连续线横坐标)。曲线在纵坐标上 (虚线黑线)。初始和最终值 (1和2) 分别固定为0和1。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 9: 有缺陷的囊泡.例如, 从 20/60/20 DOPG/eSM/摩尔, 如果 DiIC18不符合在宽场荧光显微镜成像的步骤4.2 中设置的标准, 则为其准备的巨泡的例子。每一次图像的强度显示范围都是针对所描述囊泡的荧光强度而优化的。由于存在额外的膜材料和封装小泡, 在 (A) 中的囊泡的相状态不能被清楚地定义。这种巨型泡的外观不允许对 lamellarity 进行任何可靠的目视检查。面板 (B) 描述了一个泡, 其中的内部挤满了膜材料。因此, 外囊泡膜的荧光信号与其内部信号叠加, 使 lamellarity 和潜在域的可视化成为不可能。(C) 三不同巨泡的荧光强度在同一显示强度范围内直接比较显示。这个图像显示, 巨大的多层泡 (1, 2) 可以识别其增加的荧光信号比老大 (3)。在这里, 多层以及 unilamellar 巨泡展示了 Lo + Ld 相分离。所有图像中的囊泡都是通过 40 x/0.6 NA 目标成像的。缩放栏 = 5 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

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图 10: Lo + Ld 相分离的 GUVs 在至少三独立样本上的平均分数.囊泡由 30/40/30 DOPG/eSM/近距离边界的 Lo + Ld 共存区组成。对称蔗糖条件的误差条说明了批次散射。纵坐标的标签描述囊泡内/外的溶液;蔗糖: 210 mM 蔗糖;盐: 100 毫米氯化钠, 10 毫米三, pH 7.5;误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 11: 使用 210 mm 蔗糖 (蔗糖) 和 100 mm 氯化钠、10 mm 三、pH 7.5 (盐) 在不同溶液条件下绘制的 DOPG、eSM 和 GUVs 制备的相图.在蔗糖/蔗糖 (A中探讨了老大相状态; 上部部分), 蔗糖/盐 (入/出) (A; 下部多边形剖面), 盐/盐 (B; 上部), 和盐/蔗糖 (b; 下多边形部分)。这些卡通在突出显示的部分和相应的解决方案条件中说明了主导域模式。在不对称的溶液条件下, 在20x 的老爹稀释下, 观察到低多边形剖面中的囊泡相状态。改编自引用9。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 12: 被困 GUVs 中的工件.一个小老爹的例子, 一个虚假的领域, 可以看到由于接近与职位 (DOPG/eSM/60/20/20)。显示柱子的亮场透射光图像 (gr) 被覆盖的老爹 (橙色) 共焦荧光图像。这些柱子被视为在明亮的图像中产生干涉图案。荧光信号关闭的职位 (右) 减少给予相分离的外观。缩放条 = 5 µm。

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图 13: 两个不同的 GUVs 的例子, 它们捕获的是在相位状态清晰可见的情况下.(A) DOPG/eSM/60/20/20 的 Lo-Ld 相分离泡(B) 由 40/30/30 的囊泡制成, 显示 Ld 或 Lo 单相。对整个囊泡的共焦 z 栈进行了检查, 以确认没有 (焦) 域存在。柱子的边缘在图片的右手边被看见 (灰色)。缩放条 = 5 µm。

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图 14: 使用微流体设备进行完整的射流交换后产生的相位行为.相同的老大是在解决方案交换前和之后显示 (A) 对称盐/盐 (入/出) 到盐/蔗糖 (入/出) (DOPG/eSM/60/20/20, 比例条是2µm) 和 (B) 对称蔗糖/蔗糖 (入/出) 蔗糖/盐 (入/出) (DOPG/eSM/30/40/30, 刻度栏 = 3 µm)。改编自引用9。

讨论

对称和非对称盐条件下的相态观测 GUVs 的成功生产

这里提出的协议介绍了一种策略来评估盐缓冲和溶液不对称对膜相状态的荷电 GUVs 在广泛的组合物的影响。实现这一目标的主要挑战之一是在盐缓冲区中生产带电的 GUVs。

我们成功地生产了 GUVs 在蔗糖溶液和 high-saline 缓冲的简单自发肿胀方法, 其中包括 pre-hydration 步骤的沉积脂质膜和隔夜最后水化步骤的囊泡生长。重要的是要注意, 脂质沉积应在粗糙的聚四氟乙烯板, 以确保均匀的脂质传播, 以产生 unilamellar 泡。此外, 它是必不可少的执行每一个步骤, 在囊泡准备在一个温度下, 脂质膜是在一个均匀和液相状态。另外, 囊泡的数量可能是多的, 并对最终的种群阶段状态分析产生偏见。GUVs 自发肿胀的具体协议产生一个囊泡丛, 它一方面提供了 re-suspend 小体积以获得高度浓缩的囊泡分散体的可能性, 另一方面提供了不对称的溶液通过膜的条件, 同时尽量减少泡的稀释8,28。重要的是, 在囊泡稀释或外部溶液交换, 内外 osmolarities 保持匹配的形态学变化引起的渗透不匹配可能诱发或防止 Lo + Ld 相分离41或, 在低渗的情况下条件, 可能导致囊泡爆裂。

在这里, 试图优化 electroformation 协议在盐的解决方案导致生产无 GUVs, 而 PVA 辅助肿胀产生多层泡。尽管它需要更长的准备时间和结果在小泡批次的低质量10,17, 成功生产的带电泡由自发肿胀带来了额外的优势。它要求最小的努力, 而导致足够的收益率统计批次分析, 不像 electroformation, 不需要先进的设备或优化。此外, 没有任何污染物的脂质氧化已观察到42,43。根据文献, 囊泡的脂质组成与它们生长的相应种群之间没有差异7,17。此外, PTFE 衬底上的泡形成不提示包含任何污染物与凝胶辅助肿胀方法, 在这种情况下, 外分子可能由基底23引入。Electroformation 在创造不对称的溶液条件时会伴随着过多的囊泡稀释而产生更多的缺陷。GUVs 产生的 electroformation 通常是作为一个均匀的分散 (与高度集中的囊泡悬浮在自发肿胀形成的形式形成对比)。任何稀释的外部溶液也会极大地稀释囊泡的数量。此外, 在这项工作的过程中观察到, electroformation 在蔗糖中产生的 DOPG/eSM/GUVs 在盐缓冲液中稀释后变得不稳定。显微镜下的脂质片上的荧光表明, 囊泡在视力检查之前会破裂。这种不稳定性可归因于 electroformation 制备的囊泡膜张力升高, 与自发肿胀的10相比。

虽然囊泡稀释是一种简单而快速的方法来创建不对称的老爹解决方案条件, 它只完成了部分外部解决方案交换, 虽然是一个很高的分数 (这里: 95%,图 2), 作为稀释后的痕迹肿胀解决方案将保持。外部溶液交换的程度的选择是在移与肿胀溶液 (2 节) 之间的平衡, 而不是稀释太多。因此, 我们介绍了一种替代的微流控方法, 在其他地方详细讨论了37 , 允许在老大阶段状态观测期间进行快速和完整的外部解决方案交换, 以验证为稀释而进行的相位状态观测泡.在从对称到非对称溶液条件的变化时, 观测到的相位状态变化确实是一致的。此外, 这两种生成非对称解决方案条件的方法都是比较快速的 (对比 Ref.8), 并没有任何已知的本地组合更改风险 (比较引用30、31),增加膜张力 (比较参考32), 或局部加热 (比较参考33), 至于介绍中讨论的替代方法。在微流体捕获过程中, 囊泡内部与外部的渗透平衡不仅是避免上述阶段状态伪影的必要条件, 而且是高渗溶液条件引起的通货紧缩, 可能导致被困 GUVs 滑倒通过外部解决方案交换后的帖子。

即使自发肿胀已成功地应用于生长不泡从 DOPC/eSM/系统, 在其他情况下, 没有收费可能会损害老爹肿胀, 由于导致缺乏排斥之间的个人双层44.延长 pre-swelling 期或引入笨重的脂质 headgroups 可能会解决此问题45。此外, 在不同于肿胀的溶液中, 其稀释后的囊泡稳定性可能因不同的脂质成分和稀释介质而不同, 这是我们没有研究过的。我们也没有探索的可能性, 调整的平均老大直径与准备方法在这里提出。但囊泡成分和溶胀液等参数可能影响结果。替代方法的应用46可能会产生更大的脂肪泡和在这里使用的解决方案, 但是, 它们可能会带来与该方法相关的其他缺点。在对称和非对称盐条件下产生 GUVs 的上述方法为进一步研究由不同的脂质组成和分散在不同的培养基中的囊泡提供了一个潜在的工具。由于我们没有探索这些可能性, 未来的试验将显示如何一般的老爹准备和稀释方法可以应用。

在不同温度下观察相分离

不同的实验设置适合研究 GUVs 在不同的温度下存在。虽然这些设置在文献中并不经常被详细描述, 但当前的工作呈现了一个适用于此类研究的基本组件。

> 控制测量表明, 该 in-house 设计和建造室的温度精确控制的恒温器和温度梯度内的会议厅是在实验温度的决议。确保实验热条件与恒温器读数一致。

在广泛的温度范围内对老大相状态进行评估时, 观察到的泡在温度变化后平衡很重要。一个可能的方法, 以确保这是检查滞后。如果存在滞后, 则应降低温度步骤并/或平衡时间增加。由于温度控制在这工作由一个水基恒温器建立, 工作温度的范围理想地被限制到 0-100 ° c。这个范围可以通过使用其他温度控制液体, 如油或通过其他设置,例如一个珀尔贴设备扩展。在实践中, 工作温度也受到可能的凝结或蒸发的限制。此外, 对于远离室温的温度, 整个观察室的稳态温度梯度的发生变得更有可能。此外, 成像设备可能会在极端温度下受到伤害。为典型的温度范围适当为脂囊研究 (~ 10-50 ° c7,9) 对观察设备的损坏应考虑, 但通常不预期。

囊泡领域观察工件

有许多来源的观察文物使用广域荧光显微镜。首先, 我们应该知道, 应用于囊泡相状态目视检查的对象的最大分辨率r决定了脂域的检测限度, 其依据是:
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其中, λ是发射波长, NA 是目标的数字光圈。一个典型的目标与40x 放大率和 NA 的 0.6, 检测绿色发射光约 560 nm 将达到0.6 µm 的光学分辨率. 因此, 比较不同的特定脂质混合物的囊泡相状态的研究对于相同的脂质混合物, 条件应使用相同的目标。

另一个工件是脂质领域的发生, 由于脂质光氧化的结果, 由于延长暴露于激发光41。光损伤优先于不饱和烃类脂基。事实上, 对于某些脂类成分, 在经过长时间的激发光照射 (~ 三十年代) 之后, 在这里观察到了最初均匀泡的区域形成。为了解决这个问题, 励磁灯被集中在一个视野, 仅几秒钟的时间状态评估。因此, DiIC18适用于我们的目的。然而, 其他染料, 可能会更敏感, 可能需要在较低的激发强度和更短的励磁光照射时间处理。

机械剪切应力从吸管转移的囊泡可能暂时混合领域, 从而扭曲明显的囊泡相行为。在某些批次中, 不同的囊泡在吸管转移到显微镜片后表现出不同的相行为0分钟和5分钟。在微流控装置中流体流动引起的剪切应力也被证明在域混合47。在观察之前, 囊泡应该被不受干扰地留出足够的时间平衡。在这项研究中, 被困在微流控装置上的囊泡在观察前的囊泡加载和溶液交换后未受干扰1小时。

为了避免一些 above-mentioned 的困难以及光衍射极限施加的限制, 诸如核磁共振光谱学48或超分辨率显微镜技术的替代方法49可以使用。

结论与展望

所介绍的工作演示了一套方法, 允许分析盐对称和非对称溶液条件对膜相分离的影响。所提出的方法都适用于其他应用。以微流控器件为例, 给出了在溶液不对称诱导下的区域形成和消失动力学的研究平台。此外, 领域的外观作为一个盐浓度的功能可以检查的方式。所有的方法也可以用来观察对相位行为的影响使用任何其他的解决方案的利益。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作是 MaxSynBio 财团的一部分, 由德国联邦教育和研究部和马克斯·普朗克协会联合出资。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium saltAvanti Polar Lipids840475Cabbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelinAvanti Polar Lipids860061abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %)Avanti Polar Lipids700000abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorateMolecular ProbesD-282abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %)Merck
NaCl (> 99.8 %)Roth
HCl (37 %)Roth
Tris (≥ 99.9 %)Roth
Sucrose (≥ 99.5 %)Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mLKimbleSoda flat bottom, white screw cap
pH meterMettler ToledoMP220
OsmometerGonotecOsmomat030
Epi-fluorescence microscopeZeissAxio Observer D1
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP5
Objective 40x, 0.6 NAZeissLD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NALeica506174
Objective 63x, 0.9 NALeica506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Gläaser
Parafilm "M"Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mLBraun
0.45 µm syringe filterGVS North AmericaCameo 25AS, 1213723Acetate, sterile

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