JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ניסויים שלב מופרדים unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) לעתים קרובות להזניח את התנאים פיזיולוגית. עבודה זו מציג גישות לחקר השפעת מליחות גבוהה מאגר על נוזל-נוזל שלב ההפרדה בין האנשים שנגדם ל טעונה כפונקציה של טרנס-הממברנה לפתרון האסימטריה ואת הטמפרטורה.

Abstract

שלפוחית מופרד שלב unilamellar ענק (כשמרוגזים) מפגין coexisting נוזלי-הורה, מגרה-נוזל תחומים הם כלי biophysical נפוצות כדי לחקור את ההשערה הרפסודה השומנים. מחקרים רבים, עם זאת, להזניח את ההשפעה של תנאי פיזיולוגית. על חשבון זה, העבודה הנוכחית מציג השפעת מליחות גבוהה מאגר, טרנס-הממברנה פתרון אסימטריה על נוזל-נוזל שלב ההפרדה כשמרוגזים טעונה גדל מ dioleylphosphatidylglycerol, ספינגומיילין ביצה וכולסטרול. ההשפעות נחקרו תחת תנאי טמפרטורה איזותרמי, בדרגות שונות.

אנו מתארים ציוד ואסטרטגיות ניסיוני ישימה עבור ניטור את היציבות של תחומים נוזלי coexisting באזור שלפוחית טעונה בתנאים סימטרי אסימטרי פתרון מליחות גבוהה. זה כולל גישה להכין. את האנשים שנגדם ל טעונה במאגר מליחות גבוהה בטמפרטורה גבוהה. הפרוטוקול מצריכה את האפשרות לבצע החלפה חלקית של הפתרון חיצוני על-ידי צעד דילול פשוטים תוך מזעור דילול שלפוחית. גישה חלופית מוצג ניצול התקן microfluidic המאפשר החלפת פתרון חיצוני מלא. ההשפעות פתרון על שלב ההפרדה נחקרו גם תחת טמפרטורות משתנות. למטרה זו, אנו מציגים את העיצוב הבסיסי ואת התועלת של חדר בקרת טמפרטורה שנבנה ללא צורך במיקור חוץ. יתר על כן, אנו משקפים את ההערכה של המדינה שלב בוס, החסרונות הקשורים עם זה, וכיצד לעקוף אותם.

Introduction

מאז הצפיה בגודל מיקרון תחומים באזור שלפוחית נוזל-נוזל מופרד שלב הענק unilamellar (כשמרוגזים) על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, האנשים שנגדם השתמשו כמערכת מודל לחקור את השומנים הרפסודה השערה1,2 , 3 . האזור של bilayer שעמד חופשי שלהם נמצא בטווח של אשר מתאי ביולוגי, הם מתאימים מחקה של ממברנות פלזמה שמציעות ייסחפו ממוצע. בוצעו מחקרים רבים על האנשים שנגדם כזה עם שלפוחית התפזרו במים טהורים, סוכרוז או פתרונות נמוך-מליחות4,5,6,7,8. תנאים אלה, לעומת זאת, אינן משקפות חשיפה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של biomembranes מליחות גבוהה סביבות ואסימטריה פתרון הטרנס-הממברנה כמו גם התנאים עבור תאים.

בעבודה זו, בפרסום הקודם שלנו קבוצה9המדינות שלב של האנשים שנגדם ל טעונה נבחנו כפונקציה של הנוכחות של אסימטריה מלח והפתרון על פני הקרום. האנשים שנגדם הוכנו של תערובות של יחסים שונים של dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), ביצה ספינגומיילין (eSM) כולסטרול (חול) פתרון סוכרוז (עם osmolarity של mOsm 210/kg) או מאגר מליחות גבוהה (100 מ מ NaCl, 10 מ מ. טריס, pH 7.5, 210 mOsm/kg). הבחירה השומנים היה מוצדק על ידי הנתונים כבר השיג בתרשים שלב של6,זו תערובת8.

מספר שיטות להכנת כשמרוגזים זמינים ב11,10,12 ספרות (שימו לב כי כאן, לא נשקול אלה מעורבים העברת שומנים מן מבוססת על שמן פאזה מימית 13 , 14 בשל הסכנה הטמונה של שאריות שמן הנותרים קרום העשויים להשפיע על ההתנהגות שלב). הכנת האנשים שנגדם במאגר מליחות גבוהה קשורה אתגרים ספציפיים. פתרונות של נמוך כוח יונית, שיטת electroformation15,16 מציג דרך מהירה להכנת כשמרוגזים של התשואות גבוהות עם פגמים קטנים10,17. השיטה מבוססת על הפקדת שכבה של שומנים על משטח מוליך (האלקטרודה), ייבוש להם לחות אותם עם תמיסה מימית תוך יישום שדה AC. עם זאת, שיטה זו דורשת התאמות אם מלח קיים תמיסה מימית18,19. ההנחה היא כי הכוח המניע לצמיחה שלפוחית על-ידי electroformation הוא electroosmosis16 אשר מתעכבת ב conductivities גבוהה20. מכאן, electroswelling של האנשים שנגדם בפתרונות מליחות גבוהה היא לא בגישה ישירה כפי שהוא דורש אופטימיזציה עבור ריכוזים שונים מלח נוכח הפתרון נפיחות. בסיוע ג'ל שלפוחית ונפיחות21,22 היא חלופה אפשרית electroformation עם פעמים היווצרות מהירה אפילו יותר. גישה זו מתבסס על הידרציה הסרט את השומנים משופרת כאשר ג'ל (agarose או אלכוהול (PVA)) משמש מצע. גישות אלה, לעומת זאת, מגיעים עם הסיכון של זיהום הממברנה במקרה מבוססי agarose נפיחות23 ו/או טמפרטורה מגבלות כמו במקרה של נפיחות מבוסס-PVA. באופן דומה, פרוטוקול לגדול כשמרוגזים על מצע של נייר תאית באחרונה הוקמה24. בעיות כלליות של שיטה זו הם חוסר שליטה על טוהר המצע, כמו גם את השימוש של כמויות גדולות של שומנים בדם. בעבודה זו, אנו מציגים, להציג את היתרונות של השיטה המסורתית ביותר להכנה בוס, כלומר ספונטנית נפיחות השיטה25,26. הוא מורכב ייבוש שכבה השומנים על מצע lipophobic, לחות זה האווירה אדי-מים, נפיחות לאחר מכן נפיחות בפתרון הרצוי (ראה איור 1 וכן פירוט בסעיף לפרוטוקול). שיטה זו אינו מציע שליטה על התפלגות גודל שלפוחית ותוצאות שלפוחית הכולל קטן לעומת שיטות איפה ההפקה נעזר שדה חשמלי, פולימר המצע או microfluidic אומר. עם זאת, שלפוחית איכות וגודל מתאימה עבור בדיקת מצב שלב קרום כמו בחנו כאן.

יצירת סימטריה בין הפתרונות על פני קרום שלפוחית מזוהה עם אתגרים מסוימים גם כן. אחד הגישה הנפוצה היא דילול ישירה של המתלה שלפוחית27,הפתרון הרצוי חיצוניים28. עם זאת, זה גם הקטנת הצפיפות הפצה שלפוחית. אסטרטגיה נוספת להחלפת לאט הפתרון חיצוני סביב האנשים שנגדם התיישבו בחלק התחתון של זרימה-תא המאפשר פתרון ב-, outflux. כדי למנוע הפרעה או אפילו מאבדים את שלפוחית עם הזרם, זרם נמוך תעריפי יישומית8, אשר מעניק גישה זו זמן-יעיל. יתר על כן, גם גישות אלה מבטיח פתרון חיצוני מלא exchange. פתרון ברור נועד לשתק שלפוחית על מנת למנוע איבוד אותם במהלך חילופי פתרון חיצוני. למשל, biotinylated האנשים שנגדם יכולה להיות קשורה אל29מצופים streptavidin פני השטח. עם זאת, גישה זו עשויה להוביל וריאציות ההלחנה ב מודבקת, ומכאן הקרום דבקה מגזרים30,31. היישום של מגנטי או שדות חשמליים ללכוד שלפוחית תוצאות הטלת קרום המתח32. העסקת מלקחיים אופטיים כדי ללכוד את שלפוחית דורש בעל ידית המצורפת (קרי חרוז), ואילו השימוש אלונקות אופטי עשויה להיות כרוכה חימום מקומי33. השמנה של האנשים שנגדם יכול להתבצע גם על ידי הגדלה אותם על חוטים פלטינום ללא ניתוק סופי34. זה אולם התשואות שלפוחית אשר אינן מבודדות, אשר בדרך כלל מחובר בחוטים או שלפוחית אחרים על ידי צינורות דקים השומנים (היתדות).

העבודה הציג מדגיש אסטרטגיות להתגבר על המגבלות הנ. תחילה נציג את תיאור מפורט של השיטה נפיחות ספונטנית הותאם והם ממוטבים עבור הייצור של האנשים שנגדם במאגרי מליחות גבוהה. לאחר מכן נסקור את שתי הגישות ביעילות ליצור פתרון אסימטרי תנאים על ידי דילול פשוטה או הניצול של מכשיר microfluidic. כי המטרה שלנו היא הניתוח של המדינה שלב ממברנה של האנשים שנגדם בתנאים פיתרון אחר, הסעיפים הבאים מתארים קריטריונים לניתוח סטטיסטי מוצלחת ורמזים הנוכחי עבור הימנעות בסיווג שווא.

הבדיקות בוצעו בתנאים איזותרמי, כמו גם תחת טמפרטורות משתנות. בזמן c טמפרטורהontrol בדרך כלל מועסק, פרטים על טמפרטורה ניסיוני-מיכשור וציוד מתוארים לעתים נדירות. . הנה, התקנה שנבנה ללא צורך במיקור חוץ להתבונן כשמרוגזים-בתנאי טמפרטורה שונים מוצג.

Protocol

1. נפיחות ספונטנית של כשמרוגזים

הערה: כלורופורם הוא חומר מזיק, אשר המרבץ. לבצע את כל הפעולות הקשורות כלורופורם ברדס fume. אל תשתמש מכשור מעבדתי פלסטיק כגון פיפטה טיפים או מיכלי פלסטיק עבור העברת ו/או אחסון של פתרונות כלורופורם. כלורופורם מתמוסס פלסטיק, אשר מזהם את הפתרון. השתמש מזרקים זכוכית, מיכלי זכוכית במקום. יתר על כן, עבודה נקי ככל האפשר כדי למנוע חדירת זיהומים כפי שהוא יכול לקיים אינטראקציה עם קרום. שים לב כי השומנים טיפוסי ריכוזים ב בוס ההכנות האחרונות הן בטווח micromolar, ובכך זיהומים בטווח ריכוז זה אולי יש השפעה חזקה על ההתנהגות ממברנה.

  1. מלבד הציוד הבסיסי, כוללים את הפריטים הבאים מוכן.
    1. הכן polytetrafluorethylene (PTFE, הידוע בכינויו טפלון) לוח עבור השומנים הפקדת בגודל ~1.5 ס"מ x 1.5 ס מ ועובי המתאים. ' חספוס ' לצלחת בצד אחד עם נייר זכוכית עדין.
      הערה: PTFE lipophobic, לא להיות שנרטבו מאת כלורופורם פתרונות אם חלקה. יכול להיות roughened בשני הצדדים של צלחת PTFE כדי למנוע בלבול על הצד הנכון עבור התצהיר השומנים. יש לבחור את עובי הצלחת טיפול קל, למשל כי זה לא גמיש מדי והוא יכול להתכסות בקלות לפי הפתרון הידרציה (ראה איור 1). כאן השתמשנו צלחות של ~ 2 מ מ עובי. ברגע roughened, הצלחת PTFE חוזר לניסויים חדשים לאחר ניקוי נאות (שלב 1.3).
    2. להכין בקבוקון זכוכית sealable של אמצעי האחסון המתאים (~ 15 מ"ל) השומנים הסופי הסרט הידרציה של שלפוחית הצמיחה.
    3. להכין את מיכל הזכוכית sealable אשר לתוכו המבחנה זכוכית ~ 15 מ ל מתאים; זה ישמש כדי ליצור אווירה רווי מים עבור השומנים הסרט נפיחות מראש, ראה איור 1.
  2. להכין 4 מ מ מניות השומנים היחס הרצוי של 1, 2 - dioleoyl - sn - glycero - 3 - פוספו-(1 ' - rac - גליצרול) (נתרן מלח) (DOPG), ביצה ספינגומיילין (eSM), וכולסטרול (חול), עם נוספים 0.1% מול 1, 1 ′ - dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט (DiIC 18) כדי ריכוז השומנים סך של 4 מ מ. להשתמש כלורופורם הממס. טבלת חומרים.
  3. ביסודיות לשטוף את הצלחת PTFE, את מיכל הזכוכית עם סבון כלים מסחריים, אתנול, כלורופורם ברצף הזה, סוף סוף לייבש אותם.
  4. באמצעות מזרק זכוכית, להפקיד ולהתפשט באופן שווה 10-15 µL של השומנים מניות על הצד roughened של צלחת PTFE כדי ליצור סרט השומנים אחיד. להשתמש מחט מזרק כדי להפיץ את הפתרון במידת הצורך.
  5. למקם את הצלחת PTFE על משטח נקי, וכשתתחילי זה יחד עם הסרט השומנים הופקדו על 2 h ב 60 ° C כדי להסיר את הכלורופורם. נוחות, להפקיד את הצלחת לתוך המיכל זכוכית unsealed והשלמת 15 mL במהלך לייבוש.
    הערה: הטמפרטורה הגבוהה מבטיחה כי הסרט השומנים הוא במצב נוזלי יחידה הומוגנית זה ואת כל השלבים הבאים-
  6. לאחר לייבוש, למלא את מיכל הזכוכית נפיחות מראש במים יונים עד לרמה שאינו מאפשר ציפה לשדוד המבחנה זכוכית ~ 15 מ"ל (~ 1 ס מ), ראה איור 1.
  7. לשים הכוס ~ 15 מ"ל בקבוקון עם לוחית PTFE לתוך המיכל ומכסים אותו כדי בכך אווירה רווי מים עשויות להתגלות, ראה איור 1B.
    הערה: מים מרוכז על הקירות המיכל הפנימי נותן סימן טוב עבור רוויה אדי מים מוצלח.
  8. לתת הסרט השומנים הופקדו מראש להתנפח בתוך המיכל זכוכית סגור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. בתוך פרק זמן זה להכין את הפתרון הרצוי נפיחות.
    הערה: על ההכנות שלפוחית אשר יכול להתבצע בטמפרטורה נמוכה, הפעם יכול מאוד יתקצר - עד כמה דקות - אם חנקן רווי מים חמים או ארגון משמש הנפיחות מראש במקום.
    1. להכין 200 מ"מ סוכרוז או 100 מ מ NaCl, 10 מ מ. טריס, pH 7.5 מותאם עם HCl ומחממים עד 60 ° צלזיוס כדי להפוך את הפתרון נפיחות.
  9. אחרי הנפיחות קדם, את הזכוכית ~ 15 מ"ל עם לוחית PTFE מתוך המכולה. עם מזרק מחובר מסנן מיקרומטר 0.45, להוסיף ~ 5 מ"ל של הפתרון נפיחות לתוך המבחנה זכוכית 15 מ"ל מימה הסרט השומנים.
    הערה: תיקון מחט את המסנן מקלה על ההוספה של הפתרון נפיחות. התחממות מראש את המזרק ואת המסנן יכול להיות רצוי לוודא מצב יחיד-נוזל שלב של הסרט השומנים תוך הוספת הפתרון נפיחות. סינון הפתרון ממזער (ב-) מציג אורגני של חיידקים או מלח precipitate וכו
  10. לאטום את המבחנה ~ 15 מ ל זכוכית מחזיק את הסרט השומנים רטוב על הצלחת PTFE כדי למזער את אידוי. אם יש צורך, להשתמש פרפין הסרט לשיפור אטימה. להשאיר הסרט רטוב השומנים ב 60 מעלות צלזיוס במשך הלילה עבור הבוס הסופי נפיחות.

2. קציר כשמרוגזים

הערה: הצבירה של האנשים שנגדם נפוחות, מנותק מן התוצאות המצע PTFE בגוש כמו ענן קטן (~ 1 מ"מ) גלוי לפי העין. הוא מופיע לבנבן כאשר אין צבע פלורסצנטיות משמש. אחרת, זה הוא בצבע על פי ספקטרום הבליעה fluorophore. התוספת של DiIC 18 מעבד הענן ורוד (ראה איור 2). השלפוחיות המוגלתיות מרוכזים במצטבר, קצירת זה ממקסם את התשואה שלפוחית.

~1/10
  1. מגניב למטה השלפוחיות המוגלתיות לטמפרטורת החדר בתוך ח' ~ 1 חתך של הקצה המחודד של בוכנה פיפטה פלסטיק טיפ באשכול או צבירה של שלפוחית לעבור כגדולים.
    הערה: קצב הקירור חשוב במיוחד אם נוזלי מוצק בשלב ההפרדה צפוי גם הוא משנה את הגודל של תחומים מוצק. כאן, להאט קירור, מיקמנו את הדגימה בקשר עם גוש מתכת בגודל 5 ס"מ x 9.5 ס"מ x 7.5 ס מ (H x א x ר) זה התקררה לטמפרטורת החדר בתוך ח' 1
  2. פיפטה למעלה באשכול יחד עם אמצעי אחסון המתאים של נפיחות פתרון (ראה איור 2). מחדש להשעות את הצבירה בפתרון נפיחות ליצור תנאים פתרון סימטרי, או כל הרצוי פתרון iso-osmotic ליצור תנאים פתרון אסימטרי.
    הערה: הגבול התחתון של אמצעי האחסון מוגבל לפי גודל הצבירה להיות שנקטפו לחלוטין. הפתרון חיצוני הוא מדולל, כדי להעריך את הריכוז המדויק, הנפח של הפתרון שלפוחית צריך להילקח בחשבון.

3. התבוננות האנשים שנגדם עבור שלב המדינה הערכה באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

הערה: האנשים שנגדם היית מסטול עם DiIC 18 כסמן פלורסנט. זה fluorophore מחיצות מעדיפים לשלב סמוקים נוזלי (Ld). דבר זה מאפשר התבוננות מיקרוסקופית קרינה פלואורסצנטית תחומים הנובע ההפרדה בין שלב האנשים שנגדם. אנו לבצע הערכה של מצבו שלב עם מיקרוסקופ epi-זריחה. בעקרון, תצפיות אלה ניתנים גם לביצוע באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM), המאפשר גם אות כמת (למשל כדי לקבוע unilamellarity ממברנה). עם זאת, CLSM דורש ציוד מתוחכם יותר, (בדרך כלל) epi-זריחה תצפיות לפני סריקה מועילות בכל מקרה.

  1. להחליט על מטרה (למשל 40 X הגדלה עם מפתח נומרי 0.6 (NA) כאן משומשים) לבחון את האנשים שנגדם ולהשתמש בו באופן עקבי בהשוואת מדינות שלב של הרכב אותו ב- solutio שוניםn תנאים. השתמש המסננים גל המתאימים עירור, פליטה כדי לאפשר תצפיות זריחה עם fluorophore בשימוש (למשל עירור 560 ± 40 ננומטר, 630 ± 75 ננומטר עם 585 ננומטר קרן מפצל בין המשמשים עבור DiIC 18)-
    הערה: גבולות המדינה שלב דיאגרמה שלב יהיה תלוי הרזולוציה המטרה משיג כפי שהוא מגדיר את גודל מינימלי של מיקרו-תחומים כדי להתגלות.
  2. לניתוח, לבחור רק האנשים שנגדם אשר למלא את הקריטריונים איכות הבאים.
    1. להבטיח unilamellarity של קרום בוס על ידי החזותיים התבוננות שלפוחית שונים ולהשוות את עוצמות; שלפוחית עם עוצמת פליטת קרינה פלואורסצנטית הנמוך הם קרוב לוודאי unilamellar.
      הערה: נפיחות ספונטנית תניב אצוות שלפוחית שבו חלק גדול שלפוחית ענקית אינם unilamellar.
    2. לבצע בדיקה נוספת על ידי לכימות את עוצמת פליטת קרינה פלואורסצנטית כביכול unilamellar שלפוחית ענקית וסמנו את האות המתאימה עבור פיזור בתוך האוכלוסייה. אם אין הבדלים מספר שלם בין האנשים שנגדם שונים הם נצפו, כולם נוטים להיות unilamellar.
      הערה: אם שלפוחית מוכנות של שומנים קונבנציונלי באמצעות שיטה ותיקה כגון נפיחות ספונטנית, הגישה המתואר לעיל לשם הגילוי של שלפוחית unilamellar מספיקה. אם יצירת פרוטוקול הכנה בוס חדש או משתמש שומנים לא שגרתיים, מחקרים מפורטים יותר יידרשו לאשר unilamellarity. למשל, סימני קרינה פלואורסצנטית קרום שלפוחית שכותרתה שהוכנו על ידי פרוטוקול חדש בהשוואה לאלה של האנשים שנגדם שהוכנו על ידי שיטה ותיקה; או קרום נקבובית חלבון α-המוליזין יכול להיות מוכנס לתוך שלפוחית ממברנות 24. צבע נוסף עד החלק החיצוני של השלפוחיות המוגלתיות ואז להזין את הפנים שלהם או לא, בהתאם לנוכחות uni - או שלפוחית multilamellar, בהתאמה.
    3. להבטיח הבוס בקוטר מינימלי סביר עבור תחומים עדיין להיות ניתן לזיהוי.
    4. להבטיח הבוס (כמעט) אין פגמים כגון חלקים בולטות או מודבקת או המבנים הפנימיים.
  3. העברה של aliquot של בוס השעיה לשקופית מיקרוסקופ, לאטום אותו כראוי. להכין חדר התצפית.
  4. להפקיד את הדגימה אל השקופית מיקרוסקופ. מקיפים אותו על ידי כרווח סיליקון עם פתח עגול במרכז. כדי למנוע זיהום, ודא מרווח לא בקשר עם הדוגמה. לאטום את הפנים על ידי הצבת תגית הכיסוי מעל מרווח סיליקון.
    הערה: במקום שהסיליקון מרווח אחד באפשרותך להשתמש גריז סיליקון או מפרידי תוצרת בית polydimethysiloxane (PDMS). איטום החדר מבטיחה אידוי מינימום המדגם ושומר על התנאים iso-osmolar.
  5. להשאיר את הדגימה ~ 5 דקות עבור equilibration מחדש של תחומים אפשריים.
    הערה: מתח מכני pipetting עשוי לערב בין התחומים הממברנה, אשר צריך זמן כדי הרפורמה.
  6. למקם את השקופית מיקרוסקופ עם הדגימה לבמה מיקרוסקופ, לנתח את מצב שלב של אצוות בוס בגישה סטטיסטי. להתבונן יותר מ-30 האנשים שנגדם לכל אצווה ולקבוע את המדינה שלב לפי הקריטריונים הבאים עבור בוס שלב הערכת מצב עם DiIC 18 ( איור 3).
    הערה: לאחר הצמיחה שלהם, שלפוחית עשויים להשתנות יצירות בודדות שלהם (למשל) תחום הנצה הנחה או חילופי חומרים ממברנה דרך צינוריות. האנשים שנגדם התערוכה לכן וריאציות ההלחנה בתוך באותה אצווה 35. שלב
    1. נוזלי יחיד להיות גם נוזלי-הורה (Lo) או מגרה-נוזל (Ld): ודא הצורה הכללית של בוס כדורית וחלק DiIC 18 homogeneously מופץ ממברנה (קודם תמונות לוחות העליון והתחתון < מחלקה חזקה = "xfig" > איור 3).
    2. לו שני שלבים + Ld דו קיום המדינה: להבטיח כי השלפוחיות המוגלתיות התערוכה מחשבים המופיעות מעגלית עם גבולות החלקה; על פי DiIC 18 חלוקה למחיצות של התנהגות תחומים הם אדום בהיר (Ld) או אדום כהה/שחור (Lo) (שני תמונות בהעליונה ו בתחתית לוחות איור 3, בצבע שווא). בדוק כי התחומים חופשיים מפוזר על פני שלפוחית יכול מזג.
    3. מוצק דו-שלבית (S) + נוזל (S + Lo או S + Ld) מצב דו קיום: להבטיח כי התחומים עשוי להופיע כמו אצבע או roundish אך עם גבולות זוויתי (השלישי תמונות פאנלים העליון והתחתון באיור 3). להתבונן תחומים נוזלי (אדום) על רקע אחיד (שחור) זה לא יציג דיפוזיה. להפך, תחומים אחיד (שחור) תהיה חופשית לפזר על רקע נוזלי (אדום).
    4. תלת-פאזי S + Lo + Ld דו-קיום: להתבונן שלושה סוגים של תחומים המופיעים: תחומים שחור זוויתי (i) (S), מוטבע דים (ii) (Lo) ו- (iii) בהיר (Ld) תחומים אדום.
  7. לייחס את אוכלוסיית האנשים שנגדם למצב שלב שבו נקבע להיות דומיננטי בקרב מדגם אקראי, כמו בדוגמאות הבאות:
    1. 20 אם כשמרוגזים נוזלי יחיד, 15 כשמרוגזים Lo + Ld שנצפו, שקול את האצווה כדי להיות שלב נוזלי יחיד.
    2. אם 10 S + אני בסדר, פרנקי, כשמרוגזים Lo + Ld 30, ו- 25 כשמרוגזים יחיד-נוזל שנצפו, שקול אצווה להיות Lo + Ld.

4. בוס התבוננות במכשיר Microfluidic

הערה: קודם לפברק את המכשיר microfluidic; פרטיה microfluidic ההתקנים ועיצוב ההרכבה ניתנו במקום 36 , 37; לקבלת תיאור קצר, ראה איור 4.

  1. להכין טרי בוס נפיחות פתרון (מלח או סוכרוז לפי שלב 1.8.1) ולסנן אותו דרך מסנן מיקרומטר 0.45.
    הערה: כל הטומאות בפתרונות זורם עלול לסתום את ההתקן microfluidic.
  2. 200 לחתוך µL בוכנה פיפטה טיפים פלסטיק ולמקם אותם לתוך החורים בחלק PDMS של המכשיר. להוסיף 100 µL ו µL 5 של טרי, מסוננים נפיחות פתרון למאגר המים (ראה איור 5A) ואת כל גזירה פיפטה טיפים, בהתאמה. Centrifuge את כל המתקן ב 900 x g 10 דקות ומפרידה הרוטור הנדנדה מראש למלא את המכשיר, להוציא אוויר.
  3. מראש למלא את המזרק זכוכית 1 מ"ל, המחוברים לצנרת עם הפתרון נפיחות, העבר את המיקום הבוכנה מ 0 ל.
  4. למקם את הצנרור לשקע fluidic של ההתקן ומקם את המזרק לתוך למשאבה מזרק.
    הערה: הבחירה של מזרק, מזרק משאבה מותג הוא לא חשוב. עם זאת, זכוכית מזרקים מדויקות יותר, המשאבה צריכה להיות מסוגל לפעול בטווח זרימת µL/min.
  5. התחבר שכבה יחידה בקרת לחץ מותאם אישית אינלטס 8 של הפקד microfluidic (ראה איור 5A). להגדיר את הלחץ ליחידת בקרת לחץ 3 בר (אוויר, חנקן או ארגון), אך מוגדר להתקן microfluidic למיקום סגורים המסתמים.
  6. למקם את המכשיר microfluidic, עכשיו קשור את מזרק משאבה ובלחץ יחידת בקרה, על במה מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
    1. שימוש המטרה עם אותם הגדלה ו- NA כמו במהלך התצפיות בצובר. לשלוט אם הנתונים הסטטיסטיים המדינה שלב כמוסבר בשלב 3.7 נותר ללא שינוי אם עוד מטרה משמש כדי להימנע חפצים תצפית אשר מבוססים על רזולוציות שונות.
  7. לטעון את האנשים שנגדם לתוך המכשיר.
    1. הראשון, פיפטה משם הכל חוץ µL 25 עד 50 של הפתרון שנותר בתוך המאגר. להוסיף 150 µL של הפתרון בוס (סוכרוז או מלח לפי שלב 1.8.1, אבל תואם פתרון נהגו למלא את המכשיר בשלב 4.1 מראש) המאגר, מיקס על ידי עדין pipetting. הגדר המזרק כדי 10 קצב הזרימה µL/min ב לסגת מצב עבור-20 דקות או עד יותר מ-90% של ההשמנות תפוסים.
      הערה: המאגר אסור להתייבש. אם זה קורה, בועות אוויר יזין המיקרו-הערוצים. להוסיף עוד בוס פתרון reservoir במהלך טעינת אבל להקפיד כדי לא להציג את בועות האוויר כאשר pipetting לתוך המכשיר.
  8. לפתוח את כל השסתומים יחידת בקרת לחץ כדי לסגור את microfluidic הטבעת-השסתומים סביב המלכודות/האנשים שנגדם. הגדר את משאבת מזרק µL 0/min. לאחר 1 h, לבחון את האנשים שנגדם ותמונות קונאפוקלית הרשומה. לרגש, לזהות את האנשים שנגדם לפי fluorophore בשימוש (למשל עירור 561 ננומטר, זיהוי בין 580-620 nm באשר DiIC 18). השתמש בקריטריוני בחירה זהים מהשלב 3.6 , ודואגים לציין את המיקום של כל בוס (קרי העמודה והשורה מספר, ראה איור 4)
  9. מחליפים את הפתרון המקיפים את בסדר? .
    1. להגדיר את משאבת מזרק µL 0/min, פיפטה µL משם כל אבל 25 עד 50 של הפתרון בוס מן המאגר. להוסיף 150 µL של הפתרון השני (בסוכרוז או מלח לפי שלב 1.8.1, בהתאם הפתרון הרצוי החוצה האנשים שנגדם) המאגר ואת תערובת על-ידי pipetting עדין. פיפטה µL משם כל אבל 25 עד 50 של הפתרון מאגר מן המאגר.
      הערה: פתרון זה חייב להיות מסונן באמצעות מסנן מיקרומטר 0.45 מדי.
  10. לחזור על הצעד הקודם לפחות 5 פעמים ביסודיות להחליף את הפתרון בתוך המאגר. הגדר את המזרק 10 קצב הזרימה µL/min ב לסגת מצב ~ 10 דקות להחליף את הפתרון ב המיקרו-הערוצים.
  11. את קצב הזרימה כדי µL לדקה 1 פתח את 8 שסתומים שליטה בלחץ יחידה עבור 2 s ולסגור שוב (וכתוצאה פתיחה וסגירה של השסתומים טבעת microfluidic). הגדר את קצב הזרימה µL 0/min שוב.
  12. לאחר 1 h, לבחון את האנשים שנגדם ותמונות קונאפוקלית הרשומה. שוב, לטפל הערה של עמודה ושורה של המיקרו-התא שבו כל בוס ממוקם כדי לאפשר השוואות של הבוס אותו לפני ואחרי החלפת מאגר חיצוני.

5. עיצוב וכיול של תא בקרת טמפרטורה

הערה: תא מתאים עבור בקרת טמפרטורה יכול להיות שהושג מסחרית או מתוצרת בית. בקרת טמפרטורה מושגת בדרך כלל על ידי צימוד תרמיים של התא עם הדגימה בוס באמבט מים או רכיב Peltier. כאן, אנו מתארים את עיצוב ואפיון של חדר בקרת טמפרטורה בבית שנבנה ההפעלה עם התרמוסטט מים חיצוני. טרמוסטטים כאלה זמינים במעבדות רבות או אפשר להציל מן הציוד הישן כמו לייזרים או ספקטרומטרים.

  1. להרכיב חדר זרימת חום, כאן, עשוי בלוק אלומיניום, עם מחברים כדי באמבט מים כפי שמוצג באיור 6. לסגור את הפתחים בחלק העליון והתחתון ולאפשר תצפיות שדה בהיר של המדגם על ידי הדבקה כיסוי משקפיים כדי לחסום את.
  2. הפוך תא זרימה בצד יוצב ואיפה pipette droplet של µL כ-100 של הפתרון נעשה שימוש בניסויים על פי שלב 1.8.1 המדגם. באופן אופציונלי, להוסיף בדיקה טמפרטורה סיב אופטי סיבים (למשל FISO FTI-10) או להוסיף צבע הרגיש בריכוז המתאים, למשל 500 מיקרומטר B. Rhodamine
  3. להרכיב תא תצפית בוס באמצעות סיליקון גריז שהופקדו טבעת צורה או קצת מרווח (PTFE או גומי), לאטום אותו עם זכוכית מכסה 0.17 מיקרומטר. להבטיח כי הירידה אינה קשר עם הסוכן איטום או את מרווח כדי למנוע חדירת זיהומים.
    4. לאט לאט,
  4. הפוך את מכלול וחבר את התרמוסטט מים חיצוני עם אבובים המתאים לזה. תשומת לב מיוחדת כדי הדלפות מים.
  5. סט הנמוך ביותר הטמפרטורה על התרמוסטט מים חיצוני הרצויה ולתת את מערכת equilibrate עד הקריאה את חיישן טמפרטורה יציבה; והספיגה equilibration ייתן הערכה של זמן התגובה מינימלי של המערכת.
  6. לבצע בקרת ניסויים לפחות פעם אחת לפני תחילת השימוש התא.
    1. למדוד את הטמפרטורה הפתרון (למשל עם מכשיר בדיקה סיב זכוכית) ולהשוות אותם, לקריאה של התרמוסטט מעל טווח הטמפרטורות שבו עניין.
    2. הסימון ' הסטה ' מינימלי מן הקריאה טרמוסטט ליניאריות של הטמפרטורות נמדד.
    3. בדוק הדרגתי טמפרטורת בתוך החדר התבוננות באמצעות צבע רגיש לטמפרטורה. למדוד את הטמפרטורה הפתרון באמצעות קרינה פלואורסצנטית בעוצמה או קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ (FLIM) למרחקים שונים מן התחתון מכסה 40. בנוסף בדוק אם יש שינוי טמפרטורה בכל האזור של התבוננות בוס, כפי שמוצג באיור 7.

6. בוס תצפיות בטמפרטורות שונות

הערה: בדרך כלל, עבור האנשים שנגדם ממברנות של מי שעשוי להיות פאזה נפרדת, המופיעים להיות הומוגני-תצפית טמפרטורה T obs, שלב ההפרדה תהיה המושרה מתחת T obs (אם כי הוא ציין תלוי טווח הטמפרטורות שבו נחקר). ולהיפך, שלב מופרדים שלפוחית צריך להיות הומוגני בטמפרטורה גבוהה יותר T obs. אולם, זה לא צריך להיות המקרה עבור הרכב השומנים (מרוכבת) מסוים, זה יכול להיות מעניין תמיד לסרוק את טווח טמפרטורה נגיש כל 38. הפרוטוקול עבור תצפית והערכה של שלב המעבר טמפרטורות לא מתבססת על שיטת ספציפי המשמשת לצורך בקרת טמפרטורה.

  1. להרכיב תא תצפית הטמפרטורה לפי סעיף 5, תוך השמטת החללית טמפרטורה סיב אופטי סיבים או את fluorophore הרגיש.
  2. הגדר לאמבט מים חיצוני לטמפרטורת החדר (23 ° C) ולתת את מערכת equilibrate במשך 10-15 דקות
  3. לספור את מספר שלפוחית שלב מופרדים באמצעות הקריטריונים מהשלב 3.6; השלב הכולל מצב של האוכלוסייה בוס ייתן רמז על האזור של טמפרטורת המעבר של המערכת. אם המדינה שלב מעבר האוכלוסייה שלפוחית היא הטרוגנית מעדיף לעבור ישירות לשלב 6.5.
  4. להגדיל (אם הרוב המכריע של שלפוחית הם מופרדים שלב) או להקטין (אם הרוב המכריע של שלפוחית הומוגנית) הטמפרטורה במרווחים גס (למשל 1-2 ° C) ולתת המערכת equilibrate כ 2 דק. להעריך מחדש את מצב שלב האוכלוסייה בוס על ידי אמצעי אקראי לטעום ולא להשתנות הטמפרטורה עד האוכלוסייה שלפוחית מראה מדינה שלב הטרוגנית.
  5. , ברגע האוכלוסייה ליד נקודת של מעבר פאזה (כלומר השלב קובע בין האנשים שנגדם בודדים הם מעדיפים הטרוגנית), להקטין את מרווח טמפרטורה (למשל 0.5 ° C) כדי להגדיל את הרזולוציה. . תן למערכת equilibrate ~ 2 דקות ולהעריך מחדש המדינה שלב של האוכלוסייה בוס באמצעות מדגם אקראי.
  6. לאחר הנקודה של מעבר פאזה מועברת, לשמור משתנה הטמפרטורה עד כל האנשים שנגדם עכשיו הומוגני או מופרדת שלב, בהתאמה.
  7. לבדוק היסטרזיס להעריך אם הזמנים equilibration מספיקים. סריקה
    1. שינוי הכיוון של הטמפרטורה, אני.אי אם הסריקה שבוצע עבור טמפרטורה עולה, לעשות את הסריקה באמצעות הפחתת הטמפרטורה.
    2. בחר לפחות קבוצת משנה של טמפרטורות כדי להעריך את היחס המדינה שלב האוכלוסייה (למשל 80% מופרד שלב) בוס.
    3. אם סטיות משמעותי בין בשני הכיוונים יחס המדינה שלב מציינות היסטרזיס, להקטין את גודל הצעד טמפרטורה ו/או להאריך את זמן equilibration בשלבים 6.4 ו- 6.5-
    4. אם אין היסטרזיס שצוין על-ידי יחס שווה, שקול להגדיל את הזמן שלב גודל ו/או equilibration.
  8. להתוות את יחס המדינה שלב נגד הטמפרטורה. על כימות, להתאים את הנתונים הדגם המתאים ( איור 8).
    הערה: שלב המעבר עקומות בדרך כלל כוללים מסלול sigmoidal, המודל sigmoidal בולצמן מספק ערכה המתאימה של התאמת הפרמטרים:
    figure-protocol-19413
    y: שבר של האנשים שנגדם מדים/שלב-מופרדים
    1: הערך הראשוני שבר
    2: הערך האחרון שבר
    T: טמפרטורה
    T לערבב: טמפרטורה חצי-מרבי y
    כמו y הוא השבר של האנשים שנגדם הומוגנית, א 1 ו- A 2 להיות קבועה 0 ו 1, בהתאמה. כמו miscibility המעבר ההנחה תהיה sigmoidal, ברגע הערך שבר נמדד 0 בטמפרטורה מסוימת שנחשבים כל הערכים שבר של טווח טמפרטורה מתחת ל- 0. ולהיפך, לאחר ערך השבר 1 בטמפרטורה מסוימת, כל הערכים שבר של טווח טמפרטורה לעיל הן ההנחה תהיה 1.

תוצאות

בוס נפיחות

עם הגישה נפיחות ספונטנית המתוארים כאן, האנשים שנגדם המורכב DOPG, eSM, חול גדלו ללון ב- 210 מ מ סוכרוז או 100 מ מ NaCl, 10 מ מ. טריס, pH 7.5 ויוצרים של צבירה גלוי. קציר את הצבירה מבטיחה תשואות גבוהות שלפוחית. Resuspension בפתרון נפיחות כתוצאה בתנאים פתרון טרנס סימטרי-הממברנה. כדי ליצור תנאים אסימטרי, הנוסעים היה resuspended iso-osmolar סוכרוז או פתרון מליחות גבוהה, בהתאמה (איור 2). דילול וכתוצאה מכך מקביל החלפת פתרון חיצוני ומעין תוך מזעור הדילול של מספר האנשים שנגדם.

שלב המיפוי דיאגרמה של האנשים שנגדם באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

הנוכחות של 0.1% מול DiIC ספציפיות שלב18 ב האנשים שנגדם איפשרה ההתבוננות שלהם הברית שלב באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב זריחה. שלפוחית מפגין S + L בשלב ההפרדה נצפו דרך סימן x 63 / 1.2NA כדי שאוכל לפתור דק מובנה תחומים כמו אצבע. עבור כל הנותר המקרים, 40 x / 0.6 נה המטרה היה בשימוש. כדי להימנע חפצים במהלך הבדיקה החזותית של האנשים שנגדם וכדי למקסם הפארמצבטית, קריטריונים מסוימים נקבעו זה נקבע איזו שלפוחית לשקול ניתוח מצב שלב (פרוטוקול שלב 3.6).

האנשים שנגדם המוכן ternary DOPG/eSM/חול תערובות של מגוון רחב של יחסי נפוחות סוכרוז או פתרון מליחות גבוהה והנצפית בטמפרטורת החדר הציג ההפרדה שלב הומוגנית של Lo או Ld שלבים Lo + Ld, הדבק + הורד, ראה איור 3. איור 9 מציגה שלפוחית exemplarily פגומה, אשר צריכים להיכלל לא ניתוח הנתונים וכמו כן מציג כיצד לזהות שלפוחית multilamellar.

בשל ההיסטוריה שלהם לא ידוע, האנשים שנגדם צפויים להפגין בתוך-אצווה וריאציה ההלחנה35. לפיכך, המדינה שלב הכללית של הרכב מסוים נקבע בגישה סטטיסטי. בוס אוכלוסיות של הרכב השומנים מסוימים היו ייחסה למצב שלב שבו נצפתה להיות דומיננטי מדגם אקראי (פרוטוקול שלב 3.6). ובכל זאת, יצירות קרוב לאזור דו-קיום Lo + Ld הניב לעיתים קרובות אצוות איפה המדינה השלטת שלב מורכב לרוב צר. במקרים כאלו מעורפל, בדיקה ויזואלית חזר ונשנה עם פחות שלוש דוגמאות עצמאית. השבר של שלפוחית עם המדינה שלב זהה (למשל תערוכת Lo + Ld שלב ההפרדה) מתנה בתוך הדגימות אקראי היה בממוצע מספר הנסיונות אשר נלקח בתור התוצאה הסופית (איור 10).

הפרוטוקולים שתואר הביא מספיק צמיחה בוס במגוון רחב של יחסים שונים של DOPG, eSM חול בפתרונות מליחות גבוהה וסוכרוז. ניתן למפות אזורים נרחבים בתוך התרשים שלב ternary בתנאים פתרון מליחות גבוהה סימטרי, כמו גם אסימטרי (איור 11). ההבדלים בהתנהגות שלב שלפוחית נצפתה בתנאים פיתרון אחר נדונו במקומות אחרים פרט9.

תצפיות על התנהגות שלב לאחר מלאה מאגר exchange באמצעות שיטת microfluidic

היצירה של תנאים אסימטרי פתרון על ידי דילול תוצאות שאריות של הפתרון נפיחות בחוץ. הגישה microfluidic שלנו מאפשר החלפת פתרון חיצוני מלא. איור 5A מראה המכשיר microfluidic מורכבים באופן מלא על הבמה מיקרוסקופ קונפוקלי יחד עם שקע fluidic, הלחץ הבקרה אינלטס. צינורות מחוברים דרך צינורות מתכת 90 ° כדי לאפשר מרחב עבור ששודרו הדמיה אור מלמעלה.

התבוננות בתוך המכשיר microfluidic, מיקרוסקופ קונפוקלי עם 63 x / 1.2NA מים טבילה המטרה עדשה יושם. כמו עם תצפיות הקודם בצובר, DiIC18 שימש כדי להכתים את הקרום. בעת ביצוע תצפיות של שלב מדינת האנשים שנגדם לכוד בתוך המכשיר, חייבים להקפיד לא לפרש את הנתונים. בשל קרבתה של האנשים שנגדם הודעות, עירור ונתיבי אור פליטה עשויים חלקית להיחסם על ידי PDMS שמוביל ההופעה של תחומים (איור 12). כאן גילוי האור המשודר זה שימושי כדי לבדוק את המיקום של בסדר?-ההודעות. אפקט לא רצוי זה בולט במיוחד עבור האנשים שנגדם קטן של פחות מ- 10 מיקרומטר בקוטר. במקרים אלה, הנתונים נדחו. התמונה קונאפוקלית באיור 13A מציגה מקטע שלפוחית מישורי שחוצה את תחום Lo הנוכחי על שלפוחית בוס. במקרה זה, חתך מישורי סריקות נוספות מעל או מתחת למקטע היה לא מראה של התחום בגלל גודלו הקטן יחסית של הבוס, וזה למה זה היה היה מחמיץ את שלפוחית נחשבת במצב שלב הומוגנית. לפיכך, z-ערימה קונאפוקלית אמור לשמש כדי לבדוק את השטח כולו בוס. עבור מיקרוסקופיית שדה רחב, לא ייתכן בעיה כי בועית שלמה יכול לדימות בבת אחת.

לבסוף, דוגמאות ניתנות של האנשים שנגדם לפני ואחרי חילופי הפתרון החיצוני בו ברור מה השלב מדינות של הממברנות הן (איור 14). לכל התקן יש 60 צ'יימברס (כל אחד עם זוג הודעות מלכודת של בוס יחיד), המאפשר עשרות ניסויים לפי התקן (ראה איור 4). עם זאת, כמה האנשים שנגדם אולי תלך לאיבוד במהלך ההחלפה פתרון חיצוני. זה ניתן למזער על ידי הפעולות הבאות: 1) באמצעות ציפוי אלבומין שור (BSA) כדי למנוע בוס אדהזיה/קרע ב ההודעות; ציפוי נעשית על ידי חשיפת הקירות קאמרית כדי 20 מ"ג/מ"ל של BSA עבור 60 דקות ושטיפה הבאים עם מאגר עובדים. מולקולה דבק אחר שיכול לשמש הוא poly(L-lysine)-שתל-poly(ethylene glycol)39. 2) התאמת osmotic זהיר של פתרונות הפנימיים והחיצוניים להימנע כשמרוגזים רפוי, אשר יכול להעביר דרך מרכז ההודעות או התפוצצותה של בסדר, פרנקי. 3) ייעול ההליך הכנה בוס להשיג שלפוחית גדול יותר ~ 8 מיקרומטר בקוטר כדי למנוע מעבר דרך מרכז ההודעות.

עיצוב ואפיון של טמפרטורה מבוקרת קאמרית להשגחה של בוס שלב הברית

תיכננו חדר זרימה פשוטים, אשר כולל חיבורים לתרמוסטט מים חיצוני (איור 6). השגנו. תא על-ידי כרסום בלוק אלומיניום באופן כללי, החומר קאמרית לא צריך להיות חום מוליך, כמו לדוגמה זה משולב לאמבטיה מים על ידי הזכוכית המכסה התחתון, כפי שמוצג איור 6B ו- 6 C.

ללא תלות העיצוב המדויק, צריך להעריך את הביצועים של התא. במיוחד בדקנו עבור ליניאריות של הטמפרטורה מדגם עם הטמפרטורה מבחוץ-set, כל קיזוז טמפרטורה שיטתי הדרגתי טמפרטורת בתוך החדר. תחילה שתי נקודות שהופנו על ידי מדידה ישירה הטמפרטורה בתוך החדר על ידי בדיקה טמפרטורה סיב אופטי סיבים (למשל FISO FTI-10). אנחנו גם בדיקה של מעבר צבע הטמפרטורה בתוך המתלה בוס. מעבר צבע כזה יכול לנבוע זרימת חום אל מחוץ לתא. מדידות הטמפרטורה במרחב נפתרה וניתן להשיגו באמצעות fluorophore רגיש לטמפרטורה40, ראה איור 7.

נתונים וארגון הולם להשגת Tלערבב של הפרדת שלב כשמרוגזים

התוויית השבר של האנשים שנגדם הומוגנית מעל טווח הטמפרטורות שנמדדו שבו הביאה מסלול נקודת נתונים בצורת sigmoidally. אנחנו מתאימים את הנתונים למודל בולצמן (פרוטוקול סעיף 6.8) שממנו Tלערבב יכול להיות להסיק (איור 8).

figure-results-7120
איור 1: שלבים ניסיוני במהלך פרוטוקול נפיחות ספונטנית (החלונית העליונה) עם השלב המתאים של גידול שלפוחית (החלונית התחתונה). הסרט השומנים הומוגנית (א) A להפיץ לצלחת PTFE roughened וכי מיובש של כל הממס. הסרט (ב') השומנים יבשים ואז מראש באווירה רווי מים בתוך מיכל סגור עם מים כדי להקל על הידרציה bilayer שלי נפוחה המבחנה void זכוכית מכיל את הצלחת PTFE, נשאר פתוח במהלך שלב זה הידרציה. (ג) השומנים מראש נפוחות הסרט סוף סוף באופן מלא הופך להתייבש על ידי התוספת של הפתרון הרצוי נפיחות לצלחת PTFE מצופים השומנים בתוך המכל זכוכית. כדי למנוע אידוי, המבחנה זכוכית חתומה כראוי במהלך הלילה. כדי למזער וריאציות ההלחנה בתוך אצווה, כל הצעדים שיש לבצע בטמפרטורה איפה התערובת השומנים מלא miscible. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8159
איור 2: בוס קציר. (א) A שהופקדו השומנים הסרט המורכב DOPG/eSM/חול-יחסי טוחנת של 20/60/20 עם 0.1% מול DiIC18 היה נפוח במאגר מליחות גבוהה המורכב 100 מ מ NaCl, 10 מ מ. טריס, pH 7.5. המכסה של מיכל הזכוכית נאטם בנוסף עם סרט פרפין. האזור המוגדל עניין מכיל צבירה בוס שהתקבל. מראהו האדום הוא תוצאה של המצאות DiIC18. (B) האנשים שנגדם נבצרו עם טיפ פיפטה קטום. בתמונה זו, הנוסעים היה pipetted למעלה יחד עם 50 µL של נפיחות פתרון, אשר הועברו לתוך בקבוקון טריים. (ג) כדי ליצור טרנס אסימטרי-הממברנה פתרון תנאים, הנוסעים היה מעורבבת עם פתרון חיצוני מול אחר. הנה, את הצבירה יחד עם 50 µL נפיחות הפתרון היה resuspended 950 תמיסת סוכרוז µL, וכתוצאה מכך לדילול 20 x הפתרון נפיחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9202
איור 3: בוס הדמיה- שדה רחב פלורסצנטיות תמונות של האנשים שנגדם מסטול עם 0.1 מול % DiIC18 מוכן ו שנצפתה מלח סימטרי או פתרונות סוכרוז המורכב יחסים שונים של DOPG, eSM חול (במאגר מלח, משמאל לימין: 40/20/40; 30/50/20; 30/60/10; ב סוכרוז, משמאל לימין: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). התמונות מתארים האנשים שנגדם במצבים שונים (coexisting) שלב מוערך על פי הקריטריונים בשלב פרוטוקול 3.6. . הנה, שלפוחית היו עם תמונה דרך 40 X / 0.6 נה אובייקטיבי. גודל ברים = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9983
איור 4: פריסה של עיצוב הערוץ microfluidic. האנשים שנגדם נכנסים השכבה התחתונה fluidic (ערוצים מחולקת לרמות) דרך הים מתחת מאגר. מסנן חוסם פסולת לא רצויים מההתקן. הם מכן הזן מערך של 60 צ'יימברס (8 שורות ועמודות 15) כל ההודעות המכילות ללכידה בוס יחיד (ראה הוספת). כל חדר יכול להיות מבודד בתוך טבעת שסתום actuated על ידי שכבה שליטה (ערוצים שחור מלא) מעל שכבת fluidic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-10655
איור 5: התקן Microfluidic. (א) תצלום של מכשיר microfluidic נהגו ללכוד כשמרוגזים יחיד להחליף באופן מלא את הפתרון החיצוני. תוויות מצביעים על המאגר כדי להוסיף פתרונות (1), 8 x לחץ אינלטס מחובר הלחץ שליטה יחידה (2), שקע fluidic מחובר מזרק, משאבה (3). החלונית ' (B) מציגה יחידת בקרת לחץ ובו 8 שסתומים אחד ויסות צינור 1 מחובר ההתקן microfluidic. כאן שסתומים #1 ו #2 הינם פתוחים, ומכאן סגורים המסתמים הטבעת המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-11407
איור 6: הקאמרית בקרת טמפרטורה. (א) תאלפני ההרכבה. (B) התכנסו קאמרית (כלפי מעלה) עם 2 מ"מ חיפוי משקפיים דבוק העליון והתחתון. מרווח גומי כתום מודד 0.5 מ מ גובה, אטומה עם מכסה 0.17 מ מ להשגחה של בוס התליה המצורף. בתמונה זו מוכנס מכשיר בדיקה טמפרטורה למטרות כיול (חום סיבים יציאה התא בצד הימין). (ג) שסודרו על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ללא המכשיר טמפרטורה. מרווח גומי כתום עכשיו פונה כלפי מטה. הגומי הוא דבק מספיק כדי להחזיק את הדגימה במקום. שימו לב כי האור יכולים להיות מועברים באמצעות המדגם הפעלת epi-זריחה ותצפיות שטח בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-12288
איור 7: נתוני טמפרטורה במרחב נפתרה בתוך החדר תצפית מתקבל על ידי מדידות FLIM של צבע רגיש לטמפרטורה (כאן: 500 מיקרומטר Rhodamine B) 40. נקודות נתונים שהתקבלו ב- 0, 10, 30, 300 ו- 400 מיקרומטר מעל בתגית כיסוי תחתון. נקודות הנתונים אדום וכחול נמדדו על טמפרטורת של האמבט במים שוכן בגובה של 30 מעלות צלזיוס ו 12 ° C, בהתאמה. נקודות שחורות הנתונים מצביעים על השמאל אמבט מים כדי equilibrate לטמפרטורת החדר. וריאציות קטנים בטמפרטורה ברחבי החדר היו נצפתה אך נשאר מתחת ל 0.5 ° C (סרגלים אפורים). גובה תא הכולל הוא כ-500 מיקרומטר לפי העובי מרווח (ראה לעיל). קווי השגיאה מצביעות על סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-13203
איור 8: איתור הטמפרטורה miscibility. הגרף מראה את נקודות הנתונים הנפרדות של הומוגניות (מצב יחיד נוזלי) השבר של האנשים שנגדם המוכן DOPG/eSM/חול על יחס 30/40/30 מסטול מול 0.1% DiIC18 מתוך שלושה מדגמים רנדומליים עצמאית (N = 20-40). קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של אמצעים. נקודות נתונים היו מצוידים למודל של בולצמן שמתואר בשלב 6.8 (רציף קו שחור) אשר ממנו תחום ערבוב טמפרטורה Tלערבב תרבויות (בצע אדום רציף קו abscissa) בהתאם חצי לכל היותר sigmoidal עיקול על כפוף (קו שחור מקווקו). ערכים התחלתי וסופי (1 ו-2) היו קבועים 0 ו 1, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-14096
איור 9: שלפוחית פגומה. דוגמאות של שלפוחית ענק המוכן 20/60/20 DOPG/eSM/חול, מסטול 0.1% מול אם DiIC18 שאינם עונים על הקריטריונים שהגדרת בשלב 4.2 עם תמונה על ידי מיקרוסקופ שדה רחב זריחה. עוצמת טווחים תצוגה של תמונות בודדות היו אופטימיזציה עבור עוצמת קרינה פלואורסצנטית שלפוחית מתוארים בכל פעם. בשל נוכחותם של חומר נוסף ממברנה ושלפוחיות קטנים שעברו אנקפסולציה, מדינת שלב שלפוחית (א) לא כל כך ברור המראה של שלפוחית ענקית זו אינה מאפשרת כל בדיקה ויזואלית אמינה עבור lamellarity. לוח (B) מתאר של שלפוחית אשר הפנים הוא צפוף עם חומר ממברנה. כתוצאה מכך, האות זריחה של קרום שלפוחית החיצוני יונחו עם אותות פנימיים שלה, עיבוד ויזואליזציה של lamellarity ותחומים פוטנציאל אפשרי. (ג) עוצמות קרינה פלואורסצנטית שלושה שלפוחית ענקית שונים מוצגים השוואה ישירה בטווח בעוצמה זהה התצוגה. תמונה זו מראה כי ניתן לזהות שלפוחית multilamellar ענק (1, 2) באמצעות האות שלהם פלורסצנטיות מוגבר לעומת הבוס (3). כאן, multilamellar, כמו גם unilamellar שלפוחית ענקית בנספח Lo + Ld שלב ההפרדה. שלפוחית בכל התמונות היו עם תמונה דרך 40 x / 0.6 נה אובייקטיבי. גודל ברים = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-15513
איור 10: שבר של Lo + Ld שלב מופרדים כשמרוגזים בממוצע לפחות שלוש דוגמאות עצמאי. שלפוחית חוברו של 30/40/30 DOPG/eSM/חול בסמוך לגבול האזור דו-קיום Lo + תעודת זהות. קווי השגיאה של סוכרוז סימטרי תנאים ממחישים את פיזור אצווה-כדי-אצווה. התווית של כפוף מתאר פתרונות פנימה/החוצה השלפוחיות המוגלתיות; סוכרוז: סוכרוז 210 מ מ; מלח: 100 מ מ NaCl, 10 מ מ טריס, pH 7.5; קווי שגיאה מצביעים על סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-16215
איור 11: שלב דיאגרמה של האנשים שנגדם המוכן DOPG, eSM, ואת המועד ממופה בתנאים שונים פתרון באמצעות 210 מ מ סוכרוז (סוכרוז) ו- 100 מ מ NaCl, 10 מ מ. טריס, pH 7.5 (מלח). בוס שלב קובע היו בציורו סוכרוז/סוכרוז (A; החלק העליון), סוכרוז/מלח (/) (A; סעיף מצולע נמוכה), מלח/מלח (B; החלק העליון), מלח/סוכרוז (B; סעיף מצולע נמוכה יותר). הקריקטורות להמחיש הדפוס הדומיננטי תחום בתוך הסעיפים המסומנים ותנאי הפתרון המתאים. שלפוחית שלב מדינות המיוצגות בסעיפים מצולע נמוכה יותר נצפו בתנאים פתרון אסימטרי על 20 x בוס דילול. הותאם הפניה9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-17138
איור 12: ממצאים ב כשמרוגזים לכוד. דוגמה בוס קטן שבו ניתן לראות תחום שווא בשל הקרבה קרוב עמדות (eSM/DOPG/חול 60/20/20). השדה-הבהיר ששודרו תמונת אור מציג את ההודעות (גרey) הוא בשכבות עם תמונה פלורסצנטיות קונאפוקלית של הבוס (כתום). ההצבות נראים כדי ליצור תבנית של התאבכות בתמונה בהירים-שדה. קרינה פלואורסצנטית האות קרוב ההודעות (מימין) מצטמצם נותן את המראה של שלב ההפרדה. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.

figure-results-17699
איור 13: דוגמאות של שני האנשים שנגדם שונים בשבי את ההודעות PDMS איפה הברית שלב הם נראים בבירור. (א) Lo + Ld שלב שלפוחית מופרדים עשוי eSM/DOPG/חול 60/20/20. שלפוחית (B) A עשוי 40/30/30 מציג תעודת זהות או Lo חד-פאזי. ערימת z קונאפוקלית שלפוחית כל נבדק כדי לוודא כי אין תחומים (out-of-להתמקד) נכחו. הקצוות של ההודעות ניתן לראות בצד ימין של התמונות (אפור). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.

figure-results-18279
איור 14: התנהגות שלב המתקבלת לאחר החלפת fluidic מלאה באמצעות המכשיר microfluidic. אותו בוס מוצג גם לפני וגם אחרי פתרון בתמורה () סימטרית מלח/מלח (/) כדי מלח/סוכרוז (/) (eSM/DOPG/חול 60/20/20, סולם בר הוא 2 מיקרומטר) ו- (B) סימטרית סוכרוז/סוכרוז (/) כדי סוכרוז/מלח (וצ'ק אאוט) (DOPG / eSM/חול 30/40/30, סולם בר = מיקרומטר 3). הותאם הפניה9.

Discussion

ייצור מוצלח של האנשים שנגדם עבור שלב תצפיות המדינה תחת תנאי מליחות גבוהה סימטרי אסימטרי

הפרוטוקולים המובאת כאן מציג אסטרטגיה כדי להעריך את ההשפעה של אסימטריה מאגר והפתרון מליחות גבוהה על המדינה שלב ממברנה של האנשים שנגדם טעון על מגוון רחב של יצירות. אחד האתגרים הגדולים לקראת השגת מטרה זו היה הייצור של האנשים שנגדם טעונה במאגרי מליחות גבוהה.

אנחנו בהצלחה מיוצר כשמרוגזים סוכרוז פתרון ומאגר גבוהה-תמיסת מלח על ידי פשוטה ספונטנית נפיחות בגישה, הכולל שלב טרום הידרציה של הסרט השומנים הופקדו שלב סופי הידרציה לילה לצמיחה שלפוחית. חשוב לציין כי העדות השומנים נעשה על צלחת PTFE roughened כדי להבטיח השומנים אפילו הפצת להניב unilamellar שלפוחית. יתר על כן, זה חיוני לבצע בכל שלב במהלך שלפוחית ההכנה בטמפרטורה איפה הסרט שומנים בדם במצב שלב הומוגניים ולא נוזל. אחר, האוכלוסייה שלפוחית עשויים להיות polydisperse בהרכב, הטיה הניתוח המדינה שלב האוכלוסייה הסופית. פרוטוקול ספציפי עבור ספונטנית נפיחות של האנשים שנגדם התשואות צליעה שלפוחית אשר מצד אחד מציע את האפשרות להשעות אותו מחדש בכמויות קטנות כדי להשיג המרוכזת דיספרסיות סטירול שלפוחית, מצד ומספק פתרון אסימטרי תנאים על פני קרום תוך מזעור הדילול של שלפוחית8,28. זה חיוני כי במהלך הדילול שלפוחית או פתרון חיצוני להחליף, הבתוך ולהישאר מחוץ osmolarities מתאימים כפי מורפולוגיה השינויים שנגרמו על ידי אי התאמות osmolarity לגרום או למנוע Lo + Ld שלב ההפרדה41 או, במקרה של היפוטוניק תנאים, עלול להוביל שלפוחית מתפוצץ.

כאן, ניסיונות כדי למטב את הפרוטוקולים electroformation בתמיסה מליחות גבוהה כתוצאה בייצור של האנשים שנגדם לא בזמן נפיחות בסיוע PVA הניב שלפוחית multilamellar. אף-על-פי זה דורש זמן הכנה פעמים ואת תוצאות באצוות שלפוחית של איכות נמוכה10,17, ייצור מוצלח של שלפוחית טעון על ידי ספונטנית נפיחות מגיע עם יתרונות נוספים. זה דורש מאמץ מינימלי בזמן וכתוצאה מכך התשואות מספיק עבור ניתוחים סטטיסטיים אצווה, בניגוד electroformation, אין ציוד מתוחכם או אופטימיזציה נדרשו. יתר על כן, לא מציג על ידי חמצון השומנים נצפו42,43. בספרות אין הבדלים בין היצירות השומנים של שלפוחית המניות המתאימות שממנו הם גדלו7,17. יתר על כן, היווצרות שלפוחית על מצע PTFE אינו מנחה הכללת כל מציג בניגוד ג'ל בסיוע שיטות נפיחות איפה מולקולות זרות עשוי להיות הציג את המצע23. Electroformation מגיע עם חסרונות נוספים הקשורים דילול שלפוחית מופרז בעת יצירת תנאים פתרון אסימטרי. האנשים שנגדם המיוצר על ידי electroformation נמצאים בדרך כלל כמו פיזור הומוגנית (להבדיל ההשעיה שלפוחית מרוכז בצורה של צליעה נוצר במהלך נפיחות ספונטנית). כל דילול של הפתרון חיצוני באופן משמעותי לדלל את המספר של שלפוחית גם כן. יתר על כן, במהלך עבודה זו שזה היה ציין כי DOPG/eSM/חול כשמרוגזים המיוצר על ידי electroformation ב סוכרוז הפך יציב אם מדולל במאגר מליחות גבוהה. קרינה פלואורסצנטית מן השומנים טלאים על השקופית מיקרוסקופ ציינו כי שלפוחית להתפרץ לפני בדיקה ויזואלית שלהם היה אפשרי. ייתכן ולשייך כל כך יציבות מתח הממברנה מוגברות של שלפוחית שהוכן על-ידי electroformation לעומת הילדים מתקבל על ידי נפיחות ספונטנית10.

למרות דילול שלפוחית היא גישה קלה ומהירה ליצור תנאים אסימטרי של פתרון בוס, זה רק מושג החלפה חלקית פתרון חיצוני, גם אם לשבר גבוהה (כאן: 95%, איור 2), כמו על דילול, עקבות נפיחות פתרון יישאר. הבחירה של מידת ההחלפה פתרון חיצוני היא פשרה בין pipetting למעלה סבך שלפוחית יחד עם הפתרון נפיחות (סעיף 2) לא לדלל אותה יותר מדי. לפיכך, הצגנו גישה אלטרנטיבית microfluidic שעלון במקומות אחרים פרט37 המאפשר החלפה מהירה ושלמה פתרון חיצוני בתצפיות המדינה שלב בוס כדי לאמת את שלב המדינה תצפיותיו עבור מדולל שלפוחית. התצפיות של וריאציות מצב שלב בעת שינוי סימטרי אסימטרי פתרון תנאים נצפו אכן להיות בהסכם. בנוסף, שתי השיטות כדי ליצור פתרון אסימטרי בתנאים המוצגים כאן הם וזהובה מהירה (השווה הפניה למעורר8) ובאים עם אין הסיכונים הידועים של שינויים בהרכב מקומיים (להשוות הפניות30,31), לודיג מתח הממברנה (השווה התייחסות32), או חימום מקומי (השווה התייחסות33), באשר שיטות אלטרנטיביות נדון בהקדמה. במהלך ההשמנה microfluidic, איזון osmotic בין שלפוחית פנים וחוץ אינו חיוני רק כדי להימנע שלב המדינה חפצים כאמור לעיל, אלא גם דפלציה נגרמת על ידי פתרון hypertonic תנאים עלול לגרום את האנשים שנגדם לכוד לחמוק דרך ההודעות לאחר חילופי פתרון חיצוני.

אף-על-פי נפיחות ספונטנית יושם בהצלחה לגדול לא טעונים שלפוחית ממערכת DOPC/eSM/חול, במקרים אחרים, בהיעדר חיובים עשוי לפגום בוס נפיחות עקב המחסור שנוצר דחיה בין הפרט bilayers44 . הארכת תקופת טרום נפיחות או היכרות עם השומנים מגושם headgroups עשויה לסתור זו בעיה45. יתר על כן, היציבות שלפוחית לאחר דילול שלהם בפתרונות שונה מזו המשמש נפיחות עשויים להיות שונים עבור קומפוזיציות שונות השומנים ומדיה דילול, אשר לא חקרנו כאן. גם לא בחנו את האפשרות של כוונון הקוטר בוס ממוצע עם שיטת הכנה המובאת כאן. אבל פרמטרים כגון פתרון קומפוזיציה שלפוחית ונפיחות נוטים להשפיע על התוצאות. היישום של שיטות אלטרנטיביות46 , תניב שלפוחית גדול יותר שומנים ופתרונות המשמש כאן, עם זאת, הם עלולים לבוא עם חסרונות אחרים הקשורים עם השיטה. הגישה המתוארת לעיל כדי לייצר כשמרוגזים בתנאי מליחות גבוהה סימטרי ו אסימטרי מספקת כלי פוטנציאלי ללימודי של שלפוחית מורכב של יצירות שונות השומנים, התפזרו מדיה שונים. כמו לא בחנו את האפשרויות הללו, ניסויים עתידיים יראה איך בדרך כלל ניתן להחיל את השיטות דילול והכנה של בוס.

התבוננות שלב ההפרדה בטמפרטורות שונות

כיוונונים ניסיוני שונים מתאימים ללמוד כשמרוגזים בטמפרטורות שונות קיימים. בעוד כיוונונים אלה לא מתוארים בדרך כלל פירוט בתוך הספרות, העבודה הנוכחית מציגה אסיפה בסיסי ישימה עבור מחקרים כאלה.

בקרת מדידות להראות כי הטמפרטורה של זה בתוך הבית תוכנן ונבנה קאמרית נשלטת בצורה מדויקת על ידי תרמוסטט, מעברי צבע הטמפרטורה בתוך החדר נמצאים במרחק הרזולוציה טמפרטורה ניסיוני. זה מובטחת כי התנאים התרמיים ניסיוני עקביים עם הקריאה של התרמוסטט.

במהלך המבדק של בוס הברית בשלב מעל טווח טמפרטורה רחב, חשוב כי השלפוחיות המוגלתיות נצפתה גם הם equilibrated לאחר הטמפרטורה השתנה. דרך אפשרית. אחת כדי להבטיח זאת הוא לבדוק עבור היסטרזיס. אם היסטרזיס, השלבים הטמפרטורה צריכה להיות ירד ו/או equilibration פעמים גדל. כמו טמפרטורה שליטה בעבודה זו נוסדה על ידי תרמוסטט על בסיס מים, טווח טמפרטורות עבודה הוא אידיאלי מוגבל ל- 0 - 100 מעלות צלזיוס. טווח זה ניתן להרחיב באמצעות אחרים נוזלים בקרת טמפרטורה כגון שמן או העסקת כיוונונים אחרים, למשל התקן Peltier. בפועל, טמפרטורת מוגבל גם על-ידי עיבוי אפשרי או אידוי. בנוסף, עבור טמפרטורות הרחק מן בטמפרטורת החדר, המופע של מעבר הדרגתי טמפרטורת מצב יציב מעבר לחדר התצפית הופכת יותר סביר. בנוסף, ציוד הדמיה עשויים להיפגע בטמפרטורות קיצוניות. טווחי טמפרטורה אופיינית המתאימה ללימודים שלפוחית השומנים (~ 10-50 ° C7,9) נזק לציוד התצפית צריכה להיחשב אבל הוא בדרך כלל לא צפוי.

שלפוחית תחום תצפית חפצים

ישנם מספר מקורות על התבוננות חפצים באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב זריחה. קודם כל, אחד צריך להיות מודע כי הרזולוציה המרבית r של אובייקט חלה לבדיקה ויזואלית של שלפוחית שלב הברית קובע מגבלת זיהוי של השומנים תחומים לפי:
figure-discussion-7452
איפה λ הוא אורך הגל פליטה, נה מספרי הצמצם של המטרה. מטרה טיפוסי עם 40 x הגדלה של נה של 0.6 אשר מזהה ירוק פליטת אור סביב 560 nm היו מגיעות עם רזולוציה אופטית של ~0.6 מיקרומטר. לפיכך, מחקרים המשווים שלב מצבים של שלפוחית זני תערובות השומנים מסוים בין שונים תנאים כדאי להשתמש אותה מטרה התערובת השומנים אותו.

חפץ נוסף הוא המופע של השומנים תחומים אלו צילום-חמצון השומנים עקב חשיפה ממושכת עירור אור41. צילום-נזק מתרחשת מעדיפים על פחמימנים רוויים השומנים moieties. למעשה, עבור כמה יצירות השומנים, כגון תחום היווצרות שלפוחית בתחילה הומוגנית נצפתה כאן לאחר תקופה ארוכה של עירור לאור החשיפה (~ 30 s). כדי להתמודד עם נושא זה, האור עירור נשמר ממוקד אחד שדה ראייה בלבד לכמה שניות הערכת המדינה שלב. לפיכך, DiIC18 היה מתאים למטרות שלנו. צבעים אחרים, עם זאת, עשויים להיות רגישים הרבה יותר, ייתכן שיהיה עליך לטפל ב עוצמות עירור נמוכות, עם זמנים קצרים יותר לאור החשיפה עירור.

גזירה מכני של העברת פיפטה השלפוחיות המוגלתיות מתערבב שעשויות להיות תחומים באופן זמני, ובכך לעוות את התנהגות שלב שלפוחית נראית לעין. עבור כמה סטיות תקן, שלפוחית שונים הראו התנהגויות שונות שלב 0 min ו- 5 דקות לאחר פיפטה להעביר אל coverslip המיקרוסקופ. גם הלחץ הטיה הנגרמת על ידי זרימת נוזל במכשיר microfluidic הוכח לגרום בתחום ערבוב47. שלפוחית צריך להיות שמאל ללא הפרעה על כמות מספקת של זמן equilibration לפני התצפית. במסגרת מחקר זה, שלפוחית לכודים על המכשיר microfluidic נותרו ללא הפרעה לשעה לאחר טעינה שלפוחית וחילופי פתרון לפני התצפית.

כדי להימנע כמה הקשיים הנ ל, כמו גם על האיסור המוטל על ידי הגבלת עקיפה אור, שיטות אלטרנטיביות כגון ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית48 או סופר רזולוציה מיקרוסקופ טכניקות49 יכול להיות מועסק.

מסקנה ו- outlook

העבודה הציג מדגים ערכה של שיטות המאפשר הניתוח של השפעת תנאים פתרון סימטרי אסימטרי מליחות גבוהה על קרום שלב ההפרדה. כל אחת מהשיטות שהוצגו מתאימים ליישומים אחרים. לדוגמה, המכשיר microfluidic מספק פלטפורמה ללמוד את קינטיקה של היווצרות תחום והעלמות על אינדוקציה פתרון האסימטריה. בנוסף, תחום מראה כפונקציה של ריכוז מלח יכול לבדוק בכיוון הזה. כל השיטות יכול לשמש גם להסתכל על ההשפעה על ההתנהגות שלב באמצעות פתרונות אחרים מעניינים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו היא חלק הקונסורציום MaxSynBio, אשר ממומנת במשותף על ידי משרד החינוך הפדרלי, מחקר של גרמניה ושל חברת מקס פלנק.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium saltAvanti Polar Lipids840475Cabbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelinAvanti Polar Lipids860061abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %)Avanti Polar Lipids700000abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorateMolecular ProbesD-282abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %)Merck
NaCl (> 99.8 %)Roth
HCl (37 %)Roth
Tris (≥ 99.9 %)Roth
Sucrose (≥ 99.5 %)Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mLKimbleSoda flat bottom, white screw cap
pH meterMettler ToledoMP220
OsmometerGonotecOsmomat030
Epi-fluorescence microscopeZeissAxio Observer D1
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP5
Objective 40x, 0.6 NAZeissLD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NALeica506174
Objective 63x, 0.9 NALeica506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Gläaser
Parafilm "M"Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mLBraun
0.45 µm syringe filterGVS North AmericaCameo 25AS, 1213723Acetate, sterile

References

  1. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys J. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  2. Bagatolli, L. A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim Biophys Acta. 1758 (10), 1541-1556 (2006).
  3. Carquin, M., D'Auria, L., Pollet, H., Bongarzone, E. R., Tyteca, D. Recent progress on lipid lateral heterogeneity in plasma membranes: From rafts to submicrometric domains. Prog Lipid Res. 62, 1-24 (2016).
  4. Baumgart, T., Hess, S. T., Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425 (6960), 821-824 (2003).
  5. Bacia, K., Schwille, P., Kurzchalia, T. Sterol structure determines the separation of phases and the curvature of the liquid-ordered phase in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (9), 3272-3277 (2005).
  6. Vequi-Suplicy, C. C., Riske, K. A., Knorr, R. L., Dimova, R. Vesicles with charged domains. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1338-1347 (2010).
  7. Blosser, M. C., Starr, J. B., Turtle, C. W., Ashcraft, J., Keller, S. L. Minimal effect of lipid charge on membrane miscibility phase behavior in three ternary systems. Biophys J. 104 (12), 2629-2638 (2013).
  8. Pataraia, S., Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1838 (8), 2036-2045 (2014).
  9. Kubsch, B., Robinson, T., Lipowsky, R., Dimova, R. Solution Asymmetry and Salt Expand Fluid-Fluid Coexistence Regions of Charged Membranes. Biophys J. 110 (12), 2581-2584 (2016).
  10. Dimova, R., et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  11. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  12. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  13. van Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  14. Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C., Sandoghdar, V. Production of Isolated Giant Unilamellar Vesicles under High Salt Concentrations. Front Physiol. 8, 63 (2017).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome Electroformation. Faraday Discuss. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 19, 323-336 (1988).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  18. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  19. Pott, T., Bouvrais, H., Meleard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem Phys Lipids. 154 (2), 115-119 (2008).
  20. Green, N. G., Ramos, A., Gonzalez, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 61 (4 Pt B), 4011-4018 (2000).
  21. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J Am Chem Soc. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  22. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  23. Lira, R. B., Dimova, R., Riske, K. A. Giant Unilamellar Vesicles Formed by Hybrid Films of Agarose and Lipids Display Altered Mechanical Properties. Biophys J. 107 (7), 1609-1619 (2014).
  24. Kresse, K. M., Xu, M., Pazzi, J., Garcia-Ojeda, M., Subramaniam, A. B. Novel Application of Cellulose Paper As a Platform for the Macromolecular Self-Assembly of Biomimetic Giant Liposomes. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (47), 32102-32107 (2016).
  25. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  26. Needham, D., Evans, E. Structure and Mechanical-Properties of Giant Lipid (DMPC) Vesicle Bilayers from 20-Degrees-C Below to 10-Degrees-C above the Liquid-Crystal Crystalline Phase-Transition at 24-Degrees-C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  27. Manneville, J. B., et al. COPI coat assembly occurs on liquid-disordered domains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (44), 16946-16951 (2008).
  28. Wollert, T., Wunder, C., Lippincott-Schwartz, J., Hurley, J. H. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458 (7235), 172 (2009).
  29. Kuhn, P., et al. A facile protocol for the immobilisation of vesicles, virus particles, bacteria, and yeast cells. Integr Biol (Camb). 4 (12), 1550-1555 (2012).
  30. Sarmento, M. J., Prieto, M., Fernandes, F. Reorganization of lipid domain distribution in giant unilamellar vesicles upon immobilization with different membrane tethers. Biochim Biophys Acta. 1818 (11), 2605-2615 (2012).
  31. Lipowsky, R., Rouhiparkouhi, T., Discher, D. E., Weikl, T. R. Domain formation in cholesterol-phospholipid membranes exposed to adhesive surfaces or environments. Soft Matter. 9 (35), 8438 (2013).
  32. Korlach, J., Reichle, C., Muller, T., Schnelle, T., Webb, W. W. Trapping, deformation, and rotation of giant unilamellar vesicles in octode dielectrophoretic field cages. Biophys J. 89 (1), 554-562 (2005).
  33. Delabre, U., et al. Deformation of phospholipid vesicles in an optical stretcher. Soft Matter. 11 (30), 6075-6088 (2015).
  34. Fidorra, M., Garcia, A., Ipsen, J. H., Hartel, S., Bagatolli, L. A. Lipid domains in giant unilamellar vesicles and their correspondence with equilibrium thermodynamic phases: a quantitative fluorescence microscopy imaging approach. Biochim Biophys Acta. 1788 (10), 2142-2149 (2009).
  35. Bezlyepkina, N., Gracia, R. S., Shchelokovskyy, P., Lipowsky, R., Dimova, R. Phase diagram and tie-line determination for the ternary mixture DOPC/eSM/cholesterol. Biophys J. 104 (7), 1456-1464 (2013).
  36. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 44105 (2013).
  38. Veatch, S. L., Gawrisch, K., Keller, S. L. Closed-loop miscibility gap and quantitative tie-lines in ternary membranes containing diphytanoyl PC. Biophys J. 90 (12), 4428-4436 (2006).
  39. Kolesinska, B., et al. Interaction of beta(3) /beta(2) -peptides, consisting of Val-Ala-Leu segments, with POPC giant unilamellar vesicles (GUVs) and white blood cancer cells (U937)--a new type of cell-penetrating peptides, and a surprising chain-length dependence of their vesicle- and cell-lysing activity. Chem Biodivers. 12 (5), 697-732 (2015).
  40. Robinson, T., et al. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab Chip. 9 (23), 3437-3441 (2009).
  41. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  42. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  43. Breton, M., Amirkavei, M., Mir, L. M. Optimization of the Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) with Unsaturated Phospholipids. J Membr Biol. 248 (5), 827-835 (2015).
  44. Lasic, D. D., Needham, D. The "stealth" liposome: a prototypical biomaterial. Chemical Reviews. 95, 2601-2628 (1995).
  45. Needham, D., McIntosh, T. J., Lasic, D. D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1108 (1), 40-48 (1992).
  46. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophys J. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  47. Sturzenegger, F., Robinson, T., Hess, D., Dittrich, P. S. Membranes under shear stress: visualization of non-equilibrium domain patterns and domain fusion in a microfluidic device. Soft Matter. 12 (23), 5072-5076 (2016).
  48. Veatch, S. L., Polozov, I. V., Gawrisch, K., Keller, S. L. Liquid domains in vesicles investigated by NMR and fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 2910-2922 (2004).
  49. Owen, D. M., Magenau, A., Williamson, D., Gaus, K. The lipid raft hypothesis revisited--new insights on raft composition and function from super-resolution fluorescence microscopy. Bioessays. 34 (9), 739-747 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128unilamellartransmembranemiscibility

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved