JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эксперименты по фазе отделены гигантских однослойных везикул (GUVs) часто пренебрегают условия физиологического раствора. Эта работа представляет подходы для изучения влияния высокой солености буфера на разделение фаз жидкость жидкость в заряженном многокомпонентных GUVs как функция транс мембраны решение асимметрии и температуры.

Аннотация

Фаза отделенный гигантских однослойных везикул (GUVs) экспонируется сосуществующих жидкость приказал и жидкости неупорядоченных домены общего биофизических инструмент исследовать липидный Рафт гипотезы. Многочисленные исследования, однако, игнорировать влияние условий физиологического раствора. На тот счет текущая работа представляет эффект засоленных буфера и транс мембраны решение асимметрии на разделение фаз жидкость жидкость в заряженных GUVs, от dioleylphosphatidylglycerol, яйцо сфингомиелин и холестерина. Последствия были изучены при изотермических и различных температурных условиях.

Мы описываем оборудования и экспериментальных стратегий для контроля стабильности сосуществующих жидкого доменов в заряженных везикулы условиях симметричных и асимметричных высокой солености раствора. Это включает в себя подход подготовить заряженных многокомпонентных GUVs в буфере засоленных при высоких температурах. Протокол предполагает возможность выполнить частичный обмен внешние решения простой разрежения шаг при сведении к минимуму везикул разрежения. Альтернативный подход представлен используя microfluidic устройство, которое позволяет для полного внешнего решения обмена. Изучались также влияние решения на разделение фаз при различных температурах. С этой целью мы представляем основные дизайна и полезности палаты управления внутренних построен температуры. Кроме того мы размышляем об оценке GUV фазового состояния, ловушки, связанные с ним и как обойти их.

Введение

С тех пор наблюдения микронного размера доменов в жидкость жидкость фаза отделенный гигантских однослойных везикул (GUVs) по микроскопии флуоресцирования GUVs были использованы в качестве модели системы исследовать липидный Рафт гипотеза1,2 , 3 . Как район их свободностоящая бислой лежит в диапазоне, от биологических клеток, они являются подходящим имитирует плазменных мембран, показывая гипотетическая плоты. Были проведены многочисленные исследования по таким GUVs с везикулы, диспергированных в чистой воде, сахароза или низкой солености решения4,5,6,,78. Эти условия, однако, не отражает физиологически соответствующие воздействия засоленных сред и транс мембраны решение асимметрия биомембран, как условия для клеток.

В этой работе и в предыдущей публикации из нашей группы9фазовые состояния заряженных многокомпонентных GUVs были рассмотрены как функция присутствие соли и решения асимметрия через мембрану. GUVs были подготовлены из смеси различных соотношениях dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), яйцо сфингомиелин (eSM) и холестерина (Чхоль) раствора сахарозы (с осмолярности 210 мОсм/кг) или высокой солености буфера (100 мм NaCl, 10 мм трис, pH 7.5, 210 мОсм/кг). Выбор липидов было оправдано данных, уже полученных на схеме фаза этой смеси6,8.

Ряд методов для подготовки GUVs доступны в литературе10,,1112 (Обратите внимание, что здесь, мы не будем рассматривать те, связанных с передачей липидов из масляной основе в водной фазе 13 , 14 из-за опасность оставшихся нефтяных остатков в мембраны, которые могут повлиять на поведение фаза). Подготовка GUVs в буфере засоленных связан с конкретными проблемами. Для решения низкой ионной силы electroformation метод,1516 представляет быстрый способ подготовить GUVs в высоких урожаев с мало дефектов10,17. Метод основан на внесение слой липидов на проводящие поверхности (электродов), сушки их и увлажняет их водным раствором при применении переменного поля. Однако этот метод требует корректировки, если соли в растворе18,19. Предполагается, что движущей силой роста везикул, electroformation является электроосмос16 , препятствующее высокой проводимости20. Таким образом electroswelling GUVs в засоленных решения не является простой подход, как он требует оптимизации для различных концентраций соли присутствуют в решении отек. Гель помощь везикул, отек21,22 является потенциальной альтернативой electroformation с даже быстрее формирование раз. Этот подход основывается на расширенной липидных Фильм гидратации, когда гель (агарозы или поливинилового спирта (ПВС)) используется в качестве подложки. Эти подходы, однако, приходят с риском загрязнения мембраны в случае на основе агарозы отек23 и/или температуры ограничения как и в случае на основе ПВА отек. Аналогичным образом протокол расти GUVs на бумажной подложке целлюлозы недавно был установленным24. Общие вопросы этого метода являются отсутствие контроля над субстрата чистотой, а также использование большого количества липидов. В этой работе мы представляем и представить преимущества наиболее традиционным методом GUV подготовки, а именно спонтанные отек метод25,26. Он состоит из сушки липидного слоя на подложке реагирует, увлажняющий в атмосфере водяного пара и последующие припухлость в желаемое решение опухоль (см. Рисунок 1 и детали в разделе протокол). Этот метод не имеет контроля над распределением размер пузырьков и результаты в целом небольшие пузырьки по сравнению с методами, где производство оказывают электрического поля, полимерной подложке или microfluidic означает. Однако везикул качество и размер подходит для изучения мембраны фазового состояния как изучить здесь.

Создание асимметрия между решениями через везикул мембранных связано с определенными проблемами. Один из часто используемых подходов является прямым разрежения везикул подвеска в желаемого внешнего решения27,28. Однако это также снижает плотность распределения везикул. Другая стратегия заключается в медленно обмен внешние решения вокруг GUVs поселились в нижней части потока клетки, что позволяет для решения в - и outflux. Чтобы избежать беспокойства или даже потери везикулы с потоком, низкого расхода являются прикладной8, который делает этот подход время неэффективно. Кроме того ни один из этих подходов не гарантирует полное внешнее решение обмена. Очевидным решением является обездвижить пузырьки во избежание потерять их во время внешнего решения обмена. К примеру биотинилированным GUVs могут привязными на стрептавидина покрытием поверхности29. Однако этот подход может привести к композиционным вариации на придерживался и следовательно неприкрепленных мембраны сегментов30,31. Применение магнитных или электрических полей в ловушку везикулы результаты в навязывании мембраны напряженности32. Используя Оптический пинцет для улавливания везикул требует наличия ручкой прилагается (т.е. шарик), в то время как использование оптических носилках может включать в себя местное отопление33. Треппинг GUVs также может быть достигнуто путем выращивания их на Платиновый провода без окончательного отряд34. Однако это дает пузырьки, которые не являются изолированным и которые обычно связаны с провода или другие пузырьки, тонкий липидный трубы (тросов).

Представленные работы подчеркивает стратегии для преодоления вышеуказанных ограничений. Мы сначала представить подробное описание метода спонтанное отек адаптирована и оптимизирована для производства GUVs в засоленных буферов. Затем мы представляем два подхода к эффективно создавать асимметричные решения условий простой разрежения или использования microfluidic устройства. Потому, что наша цель заключается в анализе мембраны фазового состояния GUVs в условиях различных решений, в последующих разделах описываются критерии для успешного статистического анализа и настоящем подсказки для предотвращения ложных классификации.

Анализы при изотермических условиях, а также при различных температурах. Хотя температура control обычно работает, подробности о экспериментальный контроль температуры камеры редко описаны. Здесь представлен доме построен установки соблюдать GUVs в различных температурных условиях.

протокол

1. спонтанное отек GUVs

Примечание: хлороформ это вредное вещество, которое является крайне неустойчивым. Выполните все операции, связанные с хлороформом под вытяжного шкафа. Не используйте пластиковые лабораторные наконечники или пластиковые контейнеры для передачи или хранения растворов хлороформ. Хлороформ растворяет пластик, который отравляет решение. Использование стекла шприцы и стеклянные контейнеры вместо. Кроме того как можно избежать Введение примесей, как они могут взаимодействовать с мембранами с чистой работы. Обратите внимание, что типичный липидные концентрации в окончательной подготовке GUV находятся в диапазоне от всех, таким образом примеси в этом диапазоне концентрации могут иметь сильное воздействие на поведение мембраны.

  1. Помимо основного оборудования, подготовьте следующую информацию.
    1. Подготовить политетрафторэтилен (ПТФЭ, широко известный как тефлон) пластина для осаждения липидов размер ~1.5 см x 1,5 см и соответствующего толщины. Шероховатым пластину на одной стороне с тонкой шкуркой.
      Примечание: PTFE реагирует и не будет быть смоченных хлороформ решения, если гладкой. Обе стороны пластину ПТФЭ может шероховатую чтобы избежать путаницы о правильной стороне для осаждения липидов. Толщина плиты должна выбираться для легкой обработки, например что это не слишком гибким и может быть легко охвачены гидратации решения (см. Рисунок 1). Здесь мы использовали плиты толщиной ~ 2 мм. После того, как шероховатую, пластину ПТФЭ может быть повторно использован для новых экспериментов после надлежащей очистки (шаг 1.3).
    2. Подготовить герметичные стекла флакона соответствующие тома (~ 15 мл) для окончательного липидов фильм гидратации и везикул роста.
    3. Подготовить герметичные стеклотары, в который помещается стекло ~ 15 мл во флаконе; он будет использоваться для создания насыщенных водой атмосферу для липидных Фильм до набухания, Рис. 1.
  2. Подготовить 4 мм запасы липидов в нужный коэффициент 1,2 - dioleoyl - sn - glycero - 3 - фосфо-(1 ' - rac - глицерин) (натриевая соль) (DOPG), яйцо сфингомиелин (eSM) и холестерина (Чхоль), с дополнительной 0,1 моль % 1,1 ′ - dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (DiIC 18) к концентрации липидов всего 4 мм. Использование хлороформа как растворитель. Смотрите таблицу материалов.
  3. Тщательно промойте пластину ПТФЭ и стеклянной тары с коммерческие средства для мытья посуды, этаноле и хлороформе в этой последовательности и окончательно высушить.
  4. С помощью шприца стекла, депозит и равномерно 10-15 мкл липидного запаса на шероховатую сторону пластину ПТФЭ для создания единообразных липидов фильм. Используйте иглу шприца распространить решение, если требуется.
  5. Место пластину ПТФЭ на чистую поверхность и забираются вместе с хранение липидов фильм за 2 ч при 60 ° C для удаления хлороформ. Ради удобства, депонировать пластину на очищенный и незапечатанных 15 мл стеклянной тары во время высыхания.
    Примечание: Высокой температуры гарантирует, что фильм липидов в состоянии однородная жидкость сингл в этот и все последующие шаги.
  6. После высыхания, заполнить предварительно отек стеклянной тары с деионизированной воды до уровня, который не допускает плавучести опрокинуть ~ 15 мл флакон стеклянный (~ 1 см), Рис. 1.
  7. Положите стекло ~ 15 мл флакон с пластину ПТФЭ в контейнер и покрыть ее с тем, что может возникнуть атмосфера, насыщенные водой, см. Рисунок 1B.
    Примечание: Конденсата на стенах внутреннего контейнера дает хорошее представление для успешного водяного пара насыщения.
  8. Пусть фильм хранение липидов предварительно зыбь внутри закрытой стеклянной тары при 60 ° C в течение 4 ч. В течение этого периода времени подготовить желаемое решение отек.
    Примечание: Везикул препаратов, которые могут проводиться при более низкой температуре, это время может быть чрезвычайно сокращен - вплоть до нескольких минут - если теплая вода насыщенный азота или аргона используется для предварительного набухания вместо.
    1. Подготовить 200 мм сахарозы или 100 мм NaCl, 10 мм трис, рН 7,5 скорректирована с HCl и тепла до 60 ° C, чтобы сделать решение отек.
  9. После предварительного набухания, возьмите ~ 15 мл стакан с пластину ПТФЭ из контейнера. С помощью шприца, подключены к фильтру 0,45 мкм, добавить ~ 5 мл раствора отек во флакон 15 мл стекла для увлажнения липидной пленки.
    Примечание: Фиксации иглы к фильтру облегчает включение отек решения. Предварительно потепления шприц и фильтр может быть целесообразным для обеспечения одного жидкость фазового состояния липидного фильма при добавлении отек решения. Фильтрация решение сводит к минимуму (в-) органических загрязнений, бактерий или осадок соли и т.д.
  10. Печать ~ 15 мл флаконе стекла, держа гидратированных липидных Фильм на пластину ПТФЭ для сведения к минимуму испарения. При необходимости, используйте парафин фильм для улучшения герметизации. На ночь оставить гидратированных липидных Фильм при 60 ° C для окончательного GUV отеки.

2. Заготовки GUVs

Примечание: агрегирование GUVs опухшие и отделен от PTFE субстрата результаты в комок облако как мало (~ 1 мм) видимые глазом. Она появляется беловатый не Люминесцентная краска используется. В противном случае это цветной согласно спектр поглощения Флюорофор. Добавление DiIC 18 оказывает облако розовый (см. Рисунок 2). Везикулы сосредоточены в совокупности и уборки он увеличивает урожайность везикул.

~1/10
  1. круто вниз пузырьки до комнатной температуры в течение ~ 1 ч. Cut заостренный конец поршня пипеткой пластикового наконечника для кластера или совокупность везикулы подходят через отверстие.
    Примечание: Скорость охлаждения особенно важно, если разделение твердой и жидкой фаз ожидается, поскольку он изменяет размер твердых доменов. Здесь, чтобы замедлить охлаждения, мы разместили образца при контакте с металлический блок размер 5 см х 9,5 см х 7.5 см (H x L x W), охлаждают до комнатной температуры в течение 1 ч.
  2. Пипетку вверх кластера вместе с соответствующим объемом опухоли решение (см. Рисунок 2). Вновь приостановить агрегата в опухоль решение для создания условий симметричное решение, или любого желаемого iso осмотического решение для создания асимметричных решение условий.
    Примечание: Нижний предел объема ограничивается размер совокупности полностью собраны. Внешние решения разбавляется и для того чтобы оценить точные концентрации, объем везикул решение должно быть принято во внимание.

3. Наблюдение за GUVs для этапа государственной оценки с помощью флуоресцентной микроскопии

Примечание: GUVs были легированного DiIC 18 как флуоресцентные маркер. Этот Флюорофор преференциально перегородки в фазу неупорядоченных жидкости (Ld). Это позволяет для наблюдения микроскопии флуоресцирования доменов результате разделение фаз в GUVs. Мы провели оценки состояния фазы с epi флуоресцентной микроскопии. В принципе эти замечания также возможно с помощью Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM), который также позволяет для количественного определения сигнала (например для определения unilamellarity мембрана). Однако, CLSM требует более сложного оборудования и (обычно) epi флуоресценции замечания перед сканированием полезны в любом случае.

  1. Решение о цели (например 40 кратном с 0.6 числовой апертуры (NA) используется здесь) соблюдать GUVs и последовательно использовать при сравнении этапе государствам того же состава в различных solution условия. Использовать соответствующие фильтры волны возбуждения и выбросов для включения наблюдения флуоресценции с Флюорофор используется (например, возбуждение в 560 Нм ± 40 и 630 ± 75 Нм с 585 splitter луча Нм в между используется для DiIC 18).
    Примечание: Этап государственной границы в пределах фазовая диаграмма будет зависеть от резолюции, что цель достигается как он определяет минимальный размер микро доменов обнаружения.
  2. Для анализа, только выберите GUVs, которые выполняют следующие критерии качества.
    1. Обеспечение unilamellarity мембраны GUV путем визуального наблюдения различных пузырьков и сравнить их интенсивности; везикулы с низкой интенсивностью флуоресценции выбросов являются скорее однослойных.
      Примечание: Спонтанное опухоль может принести везикул серий, где большая часть гигантских везикулы не являются однослойных.
    2. Выполнить дополнительную проверку путем количественной оценки интенсивности флуоресценции выбросов якобы гигантских однослойных везикул и проверьте соответствующий сигнал для рассеяния в численности населения. Если наблюдаются различия не целое число между различными GUVs, все из них, вероятно, быть однослойных.
      Примечание: Если везикулы готовятся из обычных липиды, созданной методом как спонтанное отеки, подход, описанный выше для обнаружения однослойных везикул является достаточным. Если создание нового GUV подготовка протокола или с использованием нетрадиционных липиды, потребуются более подробные исследования для подтверждения unilamellarity. Например сигналы флуоресценции мембраны помечены везикулы, подготовленный новый протокол можно сравнить с теми GUVs, подготовленный установленным методом; или мембраны поры протеина α-hemolysin могут быть вставлены в пузырек мембраны 24. Краситель добавил наружу пузырьки затем ввести их интерьер или нет, в зависимости от наличия uni - или multilamellar везикулы, соответственно.
    3. Обеспечить разумный минимальный диаметр для доменов по-прежнему быть узнаваемым GUV.
    4. Убедиться, что GUV (почти) без дефектов, например, выпуклые или приклеенная частей или внутренней структуры.
  3. Передачи Алиготе GUV подвеска на слайд микроскопа и запечатать его должным образом. Подготовьте камеру наблюдения.
  4. Депозит образца на слайд микроскопа. Его окружают, силиконовые прокладки с Центральной круговой вырез. Чтобы избежать загрязнения, убедитесь, что заполнитель не соприкасается с образца. Печать внутренних, поместив крышка выскальзования поверх силикона распорку.
    Примечание: Вместо силикона прокладку, один можно использовать силиконовую смазку или домашней polydimethysiloxane (PDMS) распорки. Герметизация камеры гарантирует минимальное испарение образца и поддерживает условия iso-osmolar.
  5. Оставить образец для ~ 5 мин для повторного уравновешивания возможных доменов.
    Примечание: Механических напряжений от дозирование может смешать мембраны доменов, которые необходимо время для реформы.
  6. Место микроскопа с образцом на сцену микроскоп и анализ фазового состояния пакетных GUV в статистический подход. Наблюдение за более чем 30 GUVs в пакете и определить их фазового состояния согласно следующие критерии для оценки состояния GUV фазы с DiIC 18 ( рис. 3).
    Примечание: После их роста, пузырьки могут изменить их индивидуальные композиции из-за (к примеру) домена, многообещающий покинуть или обмен материалом мембраны через нанотрубок. GUVs поэтому экспонат композиционные вариации в том же пакете 35. Фаза
    1. сингл жидкость, либо жидкость приказал (Lo) или неупорядоченных жидкости (Ld): Убедитесь, что общая форма GUV сферических и гладкой и DiIC 18 однородно распределяется в мембране (первые изображения в верхней и нижней панели в < сильный класс = «xfig» > рисунок 3).
    2. Двухфазный Lo + Ld сосуществования государств: Убедитесь, что везикулы exhibit домены, которые появляются круглые с гладкой границ; согласно DiIC 18, разделение поведение домены являются ярко-красный (Ld) или темно-красный/черный (Ло) (второй изображения в верхней и нижней панели на рис. 3, в ложный цвет). Убедитесь, что домены являются бесплатными для распространения на поверхности пузырьков и может срастаться.
    3. Двухфазный твердых (S) + жидкое состояние сосуществования (S + Ло или S + Ld): Убедитесь, что домены могут появиться палец как или округлые, но с угловой границ (третий изображения в верхней и нижней панели на рис. 3). Соблюдайте жидкого доменов (красный) на фоне твердого (черный), что не будет отображать диффузии. Напротив, твердый (черный) доменов будет бесплатным для диффузного на фоне жидкость (красный).
    4. Трехфазный S + Ло + Ld сосуществования: наблюдать три типа доменов появляется: (i) угловой черные домены (S), встроенный в dim (Ло) (ii) и (iii) яркий (Ld) красный доменах.
  7. Населения GUVs приписать фазового состояния, которое было установлено быть доминирующей среди случайной выборки, как показано в следующих примерах:
    1. Если 20 наблюдаются сингл жидкость GUVs и 15 GUVs Lo + Ld, рассмотрим пакет быть сингл жидкие фазы.
    2. Если 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs и 25 сингл жидкость GUVs наблюдаются, рассмотрим пакет быть Lo + Ld.

4. GUV наблюдения в Microfluidic устройства

Примечание: сначала изготовить устройство microfluidic; детали microfluidic дизайн устройства и собраний были даны других 36 , 37; Краткое описание см Рисунок 4.

  1. Готовить свежие GUV опухоль решение (соли или сахароза согласно шаг 1.8.1) и процеживают через фильтр 0,45 мкм.
    Примечание: Любые примеси в пропуская решения могут засорить устройство microfluidic.
  2. Вырезать 200 мкл поршневые Пипетка пластиковая советы и поместите их в отверстия в PDMS частью устройства. Добавить 100 мкл и 5 мкл свежий и отфильтрованных опухоль решение в водохранилище (см. Рисунок 5A) и каждый из разреза Пипетка советы, соответственно. Центрифуга для всего устройства на 900 x g 10 мин в качели ротора центрифуги для предварительного заполнения устройство и удалить воздух.
  3. Предварительно заполнить стекло 1 мл шприц и придает трубки с решением отек и перемещает поршень 0 мл.
  4. Место трубы в оптимизированных розетку устройства и поместите шприц в шприцевой насос.
    Примечание: Выбор шприц и шприц насос бренд не важно. Однако, стекла шприцы являются более точными и насос должен уметь работать в диапазоне потока мкл/мин.
  5. Подключить блок управления пользовательских давления на 8 входов управления microfluidic слой (см. рис. 5A). Установить давление на блок управления давлением 3 бар (воздуха, азота или аргона), но присвоено microfluidic устройство в закрытом положении клапана.
  6. Место microfluidic устройство, теперь подключен блок управления шприц насоса и давление, на Перевернутый конфокального микроскопа.
    1. Использования в цель с такой же масштаб и NA как во время массовых наблюдений. Управление, если этап государственной статистики, как описано в шаге 3.7 остаются теми же, если используется другая цель избежать наблюдения артефактов, которые основаны на различных резолюциях.
  7. Загрузить в устройство GUVs.
    1. Первый, Пипетка прочь все, но 25-50 мкл раствора, который остался в водохранилище. 150 мкл раствора GUV (сахарозы или соли согласно шаг 1.8.1, но соответствующие решение используется для предварительного заполнения устройство в шаг 4.1) в водохранилище и микс от нежной закупорить. Установка шприц 10 мкл/мин скорость потока в снять режим для примерно 20 минут или до тех пор, пока более чем 90% ловушки заняты.
      Примечание: Водохранилище не должно допускаться иссякать. Если это произойдет, пузырьки воздуха вступит микро каналы. Добавить больше GUV решение в reservoir во время загрузки, но заботиться не принимать воздушные пузыри, когда дозирование в устройство.
  8. Открыть все подразделения клапаны регулировки давления для закрытия microfluidic кольцо клапаны вокруг GUVs ловушки. Шприцевой насос равным 0 мкл/мин. После 1 h соблюдайте GUVs и записи конфокальный изображения. Возбуждают и обнаружить GUVs согласно Флюорофор используется (например, возбуждение в 561 Нм и обнаружения между 580-620 Нм для DiIC 18). Используйте те же критерии отбора от шаг 3,6 , и заботиться, чтобы отметить местоположение каждого GUV (то есть столбец и строка номер, см. Рисунок 4)
  9. обмена решения вокруг GUVs .
    1. Равным 0 мкл/мин шприцевый насос и Пипетка прочь все но 25-50 мкл раствора GUV из водохранилища. Добавьте 150 мкл раствора 2-й (в сахарозы или соли согласно шаг 1.8.1, в зависимости от желаемого решения вне GUVs) в водохранилище и микс, нежный закупорить. Пипетка прочь все но 25-50 мкл буферный раствор из резервуара.
      Примечание: Это решение должно быть отфильтрованы с помощью фильтра 0.45 мкм слишком.
  10. Повторите предыдущий шаг по крайней мере 5 раз тщательно заменить решение в водохранилище. Установите шприц 10 мкл/мин скорость потока в отказаться режим для ~ 10 мин для замены раствора в микро каналах.
  11. Снизить скорость потока в 1 мкл/мин открыть 8 клапаны регулировки давления блока 2 s и снова закрыть (в результате открытия и закрытия клапанов microfluidic кольцо). Снова установить 0 мкл/мин скорость потока.
  12. После 1 h, соблюдать GUVs и записи конфокальный изображения. Опять же, заботиться, чтобы отметить column и row микро-камеры, где каждый GUV расположен Разрешить сопоставление же GUV до и после обмена внешний буфере.

5. Дизайн и калибровка температуры контрольной палаты

Примечание: подходящую камеру для контроля температуры могут быть получены коммерчески или построил дом. Контроль температуры обычно достигается путем тепловой муфта камеры с GUV образца на водяной бане или элемент Пельтье. Здесь мы описываем, проектирование и характеристика постройки дома контроль температуры камеры с внешней водный термостат. Такие термостаты доступны во многих лабораториях или может быть спасен от старого оборудования, таких как лазеры или спектрометры.

  1. Собрать камеру теплового потока, здесь, сделаны из алюминиевого блока, с разъемами на водяной бане как показано на рисунке 6. Уплотнение отверстия в верхней и нижней и включить яркие области наблюдения выборки путем склеивания очки покрытия на блок.
  2. Флип потока камеры на стороне где образца будут размещены и Пипетка капли около 100 мкл раствора, используемая в экспериментах по шаг 1.8.1. При необходимости вставьте волоконно оптические температурный зонд (например FISO FTI-10) или добавить краситель чувствительных к температуре в соответствующей концентрации, например 500 мкм родамин б.
  3. Собрать GUV наблюдения камеры с помощью Силиконовая смазка на хранение в форме кольца или некоторые другие разделители (PTFE или резина) и запечатать его с покровным стеклом 0,17 мкм. Убедитесь, что падение не соприкасается с герметизации агента или прокладку, чтобы избежать Введение примесей.
  4. Медленно поверните Ассамблея вверх вниз и подключить внешние воды термостат с соответствующей трубы к нему. Обратите особое внимание на любых протечек воды.
  5. Набор самых низких желаемой температуры на термостате внешние воды и пусть система сбалансировать до тех пор, пока чтение датчик температуры стабильной; время, необходимое для уравновешивания даст оценку времени минимальный отклик системы.
  6. Выполнения управления экспериментов по крайней мере один раз перед началом использования камеры.
    1. Измерения температуры раствора (например с зондом волокна стекла) и сравнить его к чтению термостата диапазоне температур интерес.
    2. Проверка на минимальное смещение от чтения термостат и линейность измеренных температур.
    3. Проверить градиента температуры внутри камеры наблюдения с помощью температуры чувствительных красителя. Измерьте температуру раствора через интенсивности флуоресценции или флуоресценции жизни изображений микроскопии (FLIM) для различных расстояний от нижней крышки выскальзования 40. Дополнительно проверить, если есть любые градиент температуры в регионе GUV наблюдения, как показано на рисунке 7.

6. GUV наблюдений при различных температурах

Примечание: как правило, для GUVs которых потенциально фазы отделите мембраны и что, как представляется, быть однородной на наблюдения температуры T obs, фазовое разделение будет Индуцированная ниже T obs (ли это наблюдается зависит температурный диапазон расследование). Наоборот, разделенных фазы везикулы должна стать однородной при температуре выше, чем T набл. Однако это не требуется в случае конкретного (комплекс) липидного состава, и было бы интересно всегда сканировать диапазон всей доступной температура 38. Протокол для наблюдения и оценки этапа перехода температур не полагаться на конкретный метод, используемый для контроля температуры.

  1. Собрать камеры наблюдения температуры согласно разделу 5, опуская волоконно оптические температурный датчик или чувствительных к температуре Флюорофор.
  2. Установите внешний водяной бане до комнатной температуры (23 ° C) и пусть система сбалансировать на 10-15 мин
  3. Подсчитать количество фазы отделены везикулы, с использованием критериев от шаг 3,6; Общий этап GUV населения даст подсказку о регионе перехода температуры системы. Если состояние фазы через везикул населения довольно неоднородная сразу перейти к шагу 6.5.
  4. Увеличение (если большинство везикулы, разделенных фаза) или уменьшение (если большинство везикулы однородных) температура в грубой интервалы (например 1-2 ° C) и пусть система сбалансировать для около 2 мин переоценку фазового состояния GUV населения средств случайной выборки и изменять температуру до тех пор, пока население пузырек показывает состояние гетерогенной фазе.
  5. После того, как численность населения составляет около точки фазового перехода (т.е. этапа государства среди отдельных GUVs довольно неоднородная), уменьшить интервал температуры (например 0.5 ° C) для увеличения разрешения. Пусть система сбалансировать для ~ 2 мин и повторную оценку фазового состояния GUV населения путем случайной выборки.
  6. После прохождения точки фазового перехода, держать различной температуры, до тех пор, пока все GUVs теперь однородных или фаза разделенные, соответственно.
  7. Проверить гистерезиса для оценки того, достаточны ли время уравновешивания.
    1. Изменить направление температуры сканирования, я.e. Если проверки было сделано для увеличения температуры, выполните проверки, уменьшив температуру.
    2. Выбрать по крайней мере подмножество температур оценить коэффициент состояния фазы GUV населения (например, 80% этап отделенный).
    3. Если существенные отклонения между обоих направлениях в фазе коэффициент состояния указывают гистерезиса, уменьшить размер шага температуры и/или увеличить время уравновешивания в шагах 6.4 и 6.5.
    4. Если не указано в равных соотношениях гистерезиса, рассмотреть вопрос об увеличении размера и/или уравновешивания время шага.
  8. Участок фазы соотношения государства против температуры. Для количественной оценки, подходят данные для соответствующей модели ( рис. 8).
    Примечание: Фаза перехода кривые обычно располагают сигмоид траектории и сигмоид Больцмана модель обеспечивает соответствующий набор установку параметров:
    figure-protocol-24509
    y: фракция Униформа/фаза запятыми GUVs
    1: значение первоначального фракция
    2: значение Заключительная фракция
    T: температура
    T, смешать: температура на половину максимальные y
    Y является фракция однородных GUVs, А 1 и 2 A должна быть исправлена до 0 и 1, соответственно. Как смешиваемости перехода предполагается сигмоид, когда фракция значение измеряется 0 при определенной температуре, которые считаются все фракции значения диапазона температур ниже 0. Наоборот, когда фракция значение 1 при определенной температуре, все фракции значения диапазона температур выше считаются 1.

Результаты

Отек GUV

Спонтанное отек подход, описанный здесь GUVs состоит из DOPG, ЭОР, и Чхоль были выращены на ночь в 210 мм сахарозы или 100 мм NaCl, 10 мм трис, pH 7.5, формируя видимые агрегата. Агрегат для сбора урожая обеспечивает высокий везикул урожайности. Ресуспендирования в решении отек привел к симметричным транс мембраны решение условий. Для создания асимметричного условий, агрегатная был высокомобильна в iso-osmolar сахарозы или высокой солености раствора, соответственно (Рисунок 2). Результате разрежения соответствует квази внешние решения обмена при сведении к минимуму разрежения количество GUVs.

Отображение фазы диаграмма GUVs, с помощью микроскопии флуоресцирования

Присутствие 0,1 моль % специфичные для фазы18 DiIC в GUVs допускается для наблюдения за их фазы государств через широкий поле флуоресцентной микроскопии. Везикулы экспонируется S + L фазовое разделение были замечены через 63 x / 1.2NA чтобы иметь возможность решить тонко структурированные палец как домены. Для всех остальных случаев, 40 x / 0,6 NA цели было использовано. Чтобы избежать артефакты во время визуального осмотра GUVs и максимизировать воспроизводимости, определенные критерии были установлены, определить какие везикулы рассмотреть для фазового состояния анализа (протокол шаг 3,6).

GUVs, приготовленный из трехкомпонентные смеси DOPG/eSM/Чхоль широкого круга соотношений опухшие в сахарозы или высокой солености раствора и наблюдается при комнатной температуре выставлены однородных разделение фаз Lo или этапы Ld, Lo + Ld и S + L, см. Рисунок 3. Рис. 9 показывает образцово дефектных пузырьки, которые не должны быть включены в анализ данных и также показано, как определить multilamellar везикулы.

Благодаря их неизвестные истории GUVs, вероятно, на выставку в рамках пакетного композиционный вариант35. Следовательно общее состояние этапа конкретного состава была определена в статистический подход. GUV популяций некоторых липидного состава были приписаны фазового состояния, которое было отмечено быть доминирующей в случайной выборке (протокол шаг 3,6). Тем не менее композиции, недалеко от региона сосуществования Lo + Ld часто принесли серий, где узкие большинство составили доминирующей фазового состояния. Для таких случаев расплывчаты визуальный осмотр был повторен с по крайней мере три независимых выборок. Фракция везикулы с идентичными фазового состояния (например выставке Lo + Ld разделение фаз) присутствует в случайных выборок, усредненное количество испытаний, который был взят как окончательный результат (рис. 10).

Описанные протоколы привели к достаточного роста GUV в широком диапазоне различных соотношениях DOPG, ЭОР и Чхоль в решениях засоленных и сахароза. Обширные регионы в троичной фасы диаграм могут быть сопоставлены в условиях как симметричные, так и асимметричные высокой солености раствора (рис. 11). Различия в поведении фазы везикул, наблюдается в условиях различные решения были обсуждены других деталях9.

Наблюдений поведения фазы после полного буфера обмена с помощью метода microfluidic

Создание асимметричного решение условий путем разбавления приводит остатков раствора отек вне. Наш подход microfluidic позволяет для полного внешнего решения обмена. Рисунок 5A показывает microfluidic устройство полностью собран на сцене конфокального микроскопа совместно с аэрогидродинамических розетки и контроля давления отверстия. Трубы соединены через металлические трубы 90 ° обеспечить пространство для препроводил свет воображения от выше.

Для наблюдения в рамках microfluidic устройства, Конфокальный микроскоп с 63 x / 1.2NA воды погружение объектив был реализован. Как и в случае с предыдущими замечаниями навалом, DiIC18 был использован для пятно мембраны. При принятии замечания этапа, которую государство GUVs в ловушке в устройстве, необходимо позаботиться не интерпретировать данные. Благодаря непосредственной близости GUVs на должности легкие пути возбуждения и выбросов может быть частично заблокирован PDMS приводит к ложным появление доменов (Рисунок 12). Здесь передаваемого света обнаружения полезно проверить на должность GUVs на постах. Это нежелательный эффект особенно заметно для небольших GUVs менее 10 мкм в диаметре. В этих случаях данные были отклонены. Конфокальный изображение на рисунке 13А показывает раздел Вселенский везикул, который пересекает Ло домена настоящему на GUV везикул. В этом случае плоскости сечения сканирование далее выше или ниже раздела будет не показало домена из-за своего небольшого размера, по сравнению с, что GUV, который является, почему он бы упустить и пузырьки считается в однородной фазового состояния. Таким образом конфокальная z стека следует использовать для проверки по всей поверхности GUV. Для микроскопии поля это не может быть проблемой, потому что весь пузырек может быть imaged одновременно.

Наконец приводятся примеры из GUVs до и после обмена внешнего решения когда ясно что этапа являются государства мембран (рис. 14). Каждое устройство имеет 60 камер (каждый с парой постов для улавливания одного GUV), позволяя десятки экспериментов на устройство (см. Рисунок 4). Однако некоторые GUVs могут заблудиться во внешние решения обмена. Это могут быть уменьшиты следующие шаги: 1) с помощью бычьим сывороточным альбумином (БСА) покрытие для предотвращения GUV адгезии/разрыв на постах; покрытие делается путем разоблачения стены камеры до 20 мг/мл BSA для последующего полоскания с рабочего буфера и 60 мин. Poly(L-lysine) графт poly(ethylene glycol)39другой адгезивные молекулы, которые могут быть использованы. 2) тщательно осмотического соответствующий внутренний и внешний решений, чтобы избежать периферическим GUVs, которые могут проходить через центр сообщений или разрывать GUVs. 3) оптимизация GUV подготовки процедуры получения везикулы больше ~ 8 мкм в диаметре для предотвращения прохода через центр сообщений.

Дизайн и характеристики контролируемой температурой камеры для наблюдения GUV фаза государства

Мы разработали простой поток камеры, которая включает соединения к внешним водный термостат (рис. 6). Мы получилиПалата фрезерованием алюминиевого блока. В общем палата материал не нужно быть тепла кондуктивный, как образец сочетается в ванну воды, Нижняя крышка стекла как показано на Рисунок 6B и 6 C.

Независимо от точный дизайн следует оценивать производительность камеры. Конкретно мы проверили на линейность температура образца с внешне набор температуры, любые систематические температуры смещение и градиент температуры внутри камеры. Первые две точки были рассмотрены прямые измерения температуры внутри камеры волоконно оптические температурный зонд (например FISO FTI-10). Мы также проверили для градиента температуры в пределах GUV подвеска. Такой градиент может проистекают из теплового потока на внешней камеры. Измерения пространственно решена температуры могут быть получены путем чувствительной Флюорофор температура40, смотрите Рисунок 7.

Печать данных и уместно получить Tсмесь разделенных фазы GUVs

Заговоре фракция однородных GUVs наблюдаемых температурном диапазоне привели к точке траектории sigmoidally формы данных. Мы подходят данные модели Больцмана (протокол раздел 6.8), из которого Tсмесь может быть выводятся ()рис. 8).

figure-results-8834
Рисунок 1: экспериментальный шаги во время спонтанной отек протокол (Верхняя панель) с соответствующей стадии роста везикул (Нижняя панель). (A) A однородных липидной пленки распределяется на шероховатую пластину ПТФЭ и сушеные от любого растворителя. (B) сушеные липидов фильм затем предварительно опухшие в атмосфере насыщенных водой внутри закрытого контейнера с водой, чтобы облегчить бислой гидратации. Недействительными стеклянный флакон содержит пластину ПТФЭ и остается открытым во время этого шага гидратации. (C) предварительно опухшие липидной пленки наконец полностью становится гидратированных путем добавления желаемого отек решения на пластину ПТФЭ покрытием липидов внутри стекла флакона. Чтобы избежать испарения, стеклянный флакон должным образом запечатаны в течение ночи инкубации. Чтобы свести к минимуму композиционные вариации в рамках пакета, все шаги должны быть выполнены при температуре где смесь липидов полностью смешивается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-10167
Рисунок 2: GUV уборки. (A) A хранение липидов фильм, состоящий из DOPG/eSM/Чхоль в молярной соотношение 20/60/20 с 0,1 моль % DiIC18 был опухшим в буфере засоленных состоит из 100 мм NaCl, 10 трис, pH 7.5. Крышка стеклянная дополнительно опечатали пленкой парафина. Увеличенной области интереса содержит результирующий GUV агрегата. Его красный внешний вид является следствием присутствия DiIC18. (B) GUVs были собраны с наконечником усеченного пипеткой. В этот образ агрегатная был накапаны вверх вместе с 50 мкл отек решения, которые были переведены в свежий флакона. (C) для создания асимметричного транс мембраны условий решения, агрегатная был разводят в другой внешней изотонический раствор. Здесь, агрегат вместе с 50 мкл, отек решение было высокомобильна в 950 мкл раствора сахарозы результате разрежения 20 x отек решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-11401
Рисунок 3: GUV imaging. Широкое поле флуоресценции изображения GUVs, легированного 0,1 моль % DiIC18 подготовлен и наблюдается в симметричных соли или сахароза решений, состоящий из различных соотношениях DOPG, ЭОР и Чхоль (соли буфера, слева направо: 40/20/40; 50/20/30, 30/60/10; в сахароза, слева направо: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Образы изображают GUVs в разных государствах (параллельных) этапа, согласно критериям, изложенным в протоколе шаг 3,6. Здесь, пузырьки были образы через 40 X / 0,6 NA цель. Масштаб баров = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-12277
Рисунок 4: макет дизайна канала microfluidic. GUVs введите аэрогидродинамических нижнего слоя (изложил каналов) через впускной ниже водохранилище. Фильтр блокирует нежелательные мусора от устройства. Они затем введите массив 60 камер (8 строк и 15 столбцов) каждый содержащий сообщения для одного GUV захвата (см. вставки). Каждая камера может быть изолирован в кольцо клапан приводом управления слоем (заполненные черный каналы) выше аэрогидродинамических слоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-13067
Рисунок 5: устройство Microfluidic. (A) фотография microfluidic устройство, используемое для улавливания одного GUVs и полностью обмена внешнее решение. Метки указывают водохранилища для добавления решения (1), 8 x давления отверстия подключен к давления управления блок (2), и оптимизированных розетки подключены к шприц и насос (3). Панель (B) показывает блок управления давлением, показывая 8 клапанов, каждый регулирующий 1 трубки подключены к устройству microfluidic. Здесь открыты клапаны #1 и #2 и поэтому соответствующий кольцо Клапаны закрыты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-13981
Рисунок 6: палата контроля температуры. (A) Палатаперед Ассамблеей. (B) собранный палата (вверх) с 2 мм крышка стекла приклеены к верхней и нижней. Оранжевые резиновые прокладки меры 0,5 мм в высоту и опечатаны с 0,17 мм покрытие скольжения для наблюдения закрытых GUV подвески. В этом изображении температурный зонд вставляется для целей калибровки (коричневый волокна, выходе из камеры на право). (C) окончательная сборка на сцене инвертированным микроскопом без датчика температуры. Оранжевые резиновые прокладки теперь вниз. Резина-клей достаточно провести образца на месте. Обратите внимание, что свет может передаваться через образец, позволяя epi флуоресценции и яркие полевых наблюдений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-15056
Рисунок 7: данных пространственно решена температуры внутри камеры наблюдения получено FLIM измерения температуры чувствительных краска (здесь: 500 мкм родамин B) 40. точек данных, полученных на 0, 10, 30, 300 и 400 мкм выше нижней крышки выскальзования. Красный и синий точек данных были измерены для температуры водяной бани, установлен на уровне 30 ° C и 12 ° C, соответственно. Черный данных указывает слева ванна воды, чтобы сбалансировать до комнатной температуры. Небольшие температурные колебания по всей камере были наблюдается, но оставался ниже 0.5 ° C (серые полосы). Высота Общая камеры составляет около 500 мкм по толщине прокладки (см. выше). Планки погрешностей указывают стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-16121
Рисунок 8: Поиск температуры смешиваемости. На графике показаны отдельные точки данных состояния однородной (сингл жидкость) фракция GUVs, приготовленный из DOPG/eSM/Чхоль в соотношении 30/40/30 легированного 0,1 моль % DiIC18 от трех независимых случайных выборок (N = 20-40). Планки погрешностей представляют стандартная ошибка средств. Точки данных были установлены Больцмана модели описано в шаге 6.8 (сплошная черная линия), из которого выводится температура Tсмешивания домена,смешать (следовать красная сплошная линия на абсциссе) согласно половину максимум сигмоид кривая на ординате (пунктирная черная линия). Начальное и конечное значения (1 и2) были установлены в 0 и 1, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-17201
Рисунок 9: дефектных везикулы. Примеры гигантских пузырьки из 20/60/20 DOPG/eSM/Чхоль и легированного 0,1 моль % если DiIC18 , которые не отвечают критериям в шаге 4.2, отображаемого при микроскопии флуоресцирования поля. Диапазоны интенсивности отображения отдельных изображений были оптимизированы для флуоресценции интенсивность изображенных пузырьков каждый раз. Благодаря наличию дополнительных мембранный материал и инкапсулированные мелких пузырьков фазового состояния везикул в (A) не могут быть четко определены. Внешний вид этой гигантской везикул не допускает любого надежного визуального осмотра для lamellarity. Панель (B) изображает везикул которой интерьер переполнен мембранный материал. Как следствие флуоресценции сигнал внешней везикул мембранных накладывается с его внутренней сигнала, исключило возможность визуализации lamellarity и потенциальных доменов. (C) интенсивностью флюоресценции трех различных гигантских везикулы показаны в прямом сравнении в том же диапазоне интенсивности дисплея. Это изображение показывает, что гигантские multilamellar везикулы (1, 2) можно определить по их рост флуоресценции сигнала по сравнению с GUV (3). Здесь, multilamellar, а также однослойных гигантских везикулы экспонат Lo + Ld фазовое разделение. Везикулы во всех изображениях были образы через 40 x / 0,6 NA цель. Масштаб баров = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-18945
Рисунок 10: фракция Lo + Ld фазы разделены GUVs, усредненное по крайней мере три независимых выборок. Везикулы состояли из 30/40/30 DOPG/eSM/Чхоль недалеко от границы региона Lo + Ld сосуществования. Планки погрешностей для симметричных сахарозы условий иллюстрируют рассеяния партии к партии. Метка ординате описывает решения внутри/вне везикулы; Сахароза: 210 мм сахарозы; Соль: 100 мм NaCl, 10 мм трис, рН 7,5; Планки погрешностей указывают стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-19745
Рисунок 11: фазовая диаграмма GUVs, приготовленный из DOPG, ЭОР, и Чхоль, сопоставленный в условиях различных решений, используя сахарозу (сахароза) 210 мм и 100 мм NaCl, 10 мм трис, pH 7.5 (соль). GUV фазе государства, были изучены в сахарозу/сахарозы (A; верхняя секция), сахароза с солью (вход/выход) (A; нижней многоугольной части), соль/соль (B, верхняя часть) и соль/сахарозы (B; Нижняя полигональных раздел). Мультфильмы иллюстрируют доминирующей домена шаблон выделенные разделы и условий соответствующего решения. Везикул фазы государств, представленных в нижней секции полигональных наблюдались условиях асимметричного решение после 20 x GUV разбавления. Адаптировано из ссылка9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-20857
Рисунок 12: артефакты в ловушке GUVs. Примером небольшой GUV, где можно увидеть ложных домена из-за близости с должности (DOPG/eSM/Чхоль 60/20/20). Яркие области передано светового изображения показаны должности (grEY) накладывается с изображением конфокальный флуоресценции GUV (оранжевый). Эти должности рассматриваются для создания интерференционной картины в светлые области изображения. Флуоресценции сигнал закрыть должности (справа) уменьшается, давая появление разделение фаз. Шкалы бар = 5 мкм.

figure-results-21525
Рисунок 13: примеры двух разных GUVs захвачен PDMS должности, где четко видны фазы государства. (A) Lo + Ld фаза разлученных везикул, сделанные из DOPG/eSM/Чхоль 60/20/20. (B) пузырек из 40/30/30 участниц Ld или Ло однофазное. Конфокальный z стек весь пузырек был рассмотрен для подтверждения, что домены (фокус) не были представлены. Края должности видны на стороне правой руки изображений (серый). Шкалы бар = 5 мкм.

figure-results-22143
Рисунок 14: Результирующее поведение фазы после полного аэрогидродинамических exchange, используя microfluidic устройства. То же самое GUV показано как до, так и после решения обмена для (A) симметричный соли/Соль (вход/выход) соли/сахарозы (вход/выход) (DOPG/eSM/Чхоль 60/20/20, шкалы бар – 2 мкм) и (B) симметричный сахарозы/сахарозу (вход/выход) для сахарозы с солью (входящий/исходящий) (DOPG ЭОР/Чхоль 30/40/30, шкалы бар = 3 мкм). Адаптировано из ссылка9.

Обсуждение

Успешное производство GUVs для фазы государственных наблюдений в условиях высокой солености симметричных и асимметричных

Протоколы, представленные здесь представляет стратегию для оценки влияния засоленных буфера и решения асимметрии на мембраны фазового состояния заряженных GUVs в широком диапазоне композиций. Одной из основных задач на пути к достижению этой цели было производство заряженных GUVs в засоленных буферов.

Мы успешно производит GUVs раствора сахарозы и высокой солевых буфера простой спонтанное отек подход, который включает в себя предварительное увлажнение шаг хранение липидной пленки и ночь окончательного гидратации шаг роста везикул. Важно отметить, что отложение липидов должно быть сделано на шероховатую пластину ПТФЭ для обеспечения даже липидов распространение приносить однослойных везикул. Кроме того важно выполнять каждый шаг во время подготовки пузырьков при температуре где липидных Фильм находится в состоянии этап однородных и жидкости. Иначе везикул населения может быть полидисперсных в составе и смещения окончательный населения фазового состояния анализа. Отдельный протокол для спонтанного отек GUVs урожайности везикул комок, который с одной стороны дает возможность вновь приостановить его в небольших объемах для получения высококонцентрированный везикул дисперсии и с другой стороны обеспечивает асимметричное решение условия через мембрану при сведении к минимуму разрежения везикулы8,28. Важно, что во время везикул разрежения или внешние решения обмена, внутри и вне osmolarities остаются соответствует как морфология изменений, вызванных осмолярности несоответствия могут вызывать или предотвратить Lo + Ld фазы разделения41 или, в случае гипотонический условиях, может привести к пузырьки лопаются.

Здесь попытки оптимизировать electroformation протоколы в высокой солености раствора в результате производства не GUVs ПВА помощь отек принесли multilamellar везикулы. Даже несмотря на то, что она требует больше времени подготовке и результаты пачками везикул нижней качества10,17, успешного производства заряженных везикулы спонтанное отек поставляется с дополнительными преимуществами. Это требует минимальных усилий пока что приводит к достаточно урожайности для статистического пакета анализа и, в отличие от electroformation, требовалось не сложного оборудования или оптимизации. Кроме того без загрязнений путем окисления липидов наблюдались42,43. По данным литературы не существует различий между липидной композиции везикулы и соответствующих запасов, от которых они были выращены7,17. Кроме того образование пузырьков на подложке из ПТФЭ не запрашивает включение любых загрязнений в отличие от помогал гель отек методы, где иностранные молекулы могут быть введены в субстрат23. Electroformation поставляется с дальнейшей недостатков, связанных с чрезмерной везикул разрежения, при создании условий асимметричные решения. GUVs, производимые electroformation обычно присутствуют как однородной дисперсии (в отличие от высококонцентрированных везикул подвеска в виде образующихся спонтанное отек комок). Любого разбавления внешние решения существенно ослабит количество пузырьков также. Кроме того на протяжении этой работы было отмечено, что DOPG/eSM/Чхоль GUVs производства electroformation в сахарозу стала нестабильной, если разводят в засоленных буфера. Флуоресценции от липидные пятна на микроскопа указал, что везикулы лопнет, прежде чем их визуального осмотра было возможно. Такая нестабильность может объясняться напряженности повышенные мембран пузырьков, подготовленный electroformation по сравнению с полученными спонтанное отек10.

Хотя везикул разрежения является простой и быстрый подход для создания асимметричных GUV решение условия, он только выполняет частичное решение внешний обмен, хотя до высокой доли (здесь: 95%, рис. 2), так как после разбавления, следы опухоль решение останется. Выбор степени внешней решения обмена является компромисс между закупорить вверх везикул комок вместе с отек решения (статья 2) и не разбавляя его слишком много. Следовательно мы ввели альтернативные microfluidic подход рассматривается в других разделах подробно37 , который позволяет для быстрого и полного внешнего решения обмена во время GUV этап государственных наблюдений для проверки замечания государства фазы для разреженных везикулы. Замечания государства вариаций фазы при переходе от симметричного асимметричное решение условий действительно наблюдались быть в согласии. Кроме того оба метода для создания асимметричных решение условий показано здесь сравнительно быстро (Сравните ссылка8) и прийти с не известных рисков изменения местных состав (Сравните ссылки30,31), увеличение напряженности мембраны (Сравните ссылка32), или местное отопление (сравнить ссылку33), что касается альтернативных методов обсуждаются во введении. Во время microfluidic треппинга, осмотической баланс между везикул интерьера и экстерьера является не только важно избежать этапа состояние артефакты как упоминалось выше, но и дефляция, вызванные условиями гипертонический раствор может привести к ловушке GUVs скольжения через должности после обмена внешнего решения.

Даже несмотря на то, что успешно применяется спонтанные опухоли расти нетарифицируемых везикулы от системы DOPC/eSM/Чхоль, в других случаях, отсутствие обвинений может ухудшить GUV опухоль в результате отсутствия отталкивания между отдельными бислоев44 . Продление периода предварительно отек или представляя громоздкие липидов headgroups может противостоять этот выпуск45. Кроме того везикул стабильности после их растворения в решения, отличающегося от того, используется для набухания могут отличаться для разных липидной композиции и разбавления СМИ, которые мы не исследовали здесь. Мы также не изучили возможность настройки средний диаметр GUV с методом подготовки, представленные здесь. Но такие параметры, как состав везикул и отек решения могут повлиять на результаты. Применение альтернативных методов46 может принести большие пузырьки липиды и решения, используемые здесь, однако, они могут прийти с другие недостатки, связанные с методом. Выше подход для производства GUVs в условиях высокой солености симметричных и асимметричных потенциальным средством для дальнейшего исследования везикулы состоит из композиций различных липидов и рассеяны в различных средствах массовой информации. Как мы еще не изучили эти возможности, будущие испытания покажет, как правило, могут быть применены методы приготовления и разбавления GUV.

Наблюдения за разделение фаз при различных температурах

Существуют различные экспериментальные установки, подходит для изучения GUVs при различных температурах. Хотя эти настройки не часто подробно описаны в литературе, текущая работа представляет сборку основных применимых для таких исследований.

В ходе оценки GUV фазы государств в широком температурном диапазоне важно, что наблюдаемые везикулы хорошо достижение равновесного уровня после изменения температуры. Один из возможных способов обеспечения этого является для проверки гистерезиса. Если присутствует гистерезиса, следует понизить температуру шаги и/или уравновешивания раз увеличилась. Как температура контроля в этой работе устанавливается на водной основе термостат, диапазон рабочих температур идеально ограничивается 0 - 100 ° C. Этот диапазон может быть расширена с помощью других температуры контроля жидкостей, таких как масло или путем применения других настроек, например устройство Пельтье. На практике Рабочая температура ограничивается также возможной конденсации или испарения. Кроме того для температур от комнатной температуры, становится более вероятным возникновение градиента температуры установившемся через камеры наблюдения. Кроме того изображения оборудования может быть причинен вред при экстремальных температурах. Для типичных температурные диапазоны для исследования везикул липидов (~ 10-50 ° C7,9) повреждения оборудования наблюдения следует рассматривать, но обычно не ожидается.

Везикул домен наблюдения артефакты

Существует ряд источников для наблюдения артефактов с помощью микроскопии флуоресцирования поля. Прежде всего следует знать, что максимальное разрешение r применяется для визуального осмотра везикул фазовые состояния объекта определяет предел обнаружения липидных доменов:
figure-discussion-9563
где λ является длина волны излучения, и NA числовой апертуры цели. Типичная задача с 40 x увеличение и NA 0,6, который обнаруживает зеленый выбросов свет около 560 Нм достигнет оптическое разрешение ~0.6 µm. Следовательно, исследования, которые сравнить фазовые состояния везикулы, производится из смеси особенно липидов среди различных условия следует использовать ту же цель та же смесь липидов.

Другой артефакт является возникновение липидных доменов вследствие фото окисление липидов вследствие длительного воздействия на возбуждения света41. Фото ущерб возникает преференциально на постановление липидов непредельных углеводородов. В самом деле, для некоторых композиций липидов, такой домен формирования первоначально однородной везикулы было отмечено здесь после длительного периода возбуждения освещенности (~ 30 s). Чтобы противостоять этому вопросу, возбуждения свет продержали сосредоточены в одном поле зрения всего несколько секунд для оценки состояния фазы. Следовательно DiIC18 был подходит для наших целей. Другие красители, однако, может быть гораздо более чувствительны и могут необходимо обрабатывать в нижней возбуждения интенсивности и с более коротким временем освещенности возбуждения.

Механическое напряжение сдвига от пипетки передачи везикулы потенциально смешивает домены временно, тем самым искажения фазы поведение явно везикул. Для некоторых пакетов, различные везикулы показал поведения различными этап 0 мин и 5 мин после пипеткой перенести на Микроскоп coverslip. Также было показано касательное напряжение, вызванного потока жидкости в устройстве microfluidic привести в домене смешивания47. Везикулы следует оставить нетронутыми на достаточное количество времени для уравновешивания до наблюдения. В рамках этого исследования везикулы, захваченных на устройстве microfluidic остались спокойно за 1 ч после загрузки везикул и решения обменов до наблюдения.

Чтобы избежать некоторых из вышеупомянутых трудностей, а также ограничений, введенных света дифракционный предел, альтернативные методы, такие как ЯМР спектроскопии48 или методы микроскопии сверхвысокого разрешения49 могут быть использованы.

Выводы и перспективы

Представленная работа демонстрирует набор методов, который позволяет для анализа влияния условий засоленных симметричные и асимметричные решения на разделение фаз мембраны. Все представленные методы подходят для других приложений. Microfluidic устройство например обеспечивает платформу для изучения кинетики домена формирования и исчезновения после индукции решения асимметрии. Кроме того внешний домен как функция концентрации соли могут рассматриваться таким образом. Все методы могут также использоваться для взглянуть на влияние на поведение фазы, используя любые другие решения интерес.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа является частью MaxSynBio консорциум, который совместно финансируется федеральным министерством образования и научных исследований Германии и Общество Макса Планка.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium saltAvanti Polar Lipids840475Cabbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelinAvanti Polar Lipids860061abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %)Avanti Polar Lipids700000abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorateMolecular ProbesD-282abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %)Merck
NaCl (> 99.8 %)Roth
HCl (37 %)Roth
Tris (≥ 99.9 %)Roth
Sucrose (≥ 99.5 %)Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mLKimbleSoda flat bottom, white screw cap
pH meterMettler ToledoMP220
OsmometerGonotecOsmomat030
Epi-fluorescence microscopeZeissAxio Observer D1
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP5
Objective 40x, 0.6 NAZeissLD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NALeica506174
Objective 63x, 0.9 NALeica506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Gläaser
Parafilm "M"Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mLBraun
0.45 µm syringe filterGVS North AmericaCameo 25AS, 1213723Acetate, sterile

Ссылки

  1. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys J. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  2. Bagatolli, L. A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim Biophys Acta. 1758 (10), 1541-1556 (2006).
  3. Carquin, M., D'Auria, L., Pollet, H., Bongarzone, E. R., Tyteca, D. Recent progress on lipid lateral heterogeneity in plasma membranes: From rafts to submicrometric domains. Prog Lipid Res. 62, 1-24 (2016).
  4. Baumgart, T., Hess, S. T., Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425 (6960), 821-824 (2003).
  5. Bacia, K., Schwille, P., Kurzchalia, T. Sterol structure determines the separation of phases and the curvature of the liquid-ordered phase in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (9), 3272-3277 (2005).
  6. Vequi-Suplicy, C. C., Riske, K. A., Knorr, R. L., Dimova, R. Vesicles with charged domains. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1338-1347 (2010).
  7. Blosser, M. C., Starr, J. B., Turtle, C. W., Ashcraft, J., Keller, S. L. Minimal effect of lipid charge on membrane miscibility phase behavior in three ternary systems. Biophys J. 104 (12), 2629-2638 (2013).
  8. Pataraia, S., Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1838 (8), 2036-2045 (2014).
  9. Kubsch, B., Robinson, T., Lipowsky, R., Dimova, R. Solution Asymmetry and Salt Expand Fluid-Fluid Coexistence Regions of Charged Membranes. Biophys J. 110 (12), 2581-2584 (2016).
  10. Dimova, R., et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  11. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  12. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  13. van Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  14. Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C., Sandoghdar, V. Production of Isolated Giant Unilamellar Vesicles under High Salt Concentrations. Front Physiol. 8, 63 (2017).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome Electroformation. Faraday Discuss. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 19, 323-336 (1988).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  18. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  19. Pott, T., Bouvrais, H., Meleard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem Phys Lipids. 154 (2), 115-119 (2008).
  20. Green, N. G., Ramos, A., Gonzalez, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 61 (4 Pt B), 4011-4018 (2000).
  21. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J Am Chem Soc. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  22. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  23. Lira, R. B., Dimova, R., Riske, K. A. Giant Unilamellar Vesicles Formed by Hybrid Films of Agarose and Lipids Display Altered Mechanical Properties. Biophys J. 107 (7), 1609-1619 (2014).
  24. Kresse, K. M., Xu, M., Pazzi, J., Garcia-Ojeda, M., Subramaniam, A. B. Novel Application of Cellulose Paper As a Platform for the Macromolecular Self-Assembly of Biomimetic Giant Liposomes. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (47), 32102-32107 (2016).
  25. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  26. Needham, D., Evans, E. Structure and Mechanical-Properties of Giant Lipid (DMPC) Vesicle Bilayers from 20-Degrees-C Below to 10-Degrees-C above the Liquid-Crystal Crystalline Phase-Transition at 24-Degrees-C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  27. Manneville, J. B., et al. COPI coat assembly occurs on liquid-disordered domains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (44), 16946-16951 (2008).
  28. Wollert, T., Wunder, C., Lippincott-Schwartz, J., Hurley, J. H. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458 (7235), 172 (2009).
  29. Kuhn, P., et al. A facile protocol for the immobilisation of vesicles, virus particles, bacteria, and yeast cells. Integr Biol (Camb). 4 (12), 1550-1555 (2012).
  30. Sarmento, M. J., Prieto, M., Fernandes, F. Reorganization of lipid domain distribution in giant unilamellar vesicles upon immobilization with different membrane tethers. Biochim Biophys Acta. 1818 (11), 2605-2615 (2012).
  31. Lipowsky, R., Rouhiparkouhi, T., Discher, D. E., Weikl, T. R. Domain formation in cholesterol-phospholipid membranes exposed to adhesive surfaces or environments. Soft Matter. 9 (35), 8438 (2013).
  32. Korlach, J., Reichle, C., Muller, T., Schnelle, T., Webb, W. W. Trapping, deformation, and rotation of giant unilamellar vesicles in octode dielectrophoretic field cages. Biophys J. 89 (1), 554-562 (2005).
  33. Delabre, U., et al. Deformation of phospholipid vesicles in an optical stretcher. Soft Matter. 11 (30), 6075-6088 (2015).
  34. Fidorra, M., Garcia, A., Ipsen, J. H., Hartel, S., Bagatolli, L. A. Lipid domains in giant unilamellar vesicles and their correspondence with equilibrium thermodynamic phases: a quantitative fluorescence microscopy imaging approach. Biochim Biophys Acta. 1788 (10), 2142-2149 (2009).
  35. Bezlyepkina, N., Gracia, R. S., Shchelokovskyy, P., Lipowsky, R., Dimova, R. Phase diagram and tie-line determination for the ternary mixture DOPC/eSM/cholesterol. Biophys J. 104 (7), 1456-1464 (2013).
  36. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 44105 (2013).
  38. Veatch, S. L., Gawrisch, K., Keller, S. L. Closed-loop miscibility gap and quantitative tie-lines in ternary membranes containing diphytanoyl PC. Biophys J. 90 (12), 4428-4436 (2006).
  39. Kolesinska, B., et al. Interaction of beta(3) /beta(2) -peptides, consisting of Val-Ala-Leu segments, with POPC giant unilamellar vesicles (GUVs) and white blood cancer cells (U937)--a new type of cell-penetrating peptides, and a surprising chain-length dependence of their vesicle- and cell-lysing activity. Chem Biodivers. 12 (5), 697-732 (2015).
  40. Robinson, T., et al. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab Chip. 9 (23), 3437-3441 (2009).
  41. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  42. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  43. Breton, M., Amirkavei, M., Mir, L. M. Optimization of the Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) with Unsaturated Phospholipids. J Membr Biol. 248 (5), 827-835 (2015).
  44. Lasic, D. D., Needham, D. The "stealth" liposome: a prototypical biomaterial. Chemical Reviews. 95, 2601-2628 (1995).
  45. Needham, D., McIntosh, T. J., Lasic, D. D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1108 (1), 40-48 (1992).
  46. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophys J. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  47. Sturzenegger, F., Robinson, T., Hess, D., Dittrich, P. S. Membranes under shear stress: visualization of non-equilibrium domain patterns and domain fusion in a microfluidic device. Soft Matter. 12 (23), 5072-5076 (2016).
  48. Veatch, S. L., Polozov, I. V., Gawrisch, K., Keller, S. L. Liquid domains in vesicles investigated by NMR and fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 2910-2922 (2004).
  49. Owen, D. M., Magenau, A., Williamson, D., Gaus, K. The lipid raft hypothesis revisited--new insights on raft composition and function from super-resolution fluorescence microscopy. Bioessays. 34 (9), 739-747 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

128

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены