형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작

요약

단계 구분 된 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs)에 대 한 실험은 자주 생리 솔루션 조건 게을리. 이 작품 횡단 막 솔루션 비대칭 및 온도 기능으로 충전된 multicomponent GUVs에서 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼의 효과 연구에 접근을 제공 합니다.

초록

거 대 한 unilamellar 단계 구분 된 소포 (GUVs) 공존 전시 액체 주문 하 고 액체 난잡 도메인은 지질 뗏목 가설을 조사 하는 일반적인 생물 도구. 그러나 다 수의 연구,, 생리 솔루션 조건의 영향을 게을리. 해당 계정에서 현재 작업 충전된 GUVs dioleylphosphatidylglycerol, 계란 sphingomyelin, 및 콜레스테롤에서 성장에 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼와 트랜스 막 솔루션 비대칭의 효과 제공 합니다. 효과 등온 및 다양 한 온도 조건 하에서 공부 했다.

우리는 장비 및 실험 전략 대칭 및 비대칭 높은 염 분 솔루션 조건에서 충전된 소포에 공존 액체 도메인의 안정성 모니터링에 대 한 적용을 설명 합니다. 높은 온도에서 높은 염 분 버퍼에 충전된 multicomponent GUVs를 준비 하는 접근 방식을 포함 됩니다. 프로토콜 옵션을 소포 희석을 최소화 하면서 외부 솔루션의 부분 교환 간단한 희석 단계 수행을 수반 한다. 다른 접근은 완벽 한 외부 솔루션 교환을 허용 하는 미세 장치를 활용 하 여 제공 됩니다. 단계 분리에 솔루션 효과 또한 다양 한 온도에서 공부 했다. 이 위해, 우리는 기본 설계 및 유틸리티는 자체 내장된 온도 제어 챔버의 제시. 또한, 우리 우두머리 위상 상태 평가에 반영 함정 연관 그것과 그들을 회피 하는 방법.

서문

이후 마이크론 크기에서 도메인의 액체-액체 상 분리 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs) 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰, GUVs로 사용 되었습니다 모델 시스템 조사 지질 뗏목 가설^{1,2 , 3} . 로 그들의 독립형 bilayer의 지역 생물 세포에서 그의 범위에서 그들은 가설된 뗏목을 특징으로 하는 플라즈마 세포 막의 적당 한 모방 이다. 순수한 물, 자당 또는 낮은 염 분 솔루션^4,5,6,,78에 분산 된 소포와 같은 GUVs에 대 한 수많은 연구 수행 되었습니다. 그러나 셀에 대 한 조건으로이 조건은, 높은 염 분 환경 및 횡단 막 솔루션 비대칭 biomembranes의 순수 관련 노출을 반영 하지 않습니다.

이 작품에서는, 우리의 그룹⁹에서 이전 간행물에서 충전된 multicomponent GUVs의 위상 상태는 막에 걸쳐 소금과 솔루션 비대칭의 존재의 기능으로 시험 되었다. GUVs는 dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), 계란 sphingomyelin (eSM), 고 콜레스테롤 (철) (210 mOsm/kg의 osmolarity)와 자당 솔루션 또는 높은 염 분 버퍼 (100 m m NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210의 다른 비율의 혼합물에서 준비 했다 mOsm/kg 기준)입니다. 지질 선택이 혼합^6,8단계 도표에 이미 얻은 데이터에 의해 정당화 되었다.

GUVs의 준비에 대 한 메서드의 여러 문학^10,,1112 에서 사용할 수 있습니다 (여기에 유의 우리 그 지질 석유 기반에서 수성 단계 전송 포함을 고려 하지 것입니다 ^{13 , 14} 단계 동작에 영향을 미칠 수 있는 막에 남아 있는 기름 잔류물의 고유한 위험 때문에). 높은 염 분 버퍼에서 GUVs의 준비는 구체적인 과제와 연결 됩니다. 낮은 이온 강도의 솔루션, electroformation 방법^15,16 작은 결함^10,17높은 수율에 GUVs를 준비 하는 빠른 방법을 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 지질 층 전도성 표면 (전극)에 입금, 그들, 건조 및 AC 필드를 적용 하는 동안 그들을 용액으로 보습을 기반으로 합니다. 그러나,이 방법은 조정 경우 소금 수성 솔루션^18,19에 존재 하는 필요 합니다. 그것은 electroformation에 의해 소포 성장 위한 원동력 electroosmosis¹⁶ 높은 conductivities²⁰에서 방해는 가정. 따라서, 높은 염 분 해결책에 GUVs의 electroswelling이 아니다 간단 접근 그것은 다른 소금 농도 붓기 솔루션에 대 한 최적화를 요구 한다. 젤 기반 소포^21,22 붓기 더 빨리 형성 시간 electroformation에 잠재적인 대안 이다. 이 이렇게 젤 (agarose 또는 폴 리 비닐 알코올 (PVA))는 기판으로 사용 될 때 향상 된 지질 영화 화에 만듭니다. 그러나 이러한 접근, agarose 기반 붓기²³ / 온도 제한 PVA 기반 붓기의 경우 경우 막 오염의 위험으로 온다. 마찬가지로, GUVs 셀 루 로스 종이 기판에 성장 하는 프로토콜 최근 설립된²⁴되었습니다입니다. 이 방법의 일반적인 문제는 기판 순도 제어의 부족 뿐만 아니라 많은 양의 지질 사용 합니다. 이 작품에서 소개 하 고 우두머리 준비, 즉 자발적인 붓기 방법^25,26에 대 한 가장 전통적인 방법의 장점을 제공 합니다 우리. 그것은 건조-수증기 분위기, 그리고 원하는 붓기 솔루션 이후 붓기에 하이드레이팅 lipophobic 기판에 지질 층의 구성 ( 그림 1 및 프로토콜 섹션에서 세부 정보 참조). 이 방법은 소포 크기 배포 제어를 제공 하지 않습니다와 생산 전기 분야에 의해 원조 된다 하는 방법에 비해 전반적으로 더 작은 소포 폴리머 기판 또는 미세 결과. 그러나, 소포 품질과 크기는 여기 탐험으로 막 단계 상태 검사 적합 합니다.

소포 막에 걸쳐 솔루션 사이의 불균형을 만들기 뿐만 아니라 특정 과제와 연결 됩니다. 일반적으로 사용 되는 한 가지 방법은 원하는 외부 솔루션^27,28기 서 스 펜 션의 직접 희석입니다. 그러나,이 또한 기 분포 밀도를 줄인다. 또 다른 전략 천천히 GUVs 솔루션에 대 한 허용-흐름 셀의 하단에 정착 주위 외부 솔루션을 교환 하는 것입니다 그리고 outflux. 방해 또는 심지어 흐름 소포를 잃고을 피하기 위해, 낮은 흐름 요금은 적용된⁸,이 이렇게 비효율적인 시간을 렌더링 합니다. 또한, 이러한 방법의 전체 외부 솔루션 교환을 보장합니다. 외부 솔루션 교환 하는 동안 그들을 잃고 피하기 위하여 소포를 무력화 하는 확실 한 해결책이입니다. 예를 들어, biotinylated GUVs streptavidin 입히는 표면²⁹에 곁에 있을 수 있습니다. 그러나,이 접근에는 준수 작곡 유사 이어질 수 있습니다 그리고 그러므로 비 준수 막^30,31세그먼트. 자석의 응용 프로그램 또는 전기 분야를 부과 하는 막에 소포 결과 트랩 긴장³². 핸들 하는 데 필요한 함정에 기 하 광학 핀셋 채용 광 들 것을 사용 하 여 지역 난방³³를 포함 수 있습니다 (즉, 구슬), 연결 된. GUVs의 트래핑 최종 분리³⁴없이 백 금 철사에 그들을 성장 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 이것 얇은 지질 관 (밧줄)에 의해 소포는 격리 하 고 철사에 일반적으로 연결 되는 또는 다른 소포를 생성 합니다.

제시 일 상기 한계를 극복 하는 전략을 강조 한다. 우리는 먼저 적응 하 고 높은 염 분 버퍼에서 GUVs의 생산을 위한 최적화 된 자발적인 붓기 방법에 대 한 자세한 설명을 제시. 다음 효율적으로 간단한 희석 또는 미세 소자의 활용에 의해 비대칭 솔루션 상태를 만드는 두 가지 방법을 소개 합니다. 우리의 목표는 다른 솔루션 조건에서 GUVs의 막 단계 상태 분석, 때문에 성공적인 통계 분석에 대 한 기준 및 피 잘못 된 분류를 위한 현재 힌트 후속 섹션에 설명 합니다.

분석은 등온 조건에서 뿐만 아니라 다양 한 온도에서 수행 했다. 동안 온도 control 일반적으로 고용, 실험 온도-제어 약 실에 대 한 정보는 거의 설명. 여기, 다양 한 온도 조건에서 GUVs를 관찰 하는 자체 내장된 설치 제공 됩니다.

프로토콜

1. 자발적인 붓기의 GUVs

참고: 클로 프롬은 높은 휘발성 유해 물질. 증기 두건에서 클로 프롬을 포함 하는 모든 작업을 수행 합니다. 전송 또는 클로 프롬 솔루션의 저장소에 대 한 피 펫 팁 등 플라스틱 용기 플라스틱 실험 기구를 사용 하지 마십시오. 클로 프롬 해결책 오염 플라스틱을 녹는 다. 유리 주사기를 사용 하 고 유리 용기 대신. 또한, 그들은 세포 막과 상호 작용으로 불순물의 소개를 피하기 위해 가능한 깨끗 한 작동 합니다. 그 최종 우두머리 준비에 일반적인 지질 농도 micromolar 범위에 있는, 따라서 불순물 농도 범위에서 막 행동에 강한 효과가지고 있습니다.

1. 기본 장비 외에도 다음 항목 준비 있다.
2. 준비 (PTFE, 테 플 론으로 일반적으로 알려진) polytetrafluorethylene
   크기 ~1.5 cm x 1.5 cm와 적절 한 두께의 지질 증 착에 대 한 접시. 정밀한 사 포로 한쪽에 접시를 거칠게.
   참고: PTFE lipophobic 이며 것입니다 하지 수 젖는 클로 프롬 해결책에 의해 부드럽게 하는 경우. PTFE 접시의 양쪽 지질 증 착에 대 한 올바른 측면에 대 한 혼동을 피하기 위해 roughened 될 수 있습니다. 쉽게 처리, 예: 그것은 너무 유연 하 고 수 화 솔루션으로 쉽게 커버 될 수 있다 판 두께 선택 합니다 ( 그림 1 참조). 여기 ~ 2 m m 두께의 접시를 사용 했습니다. PTFE 판 새로운 실험에 대 한 적절 한 청소 (1.3 단계) 후 다시 사용할 수 있습니다 일단, roughened.
   1. 최종 지질 영화 수 화와 기 성장에 대 한 적절 한 볼륨 (~ 15 mL)의 접착성 유리 유리병을 준비.
   2. 접착성 유리 컨테이너에 ~ 15 mL 유리 유리병에 맞는; 지질 영화 사전 붓기에 대 한 물 포화 분위기를 만들고, 그림 1을 참조 하는 데 사용할 것입니다 준비.
3. 준비 4 m m 1, 2의 원하는 비율에 지질 주식-dioleoyl-sn-glycero-3-인-(1 '-rac-글리세롤) (나트륨 소금) (DOPG), sphingomyelin (eSM), 고 콜레스테롤 (철), 추가 0.1 mol %1, 1 계란 ′-dioctadecyl-3 3, 3 ′ 3, ′-4 m m의 총 지질 농도를 tetramethylindocarbocyanine 과염소산염 (DiIC ₁₈). 클로 프롬을 사용 하 여 용 매로. 자료의 표를 참조 하십시오.
4. 철저 하 게 그 순서로 PTFE 판과 상업 주방용 세제, 에탄올, 클로 프롬과 유리 용기를 헹 구 고 마지막으로 그들을 건조.
5. 유리 주사기를 사용 하 여, 입금 및 유니폼 지질 영화 만드는 PTFE 판의 roughened 측에 지질 재고의 10-15 µ L를 균등 하 게 확산. 주사기 바늘을 사용 하 여 필요한 경우 솔루션을 확산.
6. 깨끗 한 표면에 PTFE 접시 놓고는 클로 프롬을 제거 하려면 60 ℃에서 2 h에 대 한 예금 된 지질 영화 함께. 편의 위해 접시에 입금 청소 하 고 봉인 되지 않은 15 mL 유리 컨테이너 건조 중.
   참고: 높은 온도 균질 단일 액체 상태가 고 모든 후속 단계에서 지질 필름입니다 보장.
7. 건조, 후 채워 미리 붓기 유리 컨테이너 수준 부 력 ~ 15 mL 유리 유리병 (~ 1 cm) 노크, 그림 1 참조를 허용 하지 않는 이온된 수.
8. 넣어 ~ 15 mL 유리 컨테이너에 PTFE 플레이트 유리병 및 물 포화 분위기 나타날 수 있습니다,이 그것을 커버 그림 1B 참조.
   참고: 내부 컨테이너 벽에 집 광 된 물 성공적인 수증기 포화에 대 한 좋은 표시를 제공.
9. 하자 예금 된 지질 영화는 미리 4 h 60 ° C에서 닫힌된 유리 컨테이너 내부 팽창. 이 기간 내 원하는 붓기 솔루션 준비.
   참고: 낮은 온도에서 실시 될 수 있는 기 준비를 위한이 시간 단축 될 수 있다 매우--몇 분까지 따뜻한 물 포화 질소 또는 아르곤 사전 붓기에 대 한 사용 하는 경우 대신.
   1. 준비 200mm 자당 또는 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5와 HCl 60 ° C에 열 붓기 솔루션으로 만들기 위해 조정.
10. 사전 붓기 후 컨테이너에서 PTFE 플레이트 ~ 15 mL 유리를 가져가 라. 0.45 μ m 필터에 연결 된 주사기, 지질 영화 화에 15 mL 유리 유리병에 붓기 솔루션의 ~ 5 mL을 추가.
    참고: 붓기 솔루션의 삽입 용이 필터에 바늘을 고정. 주사기와 필터를 미리 온난화 붓기 솔루션을 추가 하는 동안 지질 영화의 단일 액체 단계 상태를 확인 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다. (-) 박테리아 또는 소금 촉진 등의 유기 오염 최소화 솔루션 필터링
11. 증발을 최소화 하기 위해 PTFE 접시에 수산화 지질 필름을 들고 ~ 15 mL 유리 유리병 밀봉. 필요한 경우, 파라핀 영화를 사용 하 여 향상 씰링. 밤새 붓기 최종 우두머리에 대 한 수산화 지질 영화 60 ° C에 두고.

2. GUVs 수확

참고: GUVs 고 눈으로 보이는 작은 (~ 1 m m) 구름 처럼 덩어리에 PTFE 기판 결과에서 분리의 집계. 아무 형광 염료를 사용 하는 경우에 약간 흰 나타납니다. 그렇지 않으면, 그것 fluorophore 흡수 스펙트럼에 따라 채색 된다. 또한 DiIC ₁₈ 렌더링 구름 핑크 ( 그림 2 참조). 소포 집중 집계 되며 소포 수익률 극대화 그것을 수확 하는 것.

클러스터에 대 한 피스톤 피펫은 플라스틱 팁의 뾰족한 끝 또는 구멍을 통해 맞게 vesicles의 집계의

~ 1 헤 컷 내 실내 온도에 소포 아래로
1. 멋진 ~1/10.
   참고: 냉각 속도가 고체 도메인의 크기 변경으로 고체-액체 상 분리 경우에 특히 중요 하다. 여기, 냉각 천천히, 우리는 금속 블록 크기 5 c m x 9.5 c m x 7.5의 접촉 샘플 배치 cm (H L x W x)는 1 헤 내 실내 온도에 냉각
2. 피 펫을 붓기 솔루션의 적절 한 볼륨 함께 클러스터 ( 그림 2 참조). 다시 대칭 솔루션 조건을 만들려고 붓기 솔루션에서 집계를 일시 중단 하거나 어떤 원하는 만들 비대칭 솔루션 조건 iso 삼투성 해결책.
   참고: 볼륨의 하한값을 완전히 수확 집계의 크기에 의해 제한 됩니다. 외부 솔루션을 희석 하 고 정확한 농도 평가, 소포 솔루션의 볼륨 고려해 있다.

3. 위상 상태 평가 사용 하 여 형광 현미경 검사 법에 대 한 GUVs의 관측

참고: The GUVs 형광 표식으로 DiIC ₁₈로 첨가 했다. 이 fluorophore는 우선적으로 액체 무질서 (Ld) 단계로 파티션을. 이 GUVs에 단계 별거에서 유래 하는 도메인의 형광 현미경 관찰에 대 한 수 있습니다. 우리는 피 형광 현미경과 위상 상태 평가 수행합니다. 원칙적으로, 이러한 관측 가능한 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM)는 또한 신호 정량화 (예: 막 unilamellarity 결정)를 사용 하 여 있습니다. 그러나, CLSM 더 정교한 장비가 필요 합니다 그리고 (일반적으로) 스캔 하기 전에 피 형광 관찰 도움이 여하튼.

1. 관찰 하는 GUVs 고 다른 솔루션에는 동일한 구성의 위상 상태를 비교할 때 그것을 일관 되 게 사용 목적 (예: 40 X 확대 0.6 수 가늠 구멍 (NA)와 여기에 사용)에 결정n 조건입니다. 적절 한 여기 및 방출 파장 필터를 사용 하 여 형광 관찰 fluorophore 사용 (예: 560 ± 40 nm 및 DiIC ₁₈에 대 한 사용 사이는 585 nm 빔 스플리터 630 ± 75 nm에서 여기)와 함께 사용.
   참고: 단계 상태 경계 단계 다이어그램 내에서 목표 달성으로 마이크로-도메인 검색의 최소한의 크기를 정의 하는 해상도에 따라 달라 집니다.
2. 분석, 선택만 다음 품질 기준 충족 GUVs.
   1. 다른 소포의 시각적 관찰에 의해 우두머리 막의 unilamellarity를 확인 하 고 그들의 농도 비교; 낮은 형광 방출 강도 가진 소포는 가장 가능성이 unilamellar.
      참고: 자발적인 붓기 하지 unilamellar의 거 대 한 소포의 큰 분수는 기 배치를 얻을 수 있습니다.
   2. 아마 unilamellar 거 대 한 소포의 형광 방출 강도 측정 하 여 추가로 검사를 수행 하 고 인구 내의 산란에 대 한 해당 신호를 확인. 경우 다른 GUVs 사이 정수 차이가 관찰 된다, 그들 모두는 unilamellar 될 것.
      참고: 경우 소포 자발적인 붓기, 위에서 설명한 접근 등 설립된 메서드를 사용 하 여 기존의 지질에서 준비가 unilamellar vesicles의 검출은 충분 합니다. 만약 새로운 우두머리 준비 프로토콜을 설정 또는 개성 있는 지질을 사용 하 여, 더 상세한 연구 해야 할 것입니다 unilamellarity를 확인. 예를 들어, 이라는 소포는 새로운 프로토콜에 의해 준비의 막 형광 신호 GUVs 설립 방법; 준비의 그들에 비교 될 수 있었다 또는 막 공 단백질 α-hemolysin 소포 막 ²⁴에 삽입할 수 있습니다. 추가 하는 염료는 소포의 외부에 다음 입력 그들의 내부, uni-또는 multilamellar 소포의 존재에 따라 각각.
   3. 우두머리 여전히 인식할 수 있는 도메인에 대 한 합리적인 최소 직경을가지고 있는지 확인 하십시오.
   4. 우두머리 튀어나온 또는 준수 부품 등 내부 구조 (거의) 아무 결함이 있는지 확인 하십시오.
3. 현미경 슬라이드에 우두머리 서 스 펜 션의 약 수를 전송 하 고 그것을 제대로 밀봉. 관측 실 준비.
4. 는 현미경 슬라이드에 샘플 입금. 중앙 원형 컷아웃와 실리콘 스페이서에 의해 그것을 포위 하 라. 오염을 방지 하는 스페이서 샘플 접촉 하지 인지 확인 합니다. 실리콘 스페이서 위에 커버 슬립을 배치 하 여 내부 인감.
   참고: 실리콘 대신 공백 하나 실리콘 기름 또는 수 제 polydimethysiloxane (PDMS) 스페이서 사용할 수 있습니다. 샘플의 최소 증발을 보장 하 고 iso osmolar 조건 유지 챔버 씰링.
5. 두고 ~ 5 분 가능한 도메인의 재 평형에 대 한 샘플.
   참고: pipetting에서 기계적 스트레스 개혁에 시간이 필요 막 도메인 혼합 수 있습니다.
6. 현미경 단계에 샘플 현미경 슬라이드 놓고 통계 접근에는 우두머리의 위상 상태를 분석 합니다. 배치 당 이상의 30 GUVs를 관찰 하 고 그들의 위상 상태 DiIC ₁₈ ( 그림 3)와 우두머리 위상 상태 평가 대 한 다음과 같은 기준에 따라 결정.
   주: 그들의 성장 후 소포는 도메인에서 신진 또는 나노튜브를 통해 막 재료의 교환 (예) 자신의 개별 구성 변경할 수 있습니다. GUVs는 따라서 ³⁵ 동일한 일괄 처리 내에서 구성 변화를 전시 한다.
   1. 단일 액체 단계 중 액체-주문 (Lo) 되 고 또는 액체 무질서 (Ld): 전체 우두머리 모양 구형 이며 부드러운 고 DiIC ₁₈ 균질 막 배포 됩니다 (처음에 위쪽 및 아래쪽 패널에 이미지 < 강력한 클래스 "xfig" = > 그림 3).
   2. 2 단계 Lo + Ld 공존 상태:는 소포 부드러운 경계와 원형 표시 되는 도메인을 전시 하는 확인 하십시오; 동작 분할 DiIC ₁₈에 따라 도메인은 밝은 빨강 (Ld) 또는 어두운 레드/블랙 (Lo) (상단에 이미지를 두 번째 및 하단 패널 그림 3 거짓 색상에서). 도메인 소포 표면에 확산 무료 이며 합체 수 확인 하십시오.
   3. 2 단계 고체 (S) + 액체 (S + Lo 또는 S + Ld) 공존 상태: 확인 도메인 손가락 같은 또는 둥 하지만 각도 경계와 함께 나타날 수 있습니다 ( 그림 3의 위쪽 및 아래쪽 패널에 세 번째 이미지). (빨간색) 보급을 표시 되지 것입니다 고체 (검정) 배경에 액체 도메인을 관찰 합니다. 반대로, 솔리드 (블랙) 도메인을 무료로 됩니다 액체 배경 (레드)에 확산.
   4. 3 상 S + Lo + Ld 공존: 관찰 나타나는 도메인의 세 가지 유형: (i) 각 검은 도메인 (들), (ii) (Lo)과 (3) 밝은 (Ld)에 빨간 도메인 포함.
7. 단계 상태에 다음 예제와 같이 무작위 샘플 중 지배적인 것으로 확인 되어 GUVs의 인구를 돌리다:
   1. 단일 액체 GUVs 및 15 Lo + Ld GUVs, 관찰 하는 경우 20 고려 될 일괄 처리는 단일-액체 단계.
   2. 경우 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs, 및 25 단일 액체 GUVs는 관찰, Lo + Ld. 수를 배치 고려

4. 미세 소자에서 우두머리 관찰

참고: 먼저 미세 장치 조작; 미세 장치 설계 및 어셈블리의 세부 사항을 주어진 다른 ^{36 , 37}. 에 대 한 간단한 설명은 그림 4를 참조 하십시오.

1. 신선한 우두머리 붓기 (소금 또는 단계 1.8.1 따라 자당) 솔루션을 준비 하 고 0.45 μ m 필터를 통해 필터링.
   참고: 흐르는 솔루션에 어떤 불순물 미세 장치를 방해할 수 있습니다.
2. 잘라 200 µ L 피스톤 플라스틱 플라스틱 팁 및 PDMS 장치 부분의 구멍에 그들을 배치. 100 µ L와 신선 하 고 필터링 된 저수지에 솔루션을 붓는의 5 µ L 추가 (참조 그림 5A)와 각 컷의 플라스틱 팁, 각각. 전체 장치 900 x g에 미리 장치를 공기를 제거 하는 스윙으로 터 원심 분리기에서 10 분 원심.
3. 미리 1 mL 유리 주사기와 튜브 붓기 솔루션과 연결 된를 0 mL 플런저 위치 이동.
4. 장치의 유체 출구로 튜브를 배치 하 고 주사기 주사기 펌프.
   참고: 주사기 주사기 펌프 브랜드의 선택 중요 하지 않습니다. 그러나, 유리 주사기는 더 정확 하 고 펌프 µ L/min 유량 범위에서 작동할 수 있어야 합니다.
5. 연결 8 후미의 미세 제어를 사용자 정의 압력 제어 장치 계층 (참조 그림 5A). (공기, 질소 또는 아르곤), 바 3 압력 제어 장치에 압력을 설정 하지만 닫힌된 위치를 미세 장치 밸브 설정.
6. 장소 이제는 거꾸로 confocal 현미경 단계에 주사기 펌프 및 압력 제어 장치에 연결 된 미세 장치.
   1. 사용 같은 목표를 확대 하 고 대량 관찰 중으로 나. 또 다른 목적은 서로 다른 해상도 기반으로 관찰 아티팩트를 피하기 위해 사용 하는 경우 위상 상태 통계 단계 3.7에서에서 설명한 대로 동일 하 게 유지 하는 경우 제어.
7. 장치에 로드 하는 GUVs.
   1. 첫 번째, 피 펫 멀리 저수지에 남아 있다 솔루션의 25 ~ 50 µ L 제외한 모든. 우두머리 솔루션의 150 µ L을 추가 (자당 또는 단계 1.8.1에 따라 소금, 그러나 일치 하는 단계 4.1에서에서 장치를 미리 채우는 데 사용 하는 솔루션) 저수지와 부드러운 pipetting으로 혼합. 10 µ L/min 흐름 속도를 주사기 모드 약 20 분에 대 한 철회 또는 트랩의 90%를 점령 때까지 더 이상 설정.
      참고: 저수지 건조 실행을 허용 해야 하지. 이 경우 기포는 마이크로 채널을 입력 합니다. reservoi에 더 많은 우두머리 솔루션 추가하지만 r 로드 하는 동안 장치에 pipetting 때 공기 방울을 소개을 않도록 주의.
8. 트랩/GUVs 주위 미세 링 밸브를 닫고 압력 제어 장치 밸브의 모든 열. 주사기 펌프 0 µ L/min으로 설정 합니다. 1 시간 후 GUVs 및 기록 confocal 이미지를 준수 합니다. 자극 하 고 fluorophore 사용 (예: 561 및 탐지 DiIC ₁₈에 관해서는 580-620 nm 사이 흥분)에 따라 GUVs를 감지. 단계 3.6 ,에서 같은 선택 조건을 사용 하 고 (즉, 열과 행 번호, 그림 4 참조) 각 우두머리의 위치를 참고 하
9. 교환 솔루션 는 GUVs를 둘러싼 .
   1. 주사기 펌프 0 µ L/min으로 설정 하 고 저수지에서 우두머리 솔루션의 모든 하지만 25 ~ 50 µ L 플라스틱. 부드러운 pipetting으로 150 µ L 2 솔루션 (또는 자당은 GUVs 밖에 서 원하는 솔루션에 따라 1.8.1, 단계에 따라 소금)의 저수지와 믹스를 추가 합니다. 저수지에서 버퍼 솔루션의 모든 하지만 25 ~ 50 µ L 플라스틱.
      참고:이 솔루션은 너무 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.
10. 철저 하 게 저수지에 솔루션 대체를 5 번 이상 이전 단계를 반복. 10 µ L/min 흐름 속도에 주사기를 설정에서 철수 ~ 10 분 마이크로 채널에 솔루션 대체 모드.
11. 감소 1 µ L/분에 유량 8 압력 제어 장치 밸브 2 s 및 다시 닫기 (미세 링 밸브의 개폐 인)를 엽니다. 다시 0 µ L/min 흐름 속도 설정.
12. 후 1 h, GUVs 기록 confocal 이미지 관찰. 다시, 열 및 행 각 우두머리가 전과 외부 버퍼 교환 후 같은 우두머리의 비교 있도록 위치한 마이크로 챔버의 돌.

5. 디자인 및 온도-제어 약 실의 교정

참고: 온도 제어를 위한 적합 한 약 실 수 상업적으로 취득 하거나 집에서 만든. 온도 제어의 물 목욕 또는 Peltier 요소 우두머리 샘플 챔버 열 커플링에 의해 일반적으로 달성 된다. 여기, 우리 디자인 그리고 가정 건축 온도-제어 챔버 외부 물 온도와 운영의 특성을 설명 합니다. 이러한 온도 많은 실험실에서 사용할 수 있습니다 또는 레이저 또는 분석기 등 오래 된 장비에서 구출 될 수 있다.

1. 어셈블 여기, 열 흐름 챔버가 했다 밖으로 물 욕조에 커넥터와 알루미늄 블록의 그림 6과 같이. 상단 및 하단 구멍을 밀봉 하 고 블록을 커버 유리를 접착 하 여 샘플의 밝은 분야 관측을 사용.
2. 샘플 배치 됩니다 단계 1.8.1에 따르면 실험에 사용 되는 솔루션의 약 100 µ L의 작은 물방울을 플라스틱 측면에 흐름 챔버 플립. 필요한 경우 (예: FISO FTI 10) 섬유 광섬유 온도 프로브를 삽입 하거나 적절 한 농도, 예를 들어 500 µ M Rhodamine b. 온도 민감한 염료를 추가
3. 는 우두머리 관찰 챔버 링 모양 또는 일부 다른 스페이서 (PTFE 또는 고무)에 실리콘 그리스를 사용 하 여 조립 하 고 0.17 µ m 커버 유리 그것을 봉인. 확인 하십시오 드롭 씰링 에이전트 또는 스페이서는 불순물의 소개를 피하기 위해 접촉.
4. 천천히 어셈블리를 뒤집어 하 고 그것에 적합 한 배관 외부 물 온도 연결 합니다. 어떤 물 누출 든 지에 특별 한 주의.
5. 세트 최저 원하는 외부 물 온도에 온도 및 온도 센서의 판독값 안정 될 때까지 equilibrate 시스템; 평형에 필요한 시간 시스템의 최소한의 응답 시간의 견적을 줄 것 이다.
6. 제어 실험을 수행 하는 챔버를 사용 하 여 시작 하기 전에 적어도 한 번.
   1. 솔루션 온도 (예: 유리 섬유 프로브)을 측정 하 고 관심의 온도 범위에서 온도 읽기 비교.
   2. 온도 읽기 및 측정된 온도의 선형성에서 최소한의 오프셋에 대 한 확인.
   3. 온도 중요 한 염료를 사용 하 여 관찰 챔버 내부 온도 기울기를 확인 합니다. 형광 강도 또는 형광 일생 하단 커버 슬립 ⁴⁰에서 다른 거리에 대 한 현미경 검사 법 (FLIM) 이미징 솔루션 온도 측정 합니다. 또한 확인 우두머리 관찰의 지역에서 어떤 온도 기울기는 경우 그림 7 에서처럼.

6. 다양 한 온도에서 우두머리 관측

참고: 일반적으로, GUVs에 대 한 그 막 잠재적으로 단계 분리 관찰 온도 T _obs에서 동질적인 것 나타나는, 단계 분리 될 것입니다 T _obs 아래 유도 (조사 온도 범위에 따라 그 관찰 여부). 반대로, 단계 구분 된 소포 T _obs 보다 높은 온도에서 균일 해야한다. 그러나,이 특정 (복잡 한) 지질 구성에 대 한 경우가 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 항상 전체 액세스할 수 있는 온도 범위 ³⁸ 스캔 재미 있을 수도 있습니다. 관찰 및 평가 단계 전환 온도 대 한 프로토콜 온도 제어에 사용 되는 특정 방법에 의존 하지 않습니다.

1. 섹션 5, 섬유 광섬유 온도 프로브 또는 온도 민감한 fluorophore 따라 온도 관측 챔버 조립.
2. 실 온 (23 ° C) 외부 물 목욕을 설정 하 고 10-15 분에 대 한 equilibrate 시스템
3. 계산 단계 3.6에서에서 기준을 사용 하 여 단계 구분 된 소포 수, 전체 단계 우두머리 인구의 상태는 시스템의 전환 온도 영역에 대 한 힌트를 줄 것 이다. 소포 인구에서 위상 상태는 오히려 이기종 직접 단계로 이동 6.5.
4. (해당 되는 경우 소포의 대부분은 단계 구분) 늘리거나 (소포의 대부분은 균질 성) 하는 경우는 굵은 간격 (예: 1-2 ° C)에 온도 고 시스템 equilibrate 위한 약 2 분에 대 한 재평가의 위상 상태 하 여 우두머리 인구 의미는 무작위의 샘플 소포 인구는 다른 유형의 단계 상태 표시 될 때까지 온도 다.
5. 인구 상전이 점 근처 되 면 (즉 단계 개별 GUVs 중 상태 오히려 이종은), 해상도 증가 (예: 0.5 ° C) 온도 간격을 감소. ~ 2 분에 대 한 equilibrate 및 무작위 샘플링을 통해 우두머리 인구의 위상 상태 재평가 시스템.
6. 상전이의 포인트는 통과 되 면, 계속 변화 온도 모든 GUVs 지금 동종 또는 단계 구분, 각각.
7. 평형 시간 충분 한 인지를 평가 하는 히스테리시스 확인.
   1. 변화 온도의 방향으로 스캔, 나.e. 스캔은 온도 증가 대 한 경우, 온도 감소 하 여 스캔을 할.
   2. 적어도 우두머리 인구 단계 상태 비율 (예: 구분 하는 단계는 80%)을 평가 하기 위해 온도의 하위 집합을 선택 하십시오.
   3. 경우 위상 상태 비율에 양방향 사이 상당한 편차 히스테리시스, 온도 단계 크기 줄이거나 단계 6.4 및 6.5에서에서 평형 시간 증가.
   4. 이력이 없음을 동등한 비율에 의해 표시 된 있는 경우에, 단계 크기 및 평형 시간을 늘리는 것이 좋습니다.
8. 줄거리는 온도 대 한 위상 상태 비율. 정량화를 위해 맞는 적절 한 모델 ( 그림 8) 데이터.
   참고: 단계 전환 곡선 일반적으로 자형 궤적 및 자형 볼츠만 모델 피팅 매개 변수를 적절 한 집합을 제공 합니다:
   
   y: 유니폼/단계 구분 된 GUVs의 분수
   ₁: 초기 분수 값
   ₂: 최종 분수 값
   T: 온도
   T _혼합: 반 최대한 y에서 온도
   Y 동질적인 GUVs의 일부분으로, A ₁과 A ₂ 고정 되어야 한다 0 및 1, 각각. 혼으로 전환 자형, 분수 값 0 아래 온도 범위에서의 모든 분수 값 0으로 간주 됩니다 특정 온도에서 측정 한 것으로 간주 됩니다. 반대로, 분수 값은 특정 온도에서 1, 일단 위의 온도 범위에서의 모든 분수 값 간주 됩니다 1.

결과

우두머리 붓기

여기에 설명 된 자발적인 붓기 방식으로 GUVs DOPG, eSM의 구성 하 고 철 하룻밤 210mm 자당 또는 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 형성 볼 수 집계에서에서 성장 했다. 집계를 수확 높은 소포 수익률 보장 합니다. 붓기 솔루션에 물의 resuspension 대칭 횡단 막 솔루션 조건 귀착되는. 비대칭 상태를 만들려면 집계 각각 iso-osmolar 자당 또는 높은 염 분 해결책에 resuspended 이었다 (그림 2). 결과 희석 GUVs의 수의 희석을 최소화 하면서 즉 외부 솔루션 exchange에 해당 합니다.

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 GUVs의 단계 다이어그램 매핑

GUVs에서 공정 별 DiIC₁₈ 의 0.1 mol %의 존재의 넓은 필드 형광 현미경 검사 법을 통해 그들의 위상 상태 관찰에 대 한 허용. S + L 단계 분리를 전시 하는 소포 63 x 통해 관찰 되었다/정밀 하 게 해결 수 1.2NA 손가락 같은 도메인 구조. 모든 경우에, 40 x / 0.6 남은 나 목표 사용 되었다. GUVs의 시각적 검사 중 아티팩트를 방지 하 고 재현성을 최대화 하기 위해 특정 조건을 설정 단계 상태 분석 (프로토콜 단계 3.6)에 대 한 고려 하는 소포를 결정.

GUVs 비율 자당 또는 높은 염 분 해결책에 고 실 온에서의 광범위 한 범위의 삼항 DOPG/eSM/철 혼합물에서 준비 동질적인 Lo 또는 Ld 단계, Lo + Ld, S + L 단계 분리 전시 그림 3을 참조 하십시오. 그림 9 데이터 분석에 포함 되지 않을 exemplarily 결함이 소포를 표시 하 고 multilamellar 소포를 식별 하는 방법을 보여 줍니다.

그들의 알 수 없는 역사로 인해 GUVs 일괄 처리 내에서 작곡 변형³⁵전시 높습니다. 따라서, 특정 구성의 전반적인 위상 상태 통계 방법에서 결정 되었다. 특정 지질 구성의 우두머리 인구 무작위 샘플 (프로토콜 단계 3.6)에 지배 되 고 관찰 되었다 단계 상태를 관찰 했다. 그러나, Lo + Ld 공존 지역 가까이 작곡 종종 지배적인 위상 상태 좁은 대다수를 구성 하는 배치 나왔고. 이러한 막연 한 경우에 대 한 육안 검사는 적어도 3 개의 독립적인 샘플 반복 되었다. 동일한 단계 상태 (예: 전시 Lo + Ld 단계 분리) 임의 샘플 내의 소포의 분수는 최종 결과 (그림 10)으로 찍은 재판의 수 평균 했다.

높은 염 분 및 자당 솔루션 DOPG, eSM, 그리고 철의 다른 비율의 광범위 한 범위에 충분 한 우두머리 성장 귀착되 설명된 프로토콜. 삼항 단계 다이어그램 내에서 광범위 한 지역 (그림 11) 대칭으로 비대칭 높은 염 분 솔루션 조건 매핑될 수 합니다. 다른 솔루션 조건 하에서 관찰 하는 소포 단계 동작에 차이 세부⁹다른 곳에서 토론 되었다.

미세 메서드를 사용 하 여 완전 한 버퍼 교환 후 단계 행동의 관찰

밖에 서 붓기 솔루션의 잔류물에 희석 결과 비대칭 솔루션 조건의 창조. 우리의 미세 접근 완전 한 외부 솔루션 교환 할 수 있습니다. 그림 5A 는 유체 출구와 압력 제어 후미 confocal 현미경 스테이지에 완벽 하 게 조립 미세 장치를 보여 줍니다. 튜브 위에서 빛 영상 전송에 대 한 공간을 허용 하도록 90 ° 금속 파이프를 통해 연결 됩니다.

미세 소자 내에서 관찰, 63 x confocal 현미경 / 1.2NA 물 침수 렌즈 구현 되었습니다. 일괄에서 이전 관측, 것과 같이 DiIC₁₈ 막 얼룩에 사용 되었다. 장치에 갇혀 있는 GUVs의 상태 단계의 관측 때, 해야 합니다 주의 데이터를 잘못 해석할 수 없습니다. 게시물에는 GUVs의 가까운 근접, 때문 여기 및 방출 빛 경로 도메인 (그림 12)의 잘못 된 모습을 선도 하는 PDMS에 의해 부분적으로 차단 될 수 있습니다. 여기, 전송된 빛 감지 게시물에서 GUVs의 위치를 확인 하려면 유용 합니다. 이 원치 않는 효과 직경에서 10 μ m의 작은 GUVs에 대 한 특히 저명한. 이러한 경우에 데이터는 거부 했다. 그림 13A confocal 이미지 우두머리 소포에 있는 Lo 도메인을 교차 하는 평면 기 섹션을 보여 줍니다. 이 경우에, 평면 횡단면 검사 추가 위 또는 아래 섹션 것 이다 하지 보여주 있다 도메인에 비해 작은 크기로 인해 이며 왜 그것은 왔다 놓친 것은 소포 우두머리의 균질 단계 상태에 것으로 간주 됩니다. 따라서, confocal z-스택 전체 우두머리 표면 검사에 사용 되어야 한다. 넓은 필드 현미경 검사 법에 대 한이 되지 않을 수도 문제 때문에 전체 소포 한 번에 몇 군데 있습니다.

마지막으로, 예제 받는다 GUVs의 외부 솔루션의 교환 전후 어디 그것은 분명 어떤 위상 막의 상태는 (그림 14). 각 장치는 (각각 단일 우두머리 함정 게시물의 쌍), 60 실 실험 장치 당 수만 허용 ( 그림 4참조). 그러나, 일부 GUVs 외부 솔루션 교환을 하는 동안 손실 된 얻을 수 있습니다. 이 다음 단계에 의해 극소화 될 수 있다: 1);에서 우두머리 접착/파열을 방지 하기 위해 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 코팅을 사용 하 여 코팅은 60 분 및 후속 작업 버퍼와 rinsing 20 mg/ml BSA 챔버 벽을 노출 하면 됩니다. 사용할 수 있는 또 다른 접착 분자 poly(L-lysine)-이식-poly(ethylene glycol)³⁹이다. 2) 주의 삼 투 일치 하는 게시물의 센터를 통해 전달할 수 있는 이완 된 GUVs을 피하기 위해 내부 및 외부 솔루션 또는 GUVs의 파열. 3) 최적화는 게시물의 센터를 통해 통행을 방지 하기 위해 직경에서 ~ 8 µ m 보다 더 큰 소포를 우두머리 준비 절차.

디자인 및 우두머리의 관찰에 대 한 챔버 온도 제어의 특성 상 상태

우리는 간단한 흐름 챔버 외부 물 온도 (그림 6)에 대 한 연결 기능을 설계 되었습니다. 우리는알루미늄 블록의 밀링 하 여 약 실입니다. 일반적으로 챔버 자료 열 전도성, 샘플은 그림 6B와 6 C에서 같이 낮은 커버 유리에 의해 물 욕조에 결합 될 필요가 없습니다.

정확한 디자인은 별도로 챔버의 성능 평가 되어야 한다. 특히 우리는 외부에서 설정 온도, 체계적인 온도 오프셋, 챔버 내에 온도 기울기와 샘플 온도의 선형성에 대 한 확인합니다. 처음 두 포인트 (예: FISO FTI 10) 섬유 광섬유 온도 프로브에 의해 챔버 내에 직접 온도 측정으로 제시 되었다. 우리는 또한 우두머리 서 스 펜 션 내에서 온도 기울기에 대 한 확인합니다. 이러한 그라데이션 챔버 외부에 열 흐름에서 줄기 수 있습니다. 공간적 해결된 온도 측정 온도 민감한 fluorophore⁴⁰에 의해 얻어질 수 있다 그림 7을 참조 하십시오.

데이터 플로팅 및 T단계 구분 된 GUVs의_믹스 를 피팅

Sigmoidally 모양의 데이터 포인트 궤적 결과 관찰 된 온도 범위 동질적인 GUVs의 분수를 플롯. 우리는_믹스 T수 추론된 (그림 8볼츠만 모델 (프로토콜 섹션 6.8)를 데이터에 맞게).

그림 1: 중 기 성장 (하단 패널)의 해당 단계와 자발적인 붓기 프로토콜 (맨 위 패널) 실험 단계. (A) A 균질 성 지질 영화 roughened PTFE 접시에 확산 및 어떤 용 매에서 건조. (B) 말린된 지질 영화는 물 포화 분위기 bilayer 수 화를 촉진 하기 위하여 물과 닫힌된 컨테이너 내에 미리 부 어 다음. Void 유리 유리병 PTFE 플레이트를 포함 하 고이 수 화 단계 동안 열려. (C) 사전 부 지질 영화 마지막으로 유리 유리병 안에 지질 코팅 PTFE 접시에 원하는 붓기 솔루션의 추가 의해 하이드레이션 완벽 하 게 된다. 증발을 피하기 위해, 유리 유리병 하룻밤 인큐베이션 기간 동안 제대로 밀봉 된다. 일괄 처리 내에서 구성 변화를 최소화 하기 위해 모든 단계 지질 혼합물 완전히 혼합할 수 있는 온도에서 수행 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 수확 우두머리. (A) A 입금 지질 필름 0.1 mol % DiIC₁₈ 은 높은 염 분 버퍼에 부 어 20/60/20의 어 금 니 비율에서 DOPG/eSM/철 구성 된 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5로 구성. 유리 컨테이너의 뚜껑은 또한 파라핀 필름으로 밀봉 됩니다. 관심의 확대 지역 결과 우두머리 집계를 포함 되어 있습니다. 그것의 빨간 외관 DiIC₁₈의 존재의 결과 이다. (B)는 GUVs 잘린된 피 펫 팁을 수확 했다. 이 이미지에서 집계 되었다 pipetted를 솔루션, 붓기의 50 µ L 함께 있는 신선한 유리병으로 옮겨 졌다. 만들 비대칭 횡단 막 솔루션 조건, (C) 집계 다른 isotonic 외부 솔루션에 희석 되었다. 여기, 50 함께 집계 µ L 솔루션 붓기 붓기 솔루션의 20 배 희석의 결과로 950 µ L 자당 솔루션에 resuspended 이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 이미징 우두머리. GUVs 0.1 mol % DiIC₁₈ 준비 및 대칭 소금 또는 자당 솔루션 DOPG, eSM, 그리고 철의 다른 비율의 구성에서 실수로의 형광 이미지를 넓은 필드 (왼쪽에서 오른쪽 소금 버퍼에서: 40/20/40; 50/20/30 30/60/10;에 자당, 왼쪽에서 오른쪽: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). 이미지 묘사 프로토콜 단계 3.6에서에서 기준에 따라 평가 하는 다른 (공존) 단계 상태에서 GUVs. 여기, 소포 했다 40 X / 0.6 통해 몇 군데 나 목표. 스케일 바 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 미세 채널 디자인의 레이아웃. GUVs 아래 저수지 입구를 통해 낮은 유체 층 (개설한 채널)을 입력합니다. 필터는 장치에서 원치 않는 파편을 차단합니다. 그들은 다음 입력 60 실 (8 행과 15 열)의 배열을 각 포함 게시물 단일 우두머리 캡처에 대 한 (참조 삽입). 각 챔버 유체 레이어 위에 컨트롤 레이어 (채워진된 검은 채널)에 의해 작동 하는 링 밸브 내에서 격리 된 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 미세 장치. (A) 단일 GUVs 함정 외부 솔루션을 완벽 하 게 교환 하는 데 사용 하는 미세 장치의 사진. 레이블 추가 솔루션 (1), 압력 후미 x 8을 저수지에는 압력 제어 장치 (2), 연결 및 유체 출구 주사기 펌프 (3)에 연결을 나타냅니다. 패널 (B) 각 1 통을 규제 미세 장치에 연결 된 8 밸브를 갖춘 압력 제어 장치를 보여줍니다. 여기 # 1과 #2 밸브는 열려 있고 따라서 해당 링 밸브 폐쇄 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 온도 제어 챔버. (A) 챔버전에 어셈블리입니다. (B) 2 m m 커버 유리 상단과 하단에 붙어 함께 모여 챔버 (위쪽으로 향하게). 주황색 고무 스페이서 높이 0.5 m m를 측정 하 고 동봉 된 우두머리 서 스 펜 션의 관측 0.17 m m 커버 슬립으로 밀봉 된다. 이 이미지에서 온도 프로브 교정 목적 (갈색 섬유 챔버 오른쪽에 종료)에 삽입 됩니다. (C) 온도 프로브 없이 거꾸로 한 현미경의 스테이지의 최종 조립. 주황색 고무 스페이서가 아래쪽에 직면 하고있다. 고무 접착제 충분히 샘플 장소에서 개최 하는. 참고 빛 모두 피 형광 및 밝은 분야 관측 샘플을 통해 전송 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7: 관찰 챔버 내부 공간 해결된 온도 데이터는 온도 민감한 염료의 FLIM 측정 하 여 얻은 (여기: 500 µ M Rhodamine B) ⁴⁰. 데이터 포인트 0, 10, 30, 300, 및 하단 커버 슬립 위에 400 µ m에서 얻은. 빨간색과 파란색 데이터 포인트는 30 ° C에 12 ° C, 각각 설정 물 목욕의 온도 측정 되었다. 검은 데이터 요소 물 목욕 왼쪽을 실내 온도에 equilibrate를 나타냅니다. 챔버를 통해 작은 온도 변화 관찰 했지만 0.5 ° c (회색 막대) 체재. 총 챔버 높이 스페이서 두께 (위 참조)에 따르면 약 500 µ m 이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 8: 혼 온도 찾기. 그래프 표시 균질 (단일-액체 상태)의 개별 데이터 요소 GUVs 0.1 mol %3 개의 독립적인 무작위 샘플에서 DiIC₁₈ 첨가 비율 30/40/30 DOPG/eSM/철에서 준비의 분수 (N = 20-40). 오차 막대는 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 데이터 포인트는 볼츠만 모델에 6.8 (연속 검은 선)는 추론 했다는 도메인 혼합 온도 T_혼합 단계에서 설명한 (abscissa에 따라 빨간색 연속 라인)는 자형의 절반 최대에 따라 장착 했다 (검은색 파선) 누진에 곡선. 초기 값과 최종 값 (₁ 및₂)은 각각 0과 1을 고정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 9: 결함이 있는 소포. 거 대 한 소포의 예 20/60/20 DOPG/eSM/철에서 준비 하 고 기준에 부합 하지 않는 DiIC₁₈ 단계 4.2 넓은 필드 형광 현미경 검사 법에 의해 몇 군데에서 설정 0.1 mol % 첨가. 개별 이미지의 강도 표시 범위 묘사 기의 형광 강도 때마다 최적화 했다. 추가 막 소재 및 캡슐화 된 작은 소포의 존재로 인해 (A) 기의 위상 상태는 명확 하 게 정의할 수 없습니다. 이 거 대 한 기의 외관 lamellarity에 대 한 어떤 신뢰할 수 있는 시각적 검사에 대 한 허용 하지 않습니다. 패널 (B)의 내부는 멤브레인 소재 군집 기를 묘사 한다. 결과적으로, 외부 소포 막의 형광 신호는 내부 신호, lamellarity 및 잠재적인 도메인의 시각화를 렌더링 불가능으로 포개져 나타납니다. (C) 3 개의 다른 거 대 한 소포의 형광 강도 동일한 디스플레이 강도 범위 내에서 직접 비교에 표시 됩니다. 이 이미지는 거 대 한 multilamellar 소포 (1, 2) (3) 우두머리에 비해 그들의 증가 형광 신호에 의해 확인 될 수 있다 보여줍니다. 여기, multilamellar 뿐만 아니라 unilamellar 거 대 한 소포 전시 Lo + Ld 단계 분리. 모든 이미지에 소포 했다 40 x / 0.6 통해 몇 군데 나 목표. 스케일 바 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 10: Lo + Ld 위상의 분리 된 적어도 3 개의 독립적인 샘플 평균 GUVs. 소포는 30/40/30 DOPG/eSM/철 Lo + Ld 공존 지역의 테두리에 가깝게 구성 되어 있었다. 대칭 자당 조건에 대 한 오차 막대 배치-배치 분산을 보여 줍니다. 누진의 레이블 설명 솔루션 내부/외부 소포; 자당: 210mm 자당; 소금: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5; 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 11: GUVs DOPG, eSM에서 준비 및 철 210mm 자당 (자당) 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 (소금)을 사용 하 여 다른 솔루션 조건 매핑 단계 다이어그램. 우두머리 위상 상태 자당/자당 (A; 위쪽 구역), 탐구 했다 자당/소금 (인/아웃) (A; 낮은 다각형 섹션), 소금/소금 (B, 위 단면도), 및 소금/자당 (B; 낮은 다각형 섹션). 만화는 강조 표시 된 섹션 및 해당 솔루션 조건 내에서 지배적인 도메인 패턴을 보여 줍니다. 낮은 다각형 섹션에 표시 하는 소포 단계 상태는 20 x 우두머리 희석 시 비대칭 솔루션 조건 하에서 관찰 되었다. 참조⁹에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 12: 아티팩트 갇혀 GUVs. 게시물 근접 때문에 잘못 된 도메인을 볼 수 있는 작은 우두머리의 예 (DOPG/eSM/철 60/20/20). 밝은-필드 전송 빛 이미지 게시물 (grey) (오렌지) 우두머리의 confocal 형광 이미지와 중첩 됩니다. 게시물 밝은 필드 이미지에 간섭 패턴을 만드는 볼 수 있습니다. 형광 신호 가까이 단계 별거의 외관을 주는 게시물 (오른쪽)을 감소. 눈금 막대 5 µ m를 =.

그림 13: 두 명의 서로 다른 GUVs 위상 상태는 명확 하 게 보이는 PDMS 게시물에 의해 점령의 예. (A) Lo + Ld 상 분리 된 소포 DOPG/eSM/철 60의 20/20. (B) A 소포 40/30/30 Ld 또는 Lo 단상을 전시 했다. Confocal z-스택 전체 기의 아무 (아웃 포커스) 도메인 참석 했다 확인 시험 되었다. 게시물의 가장자리 이미지 (회색)의 오른쪽에 볼 수 있습니다. 눈금 막대 5 µ m를 =.

그림 14: 미세 장치를 사용 하 여 완전 한 유체 교환 후 결과 단계 행동. 같은 우두머리 표시 됩니다 (A) 대칭 소금/소금 (인/아웃)에 대 한 솔루션 exchange 전후에 둘 다 소금/자당 (인/아웃) (DOPG/eSM/철 60/20/20, 눈금 막대는 2 µ m) 및 (B) 대칭 자당/자당 (인/아웃) 자당/소금 (인/아웃) (DOPG / eSM/철 30/40/30, 스케일 바 = 3 µ m). 참조⁹에서 적응.

토론

대칭 및 비대칭 높은 염 분 조건 하에서 위상 상태 관찰에 대 한 GUVs의 성공적인 생산

여기에 제시 된 프로토콜 구성의 광범위 한 범위에 걸쳐 청구 GUVs의 막 단계 상태에 높은 염 분 버퍼 및 솔루션 비대칭의 영향을 평가 하는 전략을 소개 합니다. 이 목표 달성으로 주요 과제 중 하나는 높은 염 분 버퍼에 충전된 GUVs의 생산을 했다.

우리가 성공적으로 예금 된 지질 영화의 사전 수 화 단계와 소포 성장 위한 하룻밤 최종 수 화 단계를 포함 한 간단한 자발적인 붓기 접근에 의해 자당 솔루션에 높은 염 분 버퍼 GUVs를 생산. 그것은 지질 증 착도 지질 unilamellar 소포를 확산 있도록 roughened PTFE 접시에 수행 해야 하는 것이 중요. 또한, 지질 영화 균질 성 및 액체 단계 상태에는 온도에 소포 준비 하는 동안 모든 단계를 수행 하려면 필수적입니다. 다른, 소포 인구 구성에서 polydisperse 수 하 고 최종 인구 단계 상태 분석 편견 수 있습니다. GUVs 수율의 자발적인 붓기 기 덩어리는 한 손으로 다시 얻기 위해 작은 볼륨에서 중단 가능성에 대 한 특정 프로토콜 소포 분산 매우 집중 하 고 다른 한편으로 비대칭 솔루션을 제공 합니다. 소포^8,28의 희석을 최소화 하면서 막에 걸쳐 조건. 그것은 소포 희석 또는 외부 솔루션 중 교환, 내부 및 외부 osmolarities 유지 일치 osmolarity 불일치에 의해 발생 하는 형태 변화 유도 또는 Lo + Ld 단계 분리⁴¹ 을 방지 하거나, 당뇨의 경우 필수 조건, 기 파열 될 수 있습니다.

여기, 높은 염 분 솔루션에서 electroformation 프로토콜을 최적화 하려고 PVA 기반 붓기 multilamellar 소포 굴복 하는 동안 아무 GUVs의 생산에 결과. 자발적인 여 긴 준비 시간 및 낮은 품질^10,17기 일괄에서 결과, 충전된 vesicles의 성공적인 생산을 요구 하더라도 붓기는 추가적인 이점을 함께 제공 됩니다. 그것은 통계 일괄 분석에 대 한 충분 한 수익률 발생 하면서 최소의 노력을 요구 하 고, electroformation와 달리 정교한 장비 또는 최적화 필요 했다. 또한, 지질 산화에 의해 아무 오염^42,43관찰 되었습니다. 문학에 따르면 소포의 지질 구성 하 고 해당 주식^7,17성장 했다 그들은 사이 차이가 있다. 또한, PTFE 기판에 소포 대형 기판²³에 의해 외국 분자를 도입 젤 기반 붓기 방법 달리 어떤 오염 포함 메시지가 표시 되지 않습니다. Electroformation 비대칭 솔루션 조건을 만들 때 과도 한 소포 희석에 관련 된 추가 단점이 함께 제공 됩니다. GUVs electroformation에 의해 생산은 일반적으로 (달리 자발적인 붓기 동안 덩어리의 형태로 농축된 기 정지) 균질 분산으로 존재 한다. 외부 솔루션의 어떤 희석도 소포 수를 희석 실질적으로 것 이다. 또한, 관찰이 작업의 과정을 통해 DOPG/eSM/철 GUVs 자당에서 electroformation 제작한 불안정 한 경우에 높은 염 분 버퍼에 희석 되었다. 현미경 슬라이드에 지질 패치에서 형광 표시 그들의 시각적인 검사 가능 했다 전에 소포 버스트 것 이다. 이러한 불안정 소포 자발적인 붓기¹⁰여 그에 비해 electroformation에 의해 준비의 높은 막 긴장 관찰 될 수 있습니다.

그것만 높은 분수에 쓰 신 부분 외부 솔루션 exchange 수행 소포 희석은 비대칭 우두머리 솔루션 조건을 만드는 쉽고 빠른 접근, 비록 (여기: 95%, 그림 2), 희석, 시의 흔적으로 솔루션을 붓기 남아 있게 됩니다. 외부 솔루션 exchange의 학위의 붓기 솔루션 (2 절) 함께 기 덩어리를 pipetting와 너무 많이 그것을 diluting 하지 사이 교환 이다. 따라서, 우리는 세부³⁷ 신속 하 고 완전 한 외부 솔루션 exchange 우두머리 위상 상태 관찰 하는 동안 만든 희석 단계 상태 관측을 확인 하도록 허용 하는 다른 논의 대체 미세 접근 도입 소포입니다. 위상 상태 변이 대칭에서 비대칭 솔루션 조건으로 변경 하는 경우의 관측 될 계약에 실제로 관찰 되었다. 또한, 두 가지 방법 모두 비대칭 솔루션 조건 comparably 빠른 운항 표시 (비교 참고.⁸)을 생성 하 고 로컬 구성 변경 (참조^30,31비교)의 알려진된 위험 없이 함께 하 막 긴장 (비교 참조³²), 증가 하거나 지역 난방 (비교 기준³³), 다른 방법에 대해서는 소개에서 설명 합니다. 미세 트래핑 중 기 내부와 외부 사이의 삼 투 균형은 위에서 언급 한 단계 상태 유물 뿐만 아니라 마 솔루션 조건으로 인해 발생 하는 디플레이션을 피하기 위해 유일한 에센셜 슬립 갇혀 GUVs를 발생할 수 있습니다. 통해 외부 솔루션 교환 후 게시물.

도 불구 하 고 자발적인 붓기 저격총 성장에 성공적으로 적용 된 다른 경우, 비용의 부재에서에서 DOPC/eSM/철 시스템에서 소포 우두머리 개별 bilayers^{44 사이 반발 작용의 결과 부족 붓기 저하 될 수 있습니다.} . 미리 붓기 기간을 연장 또는 부피가 큰 지질 headgroups 도입이 문제⁴⁵카운터 수 있습니다. 또한, 붓기에 사용에서 다른 솔루션에서 자신의 희석 후 소포 안정성 다른 지질 작곡과 우리 여기 조사 하지 않은 희석 미디어에 대 한 달라질 수 있습니다. 우리는 또한 여기 준비 방법으로 평균 우두머리 직경 튜닝의 가능성을 탐구 하지 있다. 하지만 소포 구성과 솔루션 붓기 같은 매개 변수는 결과 영향을 미칠 가능성이 높습니다. 그러나 다른 방법⁴⁶ 의 응용 지질 및 여기에 사용 되는 솔루션에 대 한 더 큰 소포를 얻을 수 있습니다, 그리고, 그들은 방법으로 관련 된 다른 단점에와 함께 올 수 있습니다. 위에서 설명한 접근 대칭 및 비대칭 높은 염 분 조건에서 GUVs를 생산 하는 소포 다른 지질 구성의 구성 및 다른 매체에 있는 분산의 추가 연구에 대 한 잠재적인 도구를 제공 합니다. 마찬가지로 우리는 그 가능성을 탐험 하지 않은, 향후 재판 어떻게 일반적으로 우두머리 준비 및 희석 방법 적용 될 수 있습니다 표시 됩니다.

다양 한 온도에서 상 분리 관찰

다양 한 온도에서 GUVs 연구에 적합 한 다른 실험 설정을 존재 합니다. 이 설정을 일반적으로 문학에서 자세히 설명 하지 않습니다, 하는 동안 현재 작업 이러한 연구에 대 한 해당 기본 어셈블리를 제공 합니다.

제어 측정 표시이 자체 설계 및 챔버의 온도 정확 하 게는 서 모스 탯에 의해 제어 챔버 내부에 온도 기울기는 실험 온도 분해능. 그것은 실험 열 조건 온도 읽기와 일치 하는 보장 됩니다.

광범위 한 온도 범위 우두머리 위상 상태 평가 기간 동안 온도 변경 된 후 관찰된 소포 equilibrated 잘은 중요 하다. 이것을 보장 하기 위해 한 가지 가능한 방법은 히스테리시스를 확인 하는 것입니다. 있으면 히스테리시스, 온도 단계를 감소 해야 합니다 및/또는 평형 시간 증가. 온도로이 작품에서 제어 방식으로 설정 됩니다 물 기반 온도, 작업 온도 범위는 0-100 ° c.에 이상적으로 제한 이 범위를 확장할 수 있습니다 다른 온도 제어 액체 오일 등을 사용 하 여 또는 다른 설정, 예를 들어 채용 하 여 Peltier 장치. 실제로, 작동 온도 또한 가능한 응축 또는 증발에 의해 제한 됩니다. 또한, 멀리 실내 온도에서 온도, 관찰 실에서 정상 상태 온도 기울기의 발생 확률이 된다. 또한, 영상 장비 극단적인 온도에 다치 지 될 수 있습니다. 지질 기 연구 (⁹~ 10-50 ° C^7,)에 대 한 적절 한 온도 범위에 대 한 관측 장비에 손상을 고려해 야 하지만 일반적으로 예상 하지.

소포 도메인 관찰 유물

넓은 필드 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 아티팩트에 대 한 소스도 많습니다. 우선, 하나 기 위상 상태의 시각적 검사에 대 한 적용 되는 개체의 최대 해상도 r 에 따라 지질 도메인의 검출 한계를 결정 합니다 알고 있어야 합니다.

여기서 λ 는 방출 파장 하 고 나는 목표의 숫자 조리개. 40 x 확대 및 녹색 방출 감지 0.6의 나 일반적인 목표 빛 약 560 nm ~0.6 µ m. 따라서, 소포 사이 다른 특정 지질 혼합물에서 만든의 위상 상태를 비교 하는 연구는 광학 해상도 도달할 것 이다 조건 같은 지질 혼합물에 대 한 동일한 목표를 사용 해야 합니다.

다른 아티팩트는 여기 빛⁴¹에 확장된 노출 때문 지질 사진-산화의 결과로 지질 도메인의 발생 이다. 사진 손상 불포화 탄화수소 지질 moieties에 우선적으로 발생합니다. 사실, 일부 지질 구성에 대 한 이러한 도메인 형성 처음 균질 vesicles의 관찰 되었다 여기 여기 빛 노출 오랜된 기간 후 (~ 30 s). 그 문제에 대응 하기 위해 여기 빛 유지 되었다 초점 보기의 한 필드에서 위상 상태 평가 대 한 몇 초. 따라서, DiIC₁₈ 우리의 목적을 위해 적당 했다. 그러나 다른 염료,, 훨씬 더 중요 한 수 있으며 낮은 자극 강렬에 및 짧은 흥분 빛의 노출 시간으로 처리 해야 할 수 있습니다.

기계적 전단 응력은 소포의 피 펫 전송에서 잠재적으로 일시적으로, 그로 인하여 왜곡 명백한 기 위상 동작 도메인 믹스. 일부 일괄 처리에 대 한 다른 소포 보여 다른 위상 동작 0 분 및 5 분 후 피 펫 현미경 coverslip에 전송. 또한 미세 장치에서 유체 흐름에 의해 유도 된 전단 응력은⁴⁷혼합 도메인을 보였다. 소포 충분 한 관찰 하기 전에 평형에 대 한 시간 동안 그대로 남겨져 야 한다. 이 연구에서 소포 미세 장치에 갇혀 소포 로드 및 관찰 하기 전에 솔루션 교환 후 1 시간에 그대로 남아 있었다.

위에서 언급 한 어려움 뿐만 아니라 빛의 회절 한계, 핵 자기 공명 분광학⁴⁸ 또는 슈퍼 해상도 현미경 기법⁴⁹ 등 다른 방법에 의해 부과 된 제한 중 일부를 피하기 위해 고용 될 수 있었다.

결론 및 전망

제시 작품 막 단계 분리에 높은 염 분 대칭 및 비대칭 솔루션 조건의 영향의 분석을 허용 하는 메서드 집합을 보여 줍니다. 제시 방법의 모두는 다른 응용 프로그램에 적합 합니다. 미세 소자는 예 도메인 형성 및 솔루션 비대칭의 유도 따라 실종의 속도 론을 공부 하는 플랫폼을 제공 한다. 또한, 도메인 모양 소금 농도의 기능으로는 그런 식으로 검사 수 있습니다. 모든 방법 또한 관심의 다른 솔루션을 사용 하 여 위상 동작에 영향을 보면 사용 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt	Avanti Polar Lipids	840475C	abbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelin	Avanti Polar Lipids	860061	abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %)	Avanti Polar Lipids	700000	abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Molecular Probes	D-282	abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %)	Merck
NaCl (> 99.8 %)	Roth
HCl (37 %)	Roth
Tris (≥ 99.9 %)	Roth
Sucrose (≥ 99.5 %)	Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mL	Kimble		Soda flat bottom, white screw cap
pH meter	Mettler Toledo	MP220
Osmometer	Gonotec	Osmomat030
Epi-fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer D1
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP5
Objective 40x, 0.6 NA	Zeiss	LD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NA	Leica	506174
Objective 63x, 0.9 NA	Leica	506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm	Menzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm	Menzel-Gläaser
Parafilm "M"	Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mL	Braun
0.45 µm syringe filter	GVS North America	Cameo 25AS, 1213723	Acetate, sterile