经鼓膜药物治疗耳毒性的临床研究

摘要

本文提出了一种通过鼓膜入耳蜗进行药物局部化管理的技术。通过这条途径运送药物不会影响化疗药物如顺铂的抗癌功效。

摘要

保护剂治疗药物性耳毒性的系统管理受到限制, 因为这些保护剂可能会干扰初级药物的化疗效果。这种情况尤其适用于药物顺铂, 其抗癌作用因抗氧化剂而减弱, 为听力丧失提供了足够的保护。其他当前或潜在的 otoprotective 代理可能会造成类似的问题, 如果系统管理。将各种生物制品或保护剂直接应用于耳蜗, 可以使这些药物的高水平在局部具有有限的系统性副作用。在本报告中, 我们展示了一种跨鼓膜的方法, 提供各种药物或生物试剂的耳蜗, 这应该加强对耳蜗的基础科学研究, 并提供一个简单的方法指导使用 otoprotective 剂在诊所。本报告详细介绍了一种跨鼓膜药物传递方法, 并举例说明了该技术如何成功地应用于实验动物治疗顺铂耳毒性。

引言

外周听觉系统非常敏感的药物, 如顺铂和氨基糖苷类抗生素。顺铂是一种广泛使用的化疗剂, 用于治疗各种实体肿瘤, 如卵巢, 睾丸, 头颈癌。使用这种药物的耳毒性是剂量限制和相当常见的, 影响75-100% 的患者治疗¹。其他药物, 如卡铂和奥沙利铂, 已成为替代顺铂^2,3,4,5, 但它们的用处仅限于少数癌症。

早期研究表明活性氧 (ROS) 对顺铂和氨基糖苷类产生的耳毒性有重要作用。随后的研究表明, NOX3 异构体氧化酶是耳蜗中 ROS 的主要来源, 并由顺铂^6,7激活。ROS 的产生危及细胞的抗氧化缓冲能力, 导致细胞膜脂质过氧化增加⁸。此外, 顺铂增加了羟基自由基产生剧毒醛 4-hydroxynonenal (4-他), 一个引发细胞死亡^9,10。根据这些发现, 对治疗顺铂耳毒性的几种抗氧化剂进行了研究。这些包括 n-乙酰半胱氨酸 (NAC), 硫代硫酸钠 (STS), 汀和 d-蛋氨酸。然而, 抗氧化剂治疗的一个主要关注是, 这些抗氧化剂可以降低顺铂化疗的功效时, 系统地管理¹¹通过与硫醇组的相互作用的抗氧化剂分子。

鉴于这些问题的抗氧化剂治疗, 本研究的目的是检查传递抗氧化剂和其他药物的耳蜗, 以减少听力损失的跨鼓膜路线。下面描述的药物和短干涉 (si) RNA 的跨鼓膜路线似乎特别有希望。

研究方案

雄性大鼠是按照国家卫生研究院的动物使用指南和由南伊利诺伊大学医学院实验室动物护理和使用委员会批准的协议处理的。在药物管理局麻醉前和72小时后, 对大鼠进行听觉脑干反应 (ABR) 检查, 以验证其对鼓膜药物传递的影响。

1. 听觉脑干反应 (ABR)

注意:通过听觉测试设备和软件采集 ABR 测量结果。ABR 代表诱发电位或高频波产生的第八颅神经 (波 I 和 II) 和其他高听觉脑干结构, 包括 anteroventral 耳蜗核 (波 III), 侧 lemniscus (波 IV), 和下位丘 (波浪 V)。这些波浪根据延迟被区分。ABR 测量是按照前面描述的¹²进行的。

1. 麻醉大鼠, 混合90毫克/千克氯胺酮和17毫克/千克甲苯噻嗪通过腹腔注射。确认麻醉深度通过脚趾捏反射。对眼睛进行眼部润滑 (或矿物油滴), 防止眼部干燥, 避免麻醉时出现溃疡。
2. 把老鼠放在有控制的隔音亭内的加热垫 (37 °c) 的俯卧位置上。听力测试设备位于展台的外面和旁边。
3. 相应地插入不锈钢电极: 在后侧面的接地电极, 两个耳朵之间的正电极, 直接顶部的头骨, 和负电极在每耳耳廓下。
4. 在8、16和32赫上应用高频传感器作为5毫秒音爆发的声学刺激。确定刺激强度作为分贝声压水平 (dB SPL)。这开始在10分贝的 spl 和达到90分贝的 spl 与 10 db 的步骤大小。使用脉冲精密声电平计, 将声音强度校准为最大输出90分贝的 SPL。
   注意:实验结果显示了周围听觉器官、耳蜗和上述听觉结构的完整性。波形是在15毫秒的刺激输入中产生的, 而波的潜伏期取决于传导时间, 这反过来又受到三个关键因素的调节: 大脑体积、强度和声音频率。利用制造商提供的软件记录听觉诱发电位。
5. 考虑最小强度, 可以唤起两个不同的波形 (II 和 III) 的0.5 µV 振幅作为阈值突出。
   注意:阈值移位表示治疗后的阈值与治疗前获得的阈值的差异。

2. 反式鼓膜注射

1. 对药物进行 tympanically, 将大鼠置于左侧褥疮位置。
   1. 将2.5 毫米的一次性耳镜面插入耳道。
   2. 使用手术范围, 定位镜面, 使鼓膜可见。
   3. 使用29克 X ½, 0.5 毫升胰岛素注射器, 绘制50µL 的 [r] n-苯基异丙腺苷 (r-PIA) 溶液 (1 µM), 8-环戊基-13-dipropylxanthine (DPCPX) 溶液 (3 µM), 或 siRNA 溶液 (0.9 µg) 注入 (5 单位)。
   4. 使用镜面引导针到鼓膜的前下位区。
   5. 用针在膜上戳一个洞, 并管理1.2.3 中提到的药物。允许老鼠在这个位置休息15分钟。
      注意: 50 µL 应该是足够的体积, 以适应鼓膜后。用药后, 耳道不应有液体。
   6. 将大鼠置于右侧压位位置, 并重复步骤1.2.1 通过 1.2.5, 以供另一耳管理。
2. 对于接受顺铂腹腔的大鼠, 在37摄氏度的加热垫上放置大鼠仰卧位。
   1. 使用21克 X 3/4 蝶形针 (12 英寸长油管), 在无菌磷酸盐缓冲盐水中绘制顺铂 (11 毫克/千克, 1 毫克/毫升溶液)。
   2. 使用注射器泵, 管理顺铂 (1 毫克/毫升)通过腹腔注射30分钟以上。
      注意:对于一个250克大鼠, 体积将是2.75 毫升的速度约0.1 毫升每分钟。
3. 在这些程序中继续监测麻醉深度。一旦顺铂管理完成, 把老鼠放回笼子里的俯卧位置, 确保没有任何阻碍它的呼吸。
4. 监视老鼠直到完全恢复。

3. 耳蜗解剖和脱钙

1. 继最后 ABR (72 小时后), 麻醉大鼠与90毫克/千克氯胺酮的混合物和17毫克/千克甲苯噻嗪通过腹腔注射。用脚趾捏的反射来确认麻醉。弄死老鼠的通过斩首。
2. 解剖出的颞骨, 如前所述¹³。
3. 在一个7毫升的玻璃闪烁瓶 (完全覆盖耳蜗) 的 1x PBS 溶液中放置耳蜗4% 多聚甲醛。隔夜冷藏4摄氏度。在室温下取出多聚甲醛并用 1x PBS 清洗。
4. 去除 PBS, 完全用120毫米 EDTA 溶液 (pH 7.3) 填满管子。在室温下放置在转子上, 允许脱钙2至3周, 每天更换 EDTA 溶液。

4. Cryosectioning

1. 在完成脱钙后, 完全浸入以下溶液中的耳蜗 (每7毫升) 24 小时4摄氏度: 10% 蔗糖, 20% 蔗糖, 1:1 混合物20% 蔗糖和最佳切削温度 (OCT) 嵌入化合物。
2. 在15毫米 x 15 毫米 x 5 毫米一次性嵌入模具中, 将新鲜的 OCT 填充并完全覆盖耳蜗。将耳蜗定向到其侧面, 使其与嵌入模具的底部平行, 如 Whitlon et所述。¹⁴
3. 立即将模具放在干冰上固化 OCT, 并在一夜之间存放在-80 摄氏度。
4. 0.01% 聚 l-赖氨酸在室温下浸泡30分钟. 取出幻灯片, 不冲洗, 并允许夜间干燥。将这些幻灯片用于 cryosections。
5. 将 OCT 中的耳蜗从-80 摄氏度冷藏库中取出, 放在干冰上。使用锋利的切片刀片 (L x W:80 毫米 x 8 毫米, 厚度0.25 毫米, 切削角度34°), 部分 OCT 块在10µm 使用恒温器在-30 °c。每张幻灯片放置两个部分。
6. 完成后, 将幻灯片冷藏4摄氏度。

5. 免疫组化

1. 将幻灯片放在幻灯片架上的玻璃显微镜滑动染色盘中。用350毫升的 1x PBS 填充这道菜, 在室温下将幻灯片冲洗5分钟三次。
2. 将幻灯片从盘子中取出, 用干擦拭的方法将组织周围的区域晾干, 确保不使组织干燥。
   1. 使用液体阻断笔, 在组织切片周围画一个圆圈。
3. 在室温下, 在 1x PBS 中加入150µL, 其中含有10% 正常 (驴) 血清、1% 非离子洗涤剂和 1% BSA, 以1小时的温度阻断组织。
4. 在 1x PBS 中, 用150µL 10% 正常 (驴) 血清、0.1% 非离子洗涤剂和主要抗体 (见下文注), 在4摄氏度的湿润室中, 利用多余的阻断溶液, 在一夜之间孵化组织。
   注意:对于下列抗体, 使用了这些稀释: 对于图 2和3, p-STAT1 系列⁷²⁷ 1:300。对于图 4, p-STAT1 系列⁷²⁷、1:100 和 TRPV1 1:100。
5. 将幻灯片放在幻灯片架上的玻璃显微镜滑动染色盘中。用350毫升的 1x PBS 填充盘子, 在室温下清洗5分钟三倍的幻灯片。
6. 在一个含有0.01% 非离子洗涤剂和10% 正常 (驴) 血清的溶液中, 在黑暗中的一个加湿室中, 在室温下进行2到3小时的二次抗体的孵育。
   注意:对于以下二次抗体, 使用了这些稀释: 对于图 2和3, 驴抗兔 IgG 1:600。对于图 4, 罗丹明 (TRITC) 驴抗兔 igg 1:500 和驴抗山羊 igg 1:500。
7. 将幻灯片放在幻灯片架上的玻璃显微镜滑动染色盘中。用350毫升的 1x PBS 填充盘子, 在室温下清洗5分钟三倍的幻灯片。
8. 从幻灯片上轻拍多余的液体, 用干燥的纸巾擦干幻灯片。通过将安装代理的一滴 DAPI 直接添加到组织中来装载幻灯片。慢慢地将盖玻片放在顶部, 确保没有气泡在下面形成, 并允许幻灯片在室温下夜间在黑暗中治愈。将幻灯片存放在4摄氏度。
9. 图像幻灯片使用共焦显微镜。使用激光成像如下: DAPI 紫外线激光器, 488 nm 抗兔 IgG 激光, 543 nm 激光为罗丹明 TRITC。

结果

在顺铂治疗后三天大鼠的 ABR 反应显示阈值显著升高。通过鼓膜 (r) n-phenylisopropyladenosine (r-PIA), 腺苷 A₁受体激动剂¹⁵, 顺铂前, 这些阈值的升高明显减少。R-PIA 在腺苷 A₁受体上的作用的特异性表明, 它是由 8-环戊基-13-dipropylxanthine (DPCPX) 对抗,_一个1 受体特定拮抗^剂16。这种药物增强顺铂诱发的 ABR ?...

讨论

通过鼓膜管理途径, 可以将药物和其他药物的局部运送到耳蜗, 如果系统地进行管理, 可能会产生明显的系统性副作用。这种药物管理方法允许药物迅速进入行动地点, 其剂量要比通过系统途径所能达到的要高得多。在这里和发表的结果表明, 通过鼓膜管理的 [R] n-苯基异丙腺苷 (r-PIA) 保护耳蜗从顺铂诱导的外毛细胞损失 (图 1)¹⁹和诱导炎症的表现,...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120