Entrega de trans-timpânicas drogas para o tratamento da ototoxicidade

Resumo

Apresentamos uma técnica para administração localizada de drogas através da rota trans-timpânicas na cóclea. Entrega da droga através desta rota não iria interferir com a eficácia de anticâncer dos medicamentos quimioterápicos tais como a cisplatina.

Resumo

A administração sistémica de agentes protectores para tratar a ototoxicidade induzida por drogas é limitada pela possibilidade que estes agentes protectores poderiam interferir com a quimioterápico eficácia das drogas primárias. Isto é especialmente verdadeiro para a cisplatina de drogas, cujas ações anticâncer são atenuadas por antioxidantes que proporcionar uma protecção adequada contra perda de audição. Outros agentes otoprotective actuais ou potenciais poderiam representar um problema semelhante, se administrado sistemicamente. A aplicação de vários produtos biológicos ou agentes protectores diretamente à cóclea permitiria altos níveis desses agentes localmente com limitados efeitos secundários sistêmicos. Neste relatório, vamos demonstrar um método trans-timpânicas de entrega de várias drogas ou reagentes biológicos à cóclea, que deve melhorar a pesquisa de ciência básica na cóclea e fornecem uma maneira simples de dirigir o uso de agentes otoprotective nas clínicas. Este relatório detalha um método de entrega de droga trans-timpânicas e fornece exemplos de como essa técnica tem sido usada com sucesso em animais experimentais para tratar a ototoxicidade da Cisplatina.

Introdução

O sistema auditivo periférico é requintadamente sensível às drogas como antibióticos cisplatina e aminoglicosídeos. A cisplatina é um agente quimioterapêutico amplamente utilizado para o tratamento de uma variedade de tumores sólidos, como ovário, testículo e cabeça e pescoço cancros. Ototoxicidade experimentada com o uso desta droga é dose-limitante e bastante comum, afetar 75-100% dos pacientes tratados¹. Outras drogas, como a carboplatina e Oxaliplatina, têm surgido como alternativas à cisplatina^2,3,4,5, mas sua utilidade é limitada a alguns cancros.

Primeiros estudos demonstraram o papel crítico de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mediação a ototoxicidade produzida pela cisplatina e aminoglicosídeos. Estudos posteriores mostraram que o NOX3 isoforma da oxidase de NADPH é a principal fonte de ROS na cóclea e é ativada por cisplatina^6,7. A geração de compromissos ROS o antioxidante capacidade das células, levando a tampão aumentou peroxidação lipídica das membranas celulares⁸. Além disso, a cisplatina aumenta a produção de radicais hidroxila, que geram altamente tóxico aldeído 4-hydroxynonenal (4-HNE), um iniciador de célula morte^9,10. Com base nesses resultados, vários antioxidantes foram examinadas para o tratamento da ototoxicidade da Cisplatina. Estes incluem a N-acetilcisteína (NAC), tiosulfato de sódio (STS), Amifostina e D-metionina. No entanto, uma grande preocupação da terapia antioxidante é que esses antioxidantes poderiam reduzir a eficácia de quimioterápicos cisplatina quando administrado sistemicamente¹¹ através da interação da Cisplatina com grupos tiol nas moléculas antioxidantes.

Tendo em conta estes problemas com terapia antioxidante, o objetivo deste estudo foi examinar a rota trans-timpânicas de entregar antioxidantes e outras drogas para a cóclea para reduzir a perda de audição. A rota trans-timpânicas de droga e interferência curto (si) do RNA, descrito abaixo, aparece particularmente promissor.

Protocolo

Wistar macho ratos foram tratados em conformidade com o animal National Institutes of Health use orientações e um protocolo aprovado pelo Comitê de usar e Southern Illinois University escola de medicina laboratorial Cuidado Animal. Auditivo de tronco encefálico (ABR) foi realizado em ratos, enquanto sob anestesia antes da administração de drogas e 72 h após para verificar o efeito da entrega droga trans-timpânicas.

1. auditivo de tronco encefálico (ABR)

Nota: Medições de ABR foram coletadas usando o software e equipamento de teste auditivo. ABR representa potenciais evocados ou ondas de alta frequência geradas pelo oitavo nervo craniano (onda I e II) e outras estruturas auditivo de tronco cerebral superiores, incluindo o núcleo coclear ribeirões (onda III), lemnisco lateral (onda IV) e inferior colículo (onda V). Estas ondas são diferenciadas dependendo da latência. ABR as medições foram realizadas conforme descrito anteriormente,¹².

1. Ratos com uma mistura de 90 mg/kg quetamina e 17 mg/kg xylazine através de injeção intraperitoneal de anestesiar. Confirme a profundidade da anestesia através do dedo do pé-pitada reflexo. Aplica lubrificação oftálmica (ou gotas de óleo mineral) para ambos os olhos para impedir a secagem dos olhos e evitar ulceração durante a anestesia.
2. Coloque o rato em posição de bruços sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C) dentro de uma cabine acústica controlada. Equipamento de teste de audiologia está localizado do lado de fora e ao lado da cabine.
3. Introduza os eletrodos de aço inoxidável em conformidade: o eléctrodo de terra na parte traseira de flanco, o elétrodo positivo entre os dois ouvidos diretamente no topo do crânio e os eletrodos negativos abaixo o pavilhão auricular de cada orelha.
4. Aplicam-se estímulos acústicos usando transdutores de alta frequência como um estouro de Tom de 5 ms em 8, 16 e 32 kHz. Determine as intensidades de estímulo como decibel nível de pressão sonora (dB SPL). Isto começa em 10 dB SPL e chega a 90-dB SPL com um tamanho de passo de 10 dB. Calibre as intensidades de som para uma potência máxima de 90 dB SPL usando um medidor de nível sonoro com precisão de impulso.
   Nota: O resultado do teste dá uma indicação da integridade de órgão periférico da audição, a cóclea e as estruturas auditivas acima mencionadas. As formas de onda são geradas dentro de 15 ms de estímulo de entrada e a latência das ondas depende do tempo de condução, que por sua vez, é regulamentado por três fatores críticos: volume do cérebro, a intensidade e a frequência do som. Potencial evocado auditivo foram gravado usando o software fornecido pelo fabricante.
5. Considere a intensidade mínima que pode evocar duas diferentes formas de onda (II e III) de 0.5 amplitude µV como limiar proeminente.
   Nota: Turno de limiar representa a diferença no limiar medido após tratamento em comparação com o limiar obtido antes do tratamento.

2. Trans-timpânicas injeções

1. Para administrar o medicamento trans-tympanically, coloque o rato na posição de decúbito lateral esquerdo.
   1. Inserir o canal auditivo, espéculos auriculares descartáveis de 2,5 mm.
   2. Com o uso de um escopo cirúrgico, posicione o espéculo para que a membrana timpânica é visível.
   3. Usando um ½ X 29, seringa de insulina de 0,5 mL, elaborar 50 µ l da adenosina de isopropil [R] - N - fenil (R-PIA) solução (1 µM), 8-ciclopentílico-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) solução (3 µM) ou solução de siRNA (0,9 µ g) para injetar (5 unidades).
   4. Use o espéculo para direcionar a agulha para a região anterior inferior da membrana timpânica.
   5. Fazer um buraco através da membrana com a agulha e administrar as drogas mencionadas no 1.2.3. Permitir que o rato descansar nesta posição por 15 min.
      Nota: 50 µ l deve ser o volume adequado para caber atrás da membrana timpânica. Sem líquido deve ser no canal auditivo após a administração.
   6. Coloque o rato em decúbito lateral, posição e repita os passos 1.2.1 através de 1.2.5 para administração na outra orelha direita.
2. Para ratos recebendo cisplatina intraperitonealmente, coloque o rato em posição supina sobre uma almofada de aquecimento a 37 ° C.
   1. Usando um 21 X 3/4 borboleta agulha (12" tubos de comprimento), elaborar cisplatina (11 mg/kg, solução de 1 mg/mL em solução salina tampão de fosfato estéril [PBS]).
   2. Usando uma bomba de seringa, administre cisplatina (1 mg/mL) via injeção intraperitoneal mais de 30 min.
      Nota: Para um rato de 250 g, o volume seria 2,75 mL a uma taxa de cerca de 0,1 mL / min.
3. Continue a acompanhar a profundidade da anestesia durante estes procedimentos. Uma vez que a administração de cisplatina está completa, coloque o rato volta na gaiola de bruços, certificar-se de que não há nada para obstruir sua respiração.
4. Monitore o rato até que se recuperou totalmente.

3. descalcificação e dissecação de cóclea

1. Após o final ABR (após 72 h), anestesia o rato com uma mistura de 90 mg/kg quetamina e 17 mg/kg xylazine através de injeção intraperitoneal. Confirme a anestesia com um reflexo de dedo-pinch. Eutanásia a rato através de decapitação.
2. Disse para fora do osso temporal, conforme descrito anteriormente,¹³.
3. Coloque a cóclea em paraformaldeído 4% em 1 x solução de PBS em um frasco de 7 mL vidro cintilação (completamente cobrindo a cóclea). Leve à geladeira durante a noite a 4 ° C. Retire o paraformaldeído e lave com 1X PBS em temperatura ambiente.
4. Remover o PBS e encher o tubo completamente com uma solução de 120-mM de EDTA (pH 7,3). Coloque em um rotador à temperatura ambiente e permitir descalcificação por 2 a 3 semanas, a solução de EDTA a mudar diariamente.

4. Cryosectioning

1. Após a conclusão de descalcificação, mergulhe completamente a cóclea nas seguintes soluções (7 mL cada) por 24 h a 4 ° c: 10% de sacarose, 20% de sacarose, 1:1 mistura de 20% de sacarose e da temperatura de corte ideal (OCT) incorporação de composto.
2. Lugar fresco OCT composto para preencher e cobrir completamente a cóclea em uma 15 x 15 mm x 5 mm descartáveis incorporação de molde. Oriente a cóclea de lado para que ele seja paralelo ao fundo do molde de incorporação, como descrito por Whitlon et al. ¹⁴
3. Imediatamente, coloque o molde em gelo seco para solidificar a OCT e armazenar a-80 ° C durante a noite.
4. Mergulhe as corrediças do microscópio em 0,01% poli-L-lisina em temperatura ambiente por 30 min. Retire os slides, não enxaguar e deixar secar durante a noite. Use estes slides para cryosections.
5. Retire a cóclea em OCT do freezer-80 ° C e coloque-o em gelo seco. Usando uma lâmina afiada micrótomo (L x w: 80 mm x 8 mm, espessura de 0,25 mm, ângulo de corte de 34 °), seção os blocos OCT em 10 µm usando um criostato a-30 ° C. Coloque duas seções por slide.
6. Leve à geladeira slides a 4 ° C, quando terminar.

5. imuno-histoquímica

1. Coloque os slides em um vidro de microscópio manchando o prato em um rack de slide. Encher o prato com 350 mL de 1X PBS e lavar três vezes de slides por 5 min à temperatura ambiente.
2. Remover as lâminas do prato e secar a área que circunda o tecido usando uma limpeza a seco, certificando-se não servem para o tecido.
   1. Usando uma caneta de bloqueio líquida, desenhe um círculo ao redor da seção de tecido.
3. Bloquear o tecido por 1h à temperatura ambiente adicionando 150 µ l de solução de bloqueio contendo soro normal de 10% (burro), detergente não iônico 1% e 1% de BSA em 1X PBS.
4. Bata fora excesso solução de bloqueio e incubar o tecido durante a noite a 4 ° C, numa câmara umidificada com 150 µ l de soro normal de 10% (burro), 0,1% de detergente não iônico e anticorpo primário (veja a nota abaixo) em PBS 1x.
   Nota: Para os seguintes anticorpos, estas diluições foram utilizadas: Figura 2 e 3, p-STAT1 Ser⁷²⁷ 1: 300. Para Figura 4, p-STAT1 Ser⁷²⁷, 1: 100 e 1: 100 TRPV1.
5. Coloque os slides no vidro de microscópio manchando o prato em um rack de slide. Encher o prato com 350 mL de 1X PBS e lavar três vezes de slides por 5 min à temperatura ambiente.
6. Incube com os anticorpos secundários diluídos em uma solução contendo 0,01% de detergente não iônico e soro normal de 10% (burro) em PBS 1x para 2 a 3 h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada no escuro.
   Nota: Para os seguintes anticorpos secundários, estas diluições foram utilizadas: Figura 2 e 3, 1:600 de IgG de antiburro coelho. Figura 4, rodamina (TRITC) burro anti-coelho IgG 1: 500 e burro de anti-cabra IgG 1: 500.
7. Coloque os slides no vidro de microscópio manchando o prato em um rack de slide. Encher o prato com 350 mL de 1X PBS e lavar três vezes de slides por 5 min à temperatura ambiente.
8. Toque o líquido adicional fora do slide e seque o slide com uma limpeza a seco em torno do tecido. Monte as lâminas, adicionando uma gota do agente com DAPI montagem diretamente sobre o tecido. Lentamente coloque lamela por cima, garantindo que nenhum bolhas são formadas por baixo e permitir que os slides curar durante a noite à temperatura ambiente no escuro. Slides de loja a 4 ° C.
9. Slides de imagem utilizando microscopia confocal. Usam lasers para imagem latente da seguinte forma: laser UV para DAPI, 488 nm laser para o burro anti-coelho IgG e 543 nm laser para o rodamina TRITC.

Resultados

Respostas ABR medido em ratos em três dias após a administração cisplatina mostrou uma elevação significativa em limiares. Elevação desses limiares foi significativamente reduzida em ratos administrados com trans-timpânicas [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), adenosina um₁ receptor agonista¹⁵, antes da Cisplatina. A especificidade da ação do R-PIA na adenosina um receptor₁ demonstrou-se pela observ...

Discussão

A rota trans-timpânicas administração permite entrega localizada de drogas e outros agentes para a cóclea, que caso contrário poderia produzir efeitos colaterais sistêmicos significativos se administrado sistemicamente. Este método de administração de drogas permite um acesso rápido de drogas para o local de ação em doses significativamente mais elevadas do que poderia ser alcançado através da rota sistêmica. Os resultados aqui apresentados e publicados anteriormente mostraram que trans-timpânicas adminis...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120