Veicolazione Trans-timpanico per il trattamento dell'ototossicità

Riepilogo

Presentiamo una tecnica per somministrazione localizzata di farmaci attraverso la via trans-timpanica nella coclea. Somministrazione di farmaci attraverso questa rotta non avrebbe interferito con l'efficacia anticancro dei farmaci chemioterapici come il cisplatino.

Abstract

La somministrazione sistemica di agenti protettivi per trattare l'ototossicità indotta da farmaci è limitata dalla possibilità che questi agenti protettivi potrebbero interferire con l'efficacia chemioterapeutica delle droghe primarie. Questo è particolarmente vero per il cisplatino della droga, le cui azioni anticancro sono attenuati dagli antiossidanti che forniscono una protezione adeguata contro perdita dell'udito. Altri agenti attuali o potenziali otoprotective potrebbero rappresentare un problema simile, se somministrato per via sistemica. L'applicazione di vari biologicals o agenti protettivi direttamente alla coclea consentirebbe di alti livelli di questi agenti localmente con limitati effetti collaterali sistemici. In questo rapporto, dimostriamo un trans-timpanico metodo di consegna dei vari farmaci o reagenti biologici alla coclea, che dovrebbe migliorare la ricerca di scienza di base sulla coclea e forniscono un modo semplice di orientare l'utilizzazione di agenti otoprotective nelle cliniche. Questo rapporto Dettagli un metodo di consegna della droga trans-timpanico e fornisce esempi di come questa tecnica è stata utilizzata con successo in animali da esperimento per trattare l'ototossicità del cisplatino.

Introduzione

Il sistema uditivo periferico è squisitamente sensibile a farmaci quali cisplatino e aminoglycoside antibiotici. Il cisplatino è un agente chemioterapeutico ampiamente usato per il trattamento di una varietà di tumori solidi, quali testa, testicolare e ovarico e cancri del collo. L'ototossicità sperimentato con l'uso di questo farmaco è dose-limitante e abbastanza comune, che colpisce il 75-100% dei pazienti trattati¹. Altri farmaci, come carboplatino e oxaliplatino, sono emerse come alternative al cisplatino^2,3,4,5, ma la loro utilità è limitata ad alcuni tipi di cancro.

I primi studi hanno dimostrato il ruolo critico di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nel mediare l'ototossicità prodotta dal cisplatino e gli aminoglicosidi. Studi successivi hanno mostrato che l'isoforma NOX3 della NADPH ossidasi è la principale fonte di ROS nella coclea e viene attivato da cisplatino^6,7. La generazione di compromessi ROS l'antiossidante tampone di cellule, con conseguente aumentata perossidazione lipidica delle membrane cellulari⁸. Inoltre, cisplatino aumenta la produzione di radicali idrossilici che generano altamente tossico aldeide 4-hydroxynonenal (4-HNE), un iniziatore di cellule morte^9,10. Basato su questi risultati, parecchi antiossidanti sono stati esaminati per il trattamento dell'ototossicità del cisplatino. Questi includono N-acetil cisteina (NAC), tiosolfato di sodio (STS), amifostina e D-metionina. Tuttavia, delle principali preoccupazioni della terapia antiossidante è che questi antiossidanti potrebbero ridurre il cisplatino chemioterapeutico efficacia quando somministrato per via sistemica¹¹ attraverso l'interazione di cisplatino con gruppi tiolici in molecole antiossidanti.

In considerazione di questi problemi con la terapia antiossidante, l'obiettivo di questo studio era di esaminare il percorso trans-timpanico di fornire antiossidanti e altri farmaci alla coclea per ridurre la perdita dell'udito. La via trans-timpanico di droga e breve interferire (si) RNA, descritto di seguito, appare particolarmente promettente.

Protocollo

Linee guida e un protocollo approvato dal comitato di utilizzare e Southern Illinois University School di medicina laboratorio Animal Care utilizzare Wistar maschio ratti sono stati trattati in conformità con l'animale di National Institutes of Health. Risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) è stato effettuato su ratti mentre nell'ambito dell'anestesia prima della somministrazione del farmaco e 72 h dopo per verificare l'effetto della veicolazione trans-timpanico.

1. risposta uditive del tronco cerebrale (ABR)

Nota: Misurazioni di ABR sono stati raccolti utilizzando le apparecchiature di prova uditiva e software. ABR rappresenta i potenziali evocati o onde ad alta frequenza generate da ottavo nervo cranico (onda I e II) e altre strutture uditive del tronco cerebrale superiore tra cui nucleo cocleare anteroventral (onda III), lemnisco laterale (onda IV) e inferiore collicolo (onda V). Queste onde sono differenziate a seconda della latenza. ABR sono state effettuate come descritto in precedenza¹².

1. Anestetizzare ratti con una miscela di 90 mg/kg ketamina e 17 mg/kg xylazina tramite iniezione intraperitoneale. Confermare la profondità del riflesso di anestesia via punta-pizzico. Applicare lubrificazione oftalmica (o gocce di olio minerale) in entrambi gli occhi per evitare gli occhi secchi e ulcerazione durante l'anestesia.
2. Posizionare il ratto in posizione prona su un rilievo di riscaldamento (37 ° C) all'interno di una cabina acustica controllata. Apparecchiatura di collaudo di audiologia si trova all'esterno, nei pressi del casello.
3. Inserire gli elettrodi in acciaio inox di conseguenza: l'elettrodo di terra nella parte posteriore del fianco, l'elettrodo positivo tra le due orecchie direttamente sulla sommità del cranio e gli elettrodi negativi sotto pinna di ciascun orecchio.
4. Applicare stimoli acustici utilizzando trasduttori ad alta frequenza come una raffica di tono 5 ms a 8, 16 e 32 kHz. Determinare intensità di stimolo come livello di pressione sonora di decibel (dB SPL). Questo comincia a 10 dB SPL e raggiunge 90-dB SPL con un incremento di 10 dB. Calibrare le intensità sonore per una potenza massima di 90 dB SPL utilizzando un fonometro impulso precisione.
   Nota: Il risultato del test dà un'indicazione dell'integrità dell'organo dell'udito periferico, la coclea e le suddette strutture uditive. Le forme d'onda vengono generate all'interno di 15 ms di input di stimolo e la latenza delle onde dipende dal tempo di conduzione, che a sua volta è regolato da tre fattori critici: volume del cervello, l'intensità e la frequenza del suono. Potenziali evocati uditivi sono stati registrati usando il software fornito dal produttore.
5. Prendere in considerazione l'intensità minima che può evocare due diverse forme d'onda (II e III) di ampiezza di 0,5 µV come soglia prominente.
   Nota: Spostamento della soglia rappresenta la differenza tra la soglia misurata dopo trattamento confrontato con la soglia ottenuta prima del trattamento.

2. Trans-timpanico iniezioni

1. Per amministrare il farmaco trans-tympanically, posizionare il ratto in decubito laterale sinistro.
   1. Inserire speculum auricolari monouso 2,5 mm nel condotto uditivo.
   2. Con l'uso di un ambito chirurgico, posizionare gli speculi in modo che la membrana timpanica è visibile.
   3. Utilizzando un 29 X ½, siringa da insulina 0,5 mL, redigere 50 µ l di adenosina [R] - N - fenil isopropilico (R-PIA) soluzione (1 µM), 8-ciclopentil-1,3-dipropilxantina (DPCPX) soluzione (3 µM) o siRNA soluzione (0,9 µ g) da iniettare (5 unità).
   4. Utilizzare gli speculi per dirigere l'ago alla regione inferiore anteriore della membrana timpanica.
   5. Poke un buco attraverso la membrana con l'ago e amministrare i farmaci citati in 1.2.3. Consentire il topo a riposare in questa posizione per 15 min.
      Nota: 50 µ l deve essere il volume adeguato per adattarsi dietro la membrana timpanica. Nessun liquido deve essere nel condotto uditivo dopo la somministrazione.
   6. Posizionare il ratto nel diritto decubitus laterale di posizione e ripetere i passaggi 1.2.1 attraverso 1.2.5 per amministrazione in altro orecchio.
2. Per i ratti che riceve il cisplatino intraperitonealmente, posizionare il ratto in posizione supina su un rilievo di riscaldamento a 37 ° C.
   1. Utilizzando un 21 X 3/4 butterfly needle (tubazione di lunghezza 12"), redige il cisplatino (11 mg/kg, 1 mg/mL di soluzione in una soluzione salina tampone fosfato sterile [PBS]).
   2. Utilizzando una pompa a siringa, amministrare cisplatino (1 mg/mL) tramite l'iniezione intraperitoneale dopo 30 min.
      Nota: Per un ratto di 250 gr, il volume sarebbe 2,75 mL a una velocità di circa 0,1 mL / min.
3. Continuare a monitorare la profondità dell'anestesia durante queste procedure. Una volta completata la somministrazione di cisplatino, posizionare il topo nella gabbia in posizione prona, assicurandosi che non c'è nulla per ostacolare la respirazione.
4. Monitorare il ratto fino a completamente recuperato.

3. coclea dissezione e decalcificazione

1. In seguito la finale ABR (dopo 72 h), anestetizzare il topo con una miscela di 90 mg/kg ketamina e 17 mg/kg xylazina tramite iniezione intraperitoneale. Confermare l'anestesia con una reflex di punta-pizzico. Eutanasia il ratto tramite decapitazione.
2. Sezionare l'osso temporale, come descritto in precedenza¹³.
3. Posto coclea in paraformaldeide al 4% in PBS soluzione in un flaconcino di vetro da 7 mL scintillazione (coprendo completamente la coclea) 1x. Conservare in frigorifero durante la notte a 4 ° C. Rimuovere la paraformaldeide e lavare con 1x PBS a temperatura ambiente.
4. Rimuovere PBS e riempire completamente il tubo con una soluzione di 120 mM di EDTA (pH 7,3). Posizionare sull'agitatore a temperatura ambiente e consentire la decalcificazione per 2-3 settimane, cambiando ogni giorno la soluzione di EDTA.

4. Cryosectioning

1. Al completamento di decalcificazione, immergere completamente la coclea nelle seguenti soluzioni (7 mL ciascuno) per 24 h a 4 ° c: 10% saccarosio, saccarosio al 20%, miscela 1:1 di saccarosio al 20% e temperatura di taglio ottimale (OCT) incorporare composti.
2. Posto fresco OCT composto per riempire e coprire completamente la coclea in un 15 mm x 15 mm x 5 mm USA e getta l'incorporamento di muffa. Orientare la coclea sul suo lato in modo che sia parallela alla parte inferiore dello stampo incorporamento, come descritto da Whitlon et al. ¹⁴
3. Collocare immediatamente lo stampo sul ghiaccio secco per solidificare il OCT e conservare a-80 ° C durante la notte.
4. Immergere i vetrini microscopio in 0,01% Poly-L lisina a temperatura ambiente per 30 min. Remove le diapositive, non sciacquare e lasciar asciugare durante la notte. Utilizzare queste diapositive per cryosections.
5. Rimuovere la coclea in ottobre dal congelatore-80 ° C e posizionarlo sul ghiaccio secco. Utilizzando una lama tagliente microtomo (L x w: 80 mm x 8 mm, spessore 0,25 mm, angolo di taglio di 34 °), sezione i blocchi OCT a 10 µm utilizzando un criostato a-30 ° C. Inserire due sezioni per ogni diapositiva.
6. Refrigerare diapositive a 4 ° C al termine.

5. Immunohistochemistry

1. Porre i vetrini in un vetrino per microscopio vaschetta di colorazione in un portavetrini. Riempire il piatto con 350 mL di 1X PBS e lavare i vetrini per 5 min tre volte a temperatura ambiente.
2. Rimuovere le diapositive dal piatto e asciugare la zona che circonda il tessuto utilizzando un panno asciutto, facendo attenzione a non asciugare il tessuto.
   1. Utilizzando una penna di blocco liquida, disegnare un cerchio intorno alla sezione di tessuto.
3. Bloccare il tessuto per 1 h a temperatura ambiente mediante l'aggiunta di 150 µ l di soluzione bloccante contenente siero normale 10% (asino), detergente non ionico 1% e 1% BSA in PBS 1X.
4. Tocca Disattiva soluzione bloccante in eccesso e incubare il tessuto durante la notte a 4 ° C in una camera umidificata con 150 µ l di siero normale 10% (asino), 0,1% detergente non ionico e anticorpo primario (vedere la nota qui sotto) in PBS 1X.
   Nota: Per i seguenti anticorpi, queste diluizioni sono state usate: per Figura 2 e 3, p-STAT1 Ser⁷²⁷ 1: 300. Figura 4, p-STAT1 Ser⁷²⁷, 1: 100 e 1: 100 TRPV1.
5. Porre i vetrini in del vetrino per microscopio vaschetta di colorazione in un portavetrini. Riempire il piatto con 350 mL di 1X PBS e lavare tre volte i vetrini per 5 min a temperatura ambiente.
6. Incubare con gli anticorpi secondari diluiti in una soluzione contenente detergente nonionico 0,01% e siero di 10% normale (asino) in PBS 1X per 2-3 h a temperatura ambiente in una camera umidificata al buio.
   Nota: Per i seguenti anticorpi secondari, queste diluizioni sono state usate: per Figura 2 e 3, 1:600 asino anti-coniglio IgG. Per Figura 4, rodamina (TRITC) asino Anti-Rabbit IgG 1: 500 e asino anti-capra IgG 1: 500.
7. Porre i vetrini in del vetrino per microscopio vaschetta di colorazione in un portavetrini. Riempire il piatto con 350 mL di 1X PBS e lavare tre volte i vetrini per 5 min a temperatura ambiente.
8. Toccare il liquido in eccesso dal vetrino e far asciugare il vetrino con un panno asciutto intorno al tessuto. Montare diapositive aggiungendo una goccia dell'agente montaggio con DAPI direttamente sul tessuto. Lentamente, adagiarvi il vetrino coprioggetto, assicurando che nessun bolle si formano di sotto e lasciare i vetrini curare una notte a temperatura ambiente al buio. Archivio diapositive a 4 ° C.
9. Diapositive di immagini usando la microscopia confocal. Utilizzare il laser per l'imaging come segue: laser UV per DAPI, 488 nm del laser per asino anti-coniglio IgG e 543 nm laser per rodamina TRITC.

Risultati

ABR risposte misurate in ratti a tre giorni dopo somministrazione di cisplatino hanno mostrato un'elevazione significativa in soglie. Elevazione di queste soglie è stata ridotta significativamente in ratti amministrati con trans-timpanico [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), adenosina un₁ recettore agonista¹⁵, prima del cisplatino. La specificità dell'azione del R-PIA presso l'adenosina un ricevitore₁ è sta...

Discussione

La via di somministrazione trans-timpanico permette per consegna localizzata di farmaci e di altri agenti alla coclea che altrimenti potrebbe produrre effetti collaterali sistemici significativi se somministrato per via sistemica. Questo metodo di somministrazione del farmaco consente l'accesso rapido di farmaci al sito d'azione alle dosi significativamente più alto di quello che potrebbe essere raggiunto attraverso la via sistemica. Risultati qui presentati e pubblicati precedentemente mostravano che trans-timpanico ge...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120