Ototoxicity의 치료에 대 한 트랜스-귀 약물 전달

요약

우리는 달팽이 관에 트랜스 귀 경로 통해 약물의 지역화 된 관리 기법을 제시. Cisplatin 같은 화학요법 약물의 항 암 효능이이 경로 통해 약물 전달 방해 하지 것 이다.

초록

약물 유발 ototoxicity 치료 보호 에이전트의 체계적 관리는 이러한 보호 에이전트의 기본 약물 화학요법 효능 방해할 수 가능성에 의해 제한 됩니다. 이것은 특히 그의 제 행동 청각 상실에 대 한 적절 한 보호를 제공 하는 항 산화에 의해 감쇠는 약 cisplatin에 대 한 사실입니다. 다른 현재 또는 잠재적인 otoprotective 에이전트는 체계적으로 관리 하는 경우 비슷한 문제를 내포할 수 있습니다. 달팽이 관에 직접 다양 한 체액 또는 보호 에이전트의 응용 프로그램 로컬 제한 조직의 부작용으로 이러한 에이전트의 높은 수준에 대 한 수 것입니다. 이 보고서는 달팽이 관에 기초 과학 연구를 강화 하 고 클리닉에서 otoprotective 에이전트의 사용을 감독의 간단한 방법을 제공 하는 달팽이 관에 다양 한 약물 또는 생물학적 시 약의 납품의 트랜스-귀 방법 보여 줍니다. 이 보고서 트랜스 귀 약물 전달의 방법 하 고 어떻게이 기술은 성공적으로 실험 동물에서 치료에 사용 되었습니다 cisplatin ototoxicity의 예제를 제공 합니다.

서문

주변 청각 시스템 같은 cisplatin 및 aminoglycoside 항생제 약물에 절 묘하게 과민 하다. Cisplatin은 단단한 종양, 난소, 고환, 머리 등의 다양 한 치료에 대 한 널리 사용 되는 화학요법 에이전트와 목 암. 이 약의 사용에 익숙한 ototoxicity은 복용량 제한 그리고 흔히¹치료 환자의 75-100%에 영향을 미치는. Carboplatin oxaliplatin, 등 다른 약 cisplatin^2,3,,45, 대 안으로 등장 하지만 그들의 유용성은 몇 가지 암에 제한 됩니다.

초기 연구 cisplatin 및 aminoglycosides 제작한 ototoxicity 중재에 반응성 산소 종 (선생님)의 중요 한 역할을 보여왔다. 후속 연구 보여주었다 NADPH 산화 효소의 NOX3 isoform는 달팽이 관에서 선생님의 기본 소스 이며, cisplatin^6,7에 의해 활성화 됩니다. 선생님 타협의 세대 선도 셀의 용량을 버퍼링 하는 항 산화⁸세포 막 지질 과산화를 증가 했다. 또한, cisplatin 매우 독성 알데하이드 4-hydroxynonenal (4-HNE), 세포 죽음^9,10의 초기자를 생성 하는 수 산 기 급진 파의 생산을 증가 시킵니다. 이러한 결과에 따라, 여러 가지 항 산화 cisplatin ototoxicity의 치료에 대 한 조사가 되어 있습니다. N-아 세 틸 시스테인 (NAC), 나트륨 thiosulfate (STS), amifostine, 및 D-메티오닌 포함 됩니다. 그러나, 항 산화 요법의 중요 한 관심사는 이러한 항 산화 cisplatin 화학요법 효능¹¹ cisplatin의 항 산화 분자의 thiol 그룹 상호 작용을 통해 체계적으로 관리 하는 경우를 줄일 수 있습니다.

항 산화 치료와 함께 이러한 문제에 비추어이 연구의 목표는 청력 손실을 줄이기 위해 달팽이 관에 산화 방지 제 및 기타 약물 전달의 트랜스 귀 경로 검사 했다. 약물 및 짧은 방해 (si) RNA, 아래 설명의 트랜스 귀 경로 특히 유망 나타납니다.

프로토콜

남성 Wistar 쥐 했다 건강의 국가 학회 동물에 따라 처리 지침 및 남부 일리노이 대학 학교의 약 실험실 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용 합니다. 청각 brainstem 응답 (ABR) 트랜스 귀 약물 전달의 효과 확인 하기 위해 의약품 안전 청 및 후 72 h 전에 마 취 동안 쥐에서 수행 되었다.

1. 청각 Brainstem 응답 (ABR)

참고: ABR 측정 청각 테스트 장비 및 소프트웨어를 사용 하 여 수집 되었다. ABR 나타냅니다 갖는 잠재력 또는 8 번째 두개골 신경에 의해 생성 된 높은-주파수 파도 (물결 I 및 II) 및 anteroventral 달팽이 핵 (wave III), 측면 lemniscus (파 4), 고 열 등을 포함 한 다른 더 높은 청각 뇌 구조 colliculus (파도 V)입니다. 이 파도 대기 시간에 따라 구분 됩니다. ABR 측정¹²위에서 설명한 대로 수행 했다.

1. 90 밀리 그램/kg 케 타 민 및 17 mg/kg xylazine 통해 복 주입의 혼합물으로 쥐 anesthetize 발가락-핀치 반사를 통해 마 취의 깊이 확인 합니다. 건조에서 눈을 방지 하 여 마 취 동안 궤를 피하기 위해 두 눈 안과 윤 활 (또는 미네랄 오일 방울) 적용 됩니다.
2. 쥐 제어 음향 부스 내부 난방 패드 (37 ° C)에서 발생 하기 쉬운 위치에 놓습니다. Audiology 테스트 장비는 외부와 부스 옆에 있습니다.
3. 따라 스테인리스 전극 삽입: 후면에서 지상 전극 측면, 두개골, 위에 직접 두 귀와 각 귀의 pinna 아래 부정적인 전극 사이 긍정적인 전극.
4. 음향 자극 높은-주파수 변환기를 사용 하 여 8, 16 및 32 kHz에서 5 미터 톤 버스트로 적용 됩니다. 데시벨 음압 수준 (dB SPL)으로 자극 강도 결정 합니다. 이 10 dB SPL에서 시작 하 고 10 dB 스텝 크기와 90 dB SPL에 도달. 전류 정밀 사운드 레벨 측정기를 사용 하 여 90 dB SPL의 최대 출력을 사운드 농도 보정.
   참고: 테스트 결과 주변 청각 기관, 달팽이 관, 및 상기 청각 구조 무결성의 표시를 제공합니다. 자극 입력의 15 ms 이내 파형 생성 및 파도의 대기 시간에는 세 가지 중요 한 요소에 의해 규제 전도 시간에 따라 달라 집니다: 두뇌, 강도, 그리고 소리의 주파수의 볼륨. 청각 evoked 후보는 제조업체에서 제공 하는 소프트웨어를 사용 하 여 기록 되었다.
5. 눈에 띄게 임계값으로 0.5 µ V 진폭의 두 개의 서로 다른 파형 (II 및 III)를 보여주고 있습니다 최소 강도를 고려 하십시오.
   참고: 임계값 shift 측정 후 치료 치료 전에 얻은 임계값과 비교 하는 임계값에 차이 나타냅니다.

2. 트랜스-귀 주사

1. 트랜스 tympanically 약물 관리, 왼쪽된 옆 decubitus 위치에 쥐를 배치 합니다.
   1. 2.5 m m 일회용 귀 경은 외가도에 삽입 합니다.
   2. 수술 범위를 사용 하 여는 경은 위치 봐서 고 막 표시 됩니다.
   3. [R]-N-페 닐 이소프로필 아데노신의 50 µ L를 세우는 29 G X ½, 0.5 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 (R-피아) 솔루션 (1 µ M), 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX) 솔루션 (3 µ M), 또는 (5 단위) 주사를 siRNA 솔루션 (0.9 µ g).
   4. 경은 사용 하 여 직접 봐서 고 막의 앞쪽 열 등 한 지역에 바늘.
   5. 바늘 구멍을 막 찌를 하 고 1.2.3에서 언급 한 약 관리. 허용 15 분 동안이 자리에 쥐.
      참고: 50 µ L 봐서 고 막 뒤에 맞게 적절 한 볼륨 이어야 합니다. 아니 유체 관리 후 외가도에 있어야 한다.
   6. 오른쪽 옆 decubitus 위치와 다른 귀에 관리 단계 1.2.5 통해 1.2.1 반복에 쥐를 놓습니다.
2. 37 ° c.에가 열 패드에 부정사 위치에 쥐 쥐 intraperitoneally cisplatin를 수신에 대 한 배치
   1. 21 G X 3/4를 사용 하 여 나비 바늘 (12"길이 튜브), cisplatin (11 mg/kg, 멸 균 인산 염 버퍼 염 [PBS]에서 1 mg/mL 해결책)를 그립니다.
   2. 주사기 펌프를 사용 하 여, 복 주사 30 분 이상 통해 cisplatin (1 mg/mL)를 관리 합니다.
      참고: 250 g 쥐 볼륨 2.75 mL 분 당 약 0.1 mL의 속도로 있을 것 이다.
3. 이러한 절차를 통해 마 취의 깊이 모니터링을 계속 합니다. Cisplatin 관리 완료 되 면 확인 아무것도 그것의 호흡을 방해 하는 경향이 위치에 장에 다시 쥐를 놓습니다.
4. 완전히 복구 될 때까지 쥐를 모니터링 합니다.

3. 달팽이 관의 해 부 및 Decalcification

1. (72 h) 후 최종 ABR 다음 90 mg/kg 케 타 민 및 17 mg/kg xylazine 통해 복 주입의 혼합물으로 쥐를 anesthetize. 발가락-핀치 반사와 마 취를 확인 합니다. 잘린 쥐를 통해 안락사
2. 앞에서 설명한¹³측 뼈 밖으로 해 부.
3. (완전히 덮고 달팽이 관) 7 mL 유리 섬광 유리병에 PBS 솔루션 x 1에서 4 %paraformaldehyde 달팽이 관을 배치 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 냉장 보관 Paraformaldehyde 제거 하 고 실 온에서 1 x PBS로 세척.
4. PBS를 제거 하 고 EDTA (pH 7.3)의 120 mM 솔루션 튜브를 완전히 채워. 실내 온도에서 회전자에 놓고 매일 EDTA 솔루션을 변경 하는 2 ~ 3 주에 대 한 decalcification를 허용 합니다.

4입니다. Cryosectioning

1. Decalcification 완료 되 면 완전히 4 ° c: 10% 자당, 자당 20%, 20% 자당 및 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물 포함의 1:1 혼합물에서 24 h에 대 한 다음 솔루션 (각 7 mL)에 달팽이 관을 담가.
2. 신선한 10 월 장소를 완전히 커버는 15 m m x 15 m m x 5 m m 금형 포함 일회용에 달팽이 관을 복합. Whitlon 외에 설명 된 대로 포함 형의 바닥에 평행 하 게 되도록 옆에 달팽이 관을 방향을 정하십시오. ¹⁴
3. 즉시 OCT를 공고히 하 고 하룻밤-80 ° C에서 저장을 드라이 아이스에 금형을 놓습니다.
4. 0.01%에 현미경 슬라이드를 담가 30 분 제거에 대 한 실 온에서 폴 리-L Lysine 슬라이드, 린스, 없고 건조 하룻밤 허용. 이 슬라이드를 사용 하 여 cryosections에 대 한.
5. -80 ° C 냉동 실에서 10 월에 달팽이 관을 제거 하 고 드라이 아이스에 배치. 날카로운 톰 블레이드 (승: 80 m m x 8 m m, 두께 0.25 m m, 34 °의 절단 각도 x L)를 사용 하 여 섹션에서 10 µ m-30 ° c.에 있는 cryostat를 사용 하 여 OCT 블록 슬라이드 당 두 개의 섹션을 배치 합니다.
6. 슬라이드 끝나면 4 ° C에서 냉동.

5입니다. Immunohistochemistry

1. 슬라이드 선반에 접시를 얼룩 유리 현미경 슬라이드에서 슬라이드를 놓습니다. 1 x PBS의 350 mL와 함께 요리를 실 온에서 5 분에 대 한 슬라이드 세 번 세척.
2. 접시에서 슬라이드를 제거 하 고 주변 조직을 건조 하지 않도록 되 고 건조 닦아 사용 하 여 조직에서 건조.
   1. 액체 차단 펜을 사용 하 여, 조직 섹션 주위에 원을 그립니다.
3. 실 온에서 1 h에 대 한 조직 차단 솔루션 10% 정상 (당나귀) 혈 청, 1% 비 세제, 그리고 1 x PBS에서 1 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 차단 합니다.
4. 초과 차단 솔루션을 누르고 10% 정상 (당나귀) 혈 청, 0.1% 비 세제, 그리고 1 차적인 항 체 (아래 참고 참조)의 150 µ L와 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤 조직 품 어 1 x PBS에.
   참고: 다음 항 체에 대 한 이러한 희석 사용 되었다: 그림 2 , 3, p STAT1 Ser⁷²⁷ 1:300. 그림 4, p STAT1 Ser⁷²⁷, 1: 100, TRPV1 1: 100에 대 한
5. 슬라이드 선반에 접시를 얼룩 유리 현미경 슬라이드에서 슬라이드를 놓습니다. 1 x PBS의 350 mL와 함께 요리를 실 온에서 5 분에 대 한 슬라이드 세 번 씻어.
6. 0.01% 비 세제와 어둠의 습도 챔버에 실 온에서 2 ~ 3 h에 대 한 1 x PBS 혈 청 10% 정상 (당나귀)를 포함 하는 솔루션에 희석 보조 항 체와 함께 품 어.
   참고: 다음 2 차 항 체에 대 한 이러한 희석 사용 되었다: 그림 2 와 3, 1:600 당나귀-토끼 IgG에 대 한. 그림 4, Rhodamine (TRITC) 당나귀-토끼 IgG 1: 500 및 당나귀 안티 염소 IgG 1: 500.
7. 슬라이드 선반에 접시를 얼룩 유리 현미경 슬라이드에서 슬라이드를 놓습니다. 1 x PBS의 350 mL와 함께 요리를 실 온에서 5 분에 대 한 슬라이드 세 번 씻어.
8. 슬라이드, 초과 액체 누르고 조직 주위 건조 닦아와 슬라이드를 건조 합니다. DAPI는 조직에 직접 장착 에이전트의 한 방울을 추가 하 여 슬라이드를 탑재 합니다. 천천히는 coverslip 보장 없는 거품 밑에, 형성 된다 위에 놓고 어둠 속에서 실 온에서 하룻밤 치료 슬라이드를 허용 합니다. 4 ° c.에 슬라이드 저장
9. Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 슬라이드 이미지. 레이저를 사용 하 여 다음과 같이 이미징에 대 한: DAPI, 당나귀-토끼 IgG, 488 nm 레이저 및 543 nm 레이저 rhodamine TRITC UV 레이저.

결과

ABR 응답 측정 쥐 3 일 다음 cisplatin 관리 임계값에 상당한 상승 했다. 이러한 임계값 상승 쥐 트랜스 귀 [R]-N-phenylisopropyladenosine 관리에 크게 감소 했다 (R-피아), 아데노신₁ 수용 체 주 작동 근¹⁵, cisplatin 이전. R의 행동의 특이성-₁ 수용 체는 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX), A₁ 관련 수용 체 길 항 제^16<...

토론

트랜스-귀 관리 경로 수 그렇지 않으면 부작용을 생산 중요 한 조직의 체계적으로 관리 하는 경우는 달팽이 관에 약물 및 기타 에이전트의 지역화 된 배달 수 있습니다. 의약품 안전 청의이 방법은 조직의 경로 통해 달성 될 것 보다 훨씬 더 높은 복용량에서 행동의 사이트에 약물의 급속 한 액세스할을 수 있습니다. 여기에 제시 하 고 출판 결과 이전 보여주었다 [R]-N-페 닐 이소프로필 아데?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120