Транс барабанные лекарств для лечения ототоксичность

Резюме

Мы представляем технику для локализованных отправления наркотиков через транс барабанные маршрут в улитке. Доставка лекарств через этот маршрут не будет мешать эффективность противораковых химиотерапевтических препаратов, таких как цисплатин.

Аннотация

Системного администрирования защитных агентов для лечения лекарственно индуцированные ототоксичность ограничивается возможность, что эти защитные агенты могут вмешиваться химиотерапевтических эффективность основных препаратов. Это особенно верно для наркотиков цисплатин, чьи действия противоопухолевых являются аттенуированных антиоксидантов, которые обеспечивают адекватную защиту от потери слуха. Других текущих или потенциальных otoprotective агентов может представлять подобную проблему, если управление системно. Применение различных биологических или защитных агентов непосредственно к улитки позволит высокий уровень этих агентов локально ограниченных системных побочных эффектов. В настоящем докладе мы демонстрируем транс барабанные метод доставки различных наркотиков или биологических реагентов улитки, которая должна укрепить основные научные исследования на улитки и предоставляют простой способ направления использования otoprotective агентов в клиниках. В настоящем докладе подробно метод доставки транс барабанные лекарств и приводятся примеры того, как этот метод успешно использовался в подопытных животных для лечения цисплатином ототоксичность.

Введение

Периферического отдела слуховой системы изысканно чувствительна к наркотикам как цисплатин и аминогликозидами антибиотики. Цисплатин является широко используемым химиотерапевтического агента для лечения целого ряда солидных опухолей, например, яичников, яичек и головы и шеи рак. Ототоксичность опытных с использованием этого препарата дозу ограничения и довольно часто, затрагивающие 75-100% больных лечение¹. Другие препараты, такие как карбоплатин и Оксалиплатин, появились как альтернативы цисплатин^2,3,4,5, однако их полезность ограничена несколько рака.

Ранние исследования показали важную роль реактивнооксигенных видов (ров) в посредничестве ототоксичность, цисплатина и аминогликозидов. Последующие исследования показали, что NOX3 изоформы NADPH оксидаза является основным источником рос в улитке и управляется цисплатин^6,7. Поколение ROS компромиссов антиоксидантной способности клеток, приводит к буферизации увеличилась перекисного окисления липидов клеточных мембран⁸. Кроме того цисплатин увеличивает производство гидроксильных радикалов, которые генерируют высокотоксичных альдегид 4-hydroxynonenal (4-HNE), инициатор клеток смерть^9,10. Основываясь на этих выводах, были рассмотрены несколько антиоксидантов для лечения цисплатином ототоксичность. К ним относятся N-ацетил-цистеин (NAC), натрия тиосульфат (STS), Амифостин и D-метионина. Однако серьезную озабоченность антиоксидантной терапии является, что эти антиоксиданты могут уменьшить цисплатин химиотерапии эффективность при приеме системно¹¹ через взаимодействие цисплатина с тиоловых групп в молекулах антиоксидант.

С учетом этих проблем с антиоксидантной терапии цель данного исследования заключалась в изучении транс барабанные маршрут доставки антиоксидантов и других препаратов улитки сократить потери слуха. Транс барабанные маршрут наркотиков и короткие вмешательства (Си) РНК, описанные ниже, представляется особенно многообещающим.

протокол

Руководящие принципы и протоколом, утвержденным Южного Иллинойса университета Школа медицины лабораторных животных ухода и использовать Комитет использовать мужской Wistar, которую крыс были обработаны в соответствии с национальными институтами здоровья животных. Ответ слуховой ствола мозга (ABR) была исполнена на крысах при под анестезией до введения препарата и 72 ч после проверить эффект транс барабанные лекарств.

1. слуховые мозга ответ (ABR)

Примечание: ABR измерения были собраны с использованием слухового тестирования оборудования и программного обеспечения. ABR представляет вызванные потенциалы или высокочастотных волн, генерируемых восьмого черепного нерва (волны I и II) и других выше слуховой мозг стволовых структур, включая улитковый ядра anteroventral (волна III), боковые lemniscus (волна IV) и уступает colliculus (волна V). Эти волны дифференцированы в зависимости от задержки. ABR измерения были выполнены как описано ранее¹².

1. Анестезировать крыс с смесь 90 мг/кг кетамина и 17 мг/кг Ксилазина через внутрибрюшинной инъекции. Подтвердите глубины анестезии через мыс щепотка рефлекс. Применить глазные смазки (или минеральное масло капли) в оба глаза, чтобы предотвратить высыхание глаза и избежать изъязвления во время анестезии.
2. Место крыса в лежачем положении на грелку (37 ° C) внутри контролируемой акустической стенд. Испытательное оборудование аудиологии находится вне и рядом стенд.
3. Вставить электродов из нержавеющей стали соответственно: земли электрода в тылу пашины, положительный электрод между двух ушей прямо на вершине черепа и отрицательные электроды ниже Пинна каждого уха.
4. Примените акустических стимулов, с помощью высокочастотных преобразователей как взрыв тона 5 мс на 8, 16 и 32 кГц. Определение интенсивности стимула как уровень звукового давления в децибелах (дБ SPL). Это начинается в 10 дБ SPL и достигает 90 дБ SPL с размером 10-dB шаг. Калибровки звука интенсивности для максимальной мощностью 90-dB SPL с помощью импульсной точности измеритель уровня звука.
   Примечание: Результат теста дает представление о целостности органа периферического слуха, улитки и вышеупомянутые слуховой структур. Сигналы генерируются в течение 15 мс стимул ввода и задержка волн зависит от проводимости время, которое в свою очередь регулируется от трех важнейших факторов: объем мозга, интенсивности и частоты звука. Слуховых вызванных потенциалов были записаны с помощью программного обеспечения, поставляемого изготовителем.
5. Рассмотрим минимальной интенсивности, которая может вызвать два различных сигналов (II и III) 0.5 мкВ амплитуды как порог видное место.
   Примечание: Сдвиг порога представляет собой разницу в порог, измеренная после лечения по сравнению с порога, полученные до начала лечения.

2. Транс барабанные инъекции

1. Чтобы препарат транс tympanically, место крыса в положение левой боковой пролежни.
   1. Вставьте 2,5 мм Одноразовые ушные Корнцанги в ушной канал.
   2. С использованием хирургического область позиция корнцанги, так что барабанная перепонка видна.
   3. С помощью 29 G X ½, шприц 0,5 мл инсулина, составить 50 мкл [R] - N - фенил изопропиловый аденозина (R-Пиа) раствор (1 мкм), 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) раствора (3 мкм) или siRNA раствор (0,9 мкг) для вставки (5 единиц).
   4. Используйте Корнцанги направлять иглу в регионе передней нижней барабанной перепонки.
   5. Засуните отверстие через мембрану с иглой и назначать лекарственные средства, упомянутые в 1.2.3. Разрешить крысы на отдых в этом положении в течение 15 мин.
      Примечание: 50 мкл должна быть адекватной тома помещалось барабанной перепонки. Не жидкость должна быть в канал уха после администрации.
   6. Место крыса в правой боковой пролежни позицию и повторите шаги 1.2.1 через 1.2.5 для администрации в другом ухе.
2. Для крыс, получавших цисплатин внутрибрюшинно место крыса в лежачем положении на грелку на 37 ° C.
   1. С помощью 21 G X 3/4 Бабочка иглы (12" длиной трубы), составить цисплатин (11 мг/кг, 1 мг/мл раствора в стерильных фосфатный буфер [PBS]).
   2. С помощью насоса шприца, администрировать цисплатин (1 мг/мл) через внутрибрюшинной инъекции более 30 мин.
      Примечание: Крыса 250г объем будет 2,75 мл со скоростью примерно 0,1 мл / мин.
3. Продолжать следить за глубины анестезии на протяжении этих процедур. После завершения цисплатин администрация место крыса обратно в клетке в лежачем положении, убедившись, что нет ничего, чтобы воспрепятствовать ее дыхание.
4. Контролировать крыс до тех пор, пока полностью выздоровел.

3. улитки диссекции и декальцинации

1. После окончательного ABR (после 72 ч) анестезировать Крыса с смесь 90 мг/кг кетамина и 17 мг/кг Ксилазина через внутрибрюшинной инъекции. Подтвердите анестезии с ног щепотка рефлекс. Усыпить крыс через обезглавливание.
2. Проанализируем, височной кости, как описано ранее,¹³.
3. Место улитки в параформальдегида 4% в 1 x PBS решение в пузырек 7-ОД стеклом сцинтилляционные (полностью охватывающих улитки). Поставить в холодильник на ночь при 4 ° C. Удаление параформальдегида и мыть с ПБС при комнатной температуре.
4. Удаление PBS и полностью заполнить трубу с 120-мм раствором ЭДТА (рН 7.3). Место на вращателе при комнатной температуре и позволяют декальцинации для 2-3 недели, изменив решение ЭДТА ежедневно.

4. Cryosectioning

1. По завершении декальцинации полностью погрузите улитки в следующие решения (7 мл) на 24 ч в 4 ° C: 10% сахарозы, 20%-ая сахароза, 1:1 смесь 20%-ая сахароза, и оптимального раскроя температуры (OCT) внедрение комплекса.
2. Место свежие октября соединения для заполнения и полностью покрывают улитки в 15 x 15 мм x 5 мм одноразовые, встраивание формы. Ориентируйте улитки на его стороне, так что это параллельно нижней части встраивание формы, как описано в Whitlon и др. ¹⁴
3. Сразу же место плесень на сухой лед в OCT и храните при температуре-80 ° C на ночь.
4. Погружать Микроскоп слайды в 0.01% поли-L-лизин при комнатной температуре за 30 мин удалить слайды, не промыть и позволяют для высыхания на ночь. Используйте эти слайды для cryosections.
5. Удаление улитки в октября из морозильной камеры-80 ° C и поместите его на сухой лед. Используя острые микротом лезвия (L x ш: 80 мм x 8 мм, толщиной 0,25 мм, угол резки 34 °), раздел OCT блоков на 10 мкм, с использованием криостата при-30 ° C. Место два раздела на слайд.
6. Охладите слайды на 4 ° C, когда закончите.

5. иммуногистохимии

1. Место слайды в стекло микроскопа, окрашивание блюдо на коммуникационном слайд. Заполнить блюдо с 350 мл ПБС и мыть слайды для 5 минут три раза при комнатной температуре.
2. Удаление слайдов из блюдо и высушить область, окружающие ткани, с помощью сухой очистки, будучи не забудьте высушить ткань.
   1. С помощью жидкого блокировки ручки, нарисуйте круг вокруг секции ткани.
3. Блокировать ткани на 1 ч при комнатной температуре, добавляя 150 мкл блокирования решения, содержащие 10% нормальной (осел) сыворотки, 1% неионогенных моющего средства и 1% BSA в однократном ПБС.
4. Кран избыток блокирования решения и инкубировать ткани на ночь при 4 ° C в камере увлажненный с 150 мкл 10% нормальной (осел) сыворотки, 0.1% неионогенных моющего средства, и основное антитело (см. Примечание ниже) и в однократном ПБС.
   Примечание: Для следующих антител, использовались эти разведения: Рисунок 2 и 3, p-STAT1 Ser⁷²⁷ 1: 300. Рисунок 4, p-STAT1 Ser⁷²⁷, масштаба 1: 100 и 1: 100 TRPV1.
5. Место слайды в стекло микроскопа, окрашивание блюдо на коммуникационном слайд. Заполнить блюдо с 350 мл ПБС и мыть слайды 5 минут три раза при комнатной температуре.
6. Проинкубируйте с вторичные антитела, разбавленный раствор, содержащий неионогенные 0,01% моющего средства и 10% нормальной (осел) сыворотки в однократном ПБС для 2-3 ч при комнатной температуре в камере увлажненный в темноте.
   Примечание: Для следующих вторичные антитела, использовались эти разведения: Рисунок 2 и 3, осел анти кролик IgG 1: 600. На рисунке 4родамин (TRITC) осла анти кролик IgG 1: 500 и осел анти коза IgG 1: 500.
7. Место слайды в стекло микроскопа, окрашивание блюдо на коммуникационном слайд. Заполнить блюдо с 350 мл ПБС и мыть слайды 5 минут три раза при комнатной температуре.
8. Коснитесь значка лишнюю жидкость со слайда и сухой слайд насухо вокруг ткани. Смонтируйте слайды, добавив одну каплю установки агента с DAPI непосредственно на ткани. Медленно место coverslip на вершине, обеспечивая, что нет пузырьков образуются под и позволяют слайды для лечения на ночь при комнатной температуре в темноте. Хранить слайды при 4 ° C.
9. Изображения слайдов с помощью конфокальной микроскопии. Использование лазеров для визуализации следующим: УФ лазер для DAPI, 488 нм лазер для осла анти кролик IgG и 543 Нм лазер для родамин TRITC.

Результаты

ABR ответы измеряется в крыс на три дня следующей администрации цисплатин показал значительное повышение в пороговых значений. Высота этих порогов был значительно сокращен в крыс с транс барабанные [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-Пиа), аденозин₁ рецептора агонисто...

Обсуждение

Транс барабанные администрирования маршрут позволяет для локализованных доставки наркотиков и других агентов улитки, которые могли бы в противном случае производят значительные системные побочные эффекты, если управление системно. Этот метод введения препарата позволяет быстрый до...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120