全身麻醉下小鼠幸福度的系统评价

摘要

我们制定了一个协议, 以评估小鼠的福祉在程序中使用全麻。分析了一系列的行为参数, 说明了幸福水平和糖皮质激素代谢产物。该议定书可作为一般援助, 以科学的、以动物为中心的方式估计严重程度。

摘要

根据罗素和科里开发的3R 原理 (替换、还原、细化), 科学研究应尽可能使用动物实验的替代品。如果不能替代动物实验, 那么所使用的实验动物总数应该是获取有价值数据所需的最低数量。此外, 应采用适当的细化措施, 以尽量减少伴随实验程序的痛苦、痛苦和痛苦。用于分类疼痛、痛苦和痛苦程度的类别是不恢复的、轻度的、中等的或严重的 (欧盟指令 2010/63)。要确定哪些类别适用于个别案例, 使用科学的声音工具是至关重要的。

这里提出的幸福评估协议是为使用全麻的程序设计的。该协议的重点是家庭笼活动, 鼠标鬼脸规模, 和奢侈行为, 如穴居和巢建筑行为作为福祉的指标。它也使用自由探索范式的特质焦虑相关行为。粪便皮质酮代谢物作为急性应激指标的测量在24小时后麻醉期间。

该议定书提供了有关全麻后小鼠的福祉的科学可靠的信息。由于其简单性, 该协议可以很容易地被修改和集成在一个计划的研究。虽然它没有提供一个规模, 根据欧盟指令2010/63 分类的苦恼, 它可以帮助研究人员估计一个程序的严重性程度, 使用科学的声音数据。它提供了一种以科学、动物为中心的方式来改进对幸福的评估的方法。

引言

欧盟指令 2010/63¹规定, 每当需要动物试验时, 由罗素和2开发的3R 原理 (替换、还原、细化) 将被应用.欧盟指令的最终目标是逐步淘汰所有动物试验, 但该指令承认, 目前还需要一些动物实验来进行研究, 以保护人类和动物的健康。因此, 如果动物实验不能被任何替代方法所取代, 只有最小数量的实验动物被用来获得可靠的结果。此外, 使用适当的细化措施, 应尽量减少伴随实验程序的疼痛、痛苦和苦恼的数量。欧盟指令2010/63 规定, 过程的严重性必须前瞻性归类为非恢复、温和、适度或严重的¹。由于严重性分类是根据个案来决定的, 因此有科学的声音工具来估计给定过程的严重性是很重要的。

根据莫顿和格里菲斯的建议, 评分表³是检测任何偏离正常状态的重要工具, 包括对福祉⁴的负面影响。评分表用于回顾性地确定由实验引起的疼痛、痛苦和苦恼, 并着重于个体动物 (例如、体重、皮毛、步态) 的物理状态的可见变化。虽然, 欧盟指令2010/63 的附件八提供了每个严重性类别的例子, 但研究人员仍然缺乏利用科学基础的数据来估计给定程序严重性程度的工具。

缺乏显示消极福祉的指标并不是确定动物状况的唯一方法;指向正福利的指示器的存在也很重要^{5、6、7、8}。例如, 动物只在满足所有基本需求时, 才会表现出诸如挖洞和筑巢等奢侈行为。如果减少了福利, 奢侈品行为首先会下降^5,7。用于评估福祉的议定书应包括指示动物生理、生理/生物化学和心理状态的指标, 以便以详细和全面的方式对其福祉进行评估⁹。

在改进的范围内, 制定了一项议定书, 以满足这些要求, 并评估一项涉及全麻对小鼠福祉的程序的影响¹⁰。同时, 目标是尽量减少任何额外的压力, 使协议易于集成到给定的实验中。该协议考虑穴居行为, 家庭笼行为, 如活动, 食物摄取, 和巢, 和特质焦虑相关的行为。此外, 还包括小鼠的鬼脸量表和粪便中皮质酮代谢物的无创性分析。该议定书的目的是促进以科学和动物为中心的方式评估福祉, 并提供支持严重程度分类的福祉信息。除了评分表之外, 它还可以为过程的严重性分类提供有用的信息。由于该协议易于执行且不需要广泛的设备, 因此可以将其集成到一个正在进行的实验中, 而不影响研究结果。应该指出的是, 动物研究: 报告的活体实验 (到达) 指南¹¹将在所有涉及动物实验的研究中观察到, 目的是改进设计、分析和报告。

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研究方案

这项研究是根据《德国动物福利法》规定的准则进行的, 并得到了柏林国家当局 ("Landesamt 并且一厢情愿和 Soziales") 的批准, 允许号码: G0053/15)。

注: 本议定书的主要目的是研究反复麻醉对糖皮质激素代谢物的影响。为了确定要使用的动物数量, 进行了一个样本大小计算: n ≥ 2 x (s/µ₁-µ₂)² x (z_α + z_β)²。µ₁-µ₂是指在其中进行功率和样本大小计算 (α = 5%, β = 80%) 的填充方式之间的差异; z_α = 1.96 和 z_β = 0.84 是标准正态分布的分位数。图 1说明了此协议的时间线。如果协议的参数显示与控制级别的差异, 应密切监视动物, 并在适当的时间后再测量参数。例如, 如果增加了特质焦虑相关行为, 则应在一周后再次测试此行为, 以帮助确定期间直到完全恢复。本协议中定义的时间点和周期可用于其他过程。在更改时间点时, 应按照协议中的说明来保留适应期。为了减少可能影响小鼠行为的因素, 需要进行更多操作的测试应在不干扰小鼠正常行为的试验后进行。图 2使用摘要计分单汇总了协议的所有测试。图 3提供了福利等级的简化刻度, 它概述了如何解释测试结果。

1. Habituating 老鼠处理的实验者

1. 允许老鼠习惯到动物设施至少2周后, 他们已经从其他设施或供应商获得。
2. 小鼠在小组和维护他们在标准条件下 (室温 22 2 °c; 相对湿度 55 * 10%) 在光: 黑暗的周期 12:12 h。
3. 为所有组提供隧道和棉花 nestlets 作为标准浓缩, 并提供食物和水的ad 随意。
4. 在测试¹²之前, 将所有鼠标习惯到隧道和/或杯处理至少一周。
   注意: 通过尾部拾取鼠标可以诱发压力或焦虑, 进而影响福祉, 也会对此协议¹²的结果产生影响。

2. 准备行为测试室和仪器

注意: 提供一个单独的测试空间, 最好是在保存动物的房间附近。在手术前至少60分钟将老鼠送到试验室。如果可能, 在执行该过程的同一测试室中进行本协议的所有测试。

1. 准备一个观察笼来测试穴居行为⁸ , 并拍摄照片, 以用于在 mg¹³ (图 4)。
   1. 使用一个玻璃盒, 建筑面积约220毫米 x 290 毫米, 高度为390毫米。
   2. 用大约0.5 厘米的寝具材料盖住这个盒子的地板。
   3. 在新的床上用品材料的顶部, 将一小部分使用过的床上用品从家庭笼子里撒出来, 以减少新环境造成的痛苦。
   4. 提供食物, 通常作为饮食和水供应的同类食品。
      注: 如有可能, 使用水瓶, 因为老鼠可以用床上用品填充水碗。
2. 为24小时观察期间准备一个保持架 (III 型: 420 毫米 x 260 毫米 x 150 毫米), 为其单独存放鼠标 (图 5)。
   注: 为了最大限度地减少个体住房的持续时间, 在这一时期收集巢楼行为、家庭笼活动、食物摄取和粪便皮质酮代谢物 (FCM) 的数据。
   1. 将新的床上用品材料放在笼中 (大约0.5 厘米深), 并在新材料的顶部分散一小部分使用过的寝具材料, 而不粪便从主笼上, 以减少遇险。
   2. 提供标准的方形棉 nestlet 的定义的重量, 作为环境浓缩仅 (参见材料表)¹⁴。
      注意: 商业 nestlets 的重量可能不同。因此, 我们修改了执事描述的 nestlet 的重量, 使用了 2.0 g 而不是 2.7 g¹⁴。
   3. 在保持架顶部安装红外线传感器时, 使用红外线传感器测量主笼活动 (请参阅材料表)。
   4. 提供食物, 通常作为饮食供应的同类, 和水ad 随意。

3. 鼠标鬼脸秤

注: 在观察笼中拍摄的三个时间点的照片: (i) 在程序前2天记录基线的标准, (ii) 30 分钟后的程序, 和 (iii) 150 分钟后的程序。当福利被削弱时, 他的分数就会增加。如果在150分钟后仍能观察到增加的。

1. 使用高清相机拍摄照片。
2. 将鼠标轻轻地转移到观察笼中, 让鼠标习惯到新的环境中至少30分钟。
3. 在 1-2 分钟内连续拍摄每段时间的 30-40 张照片。
4. 对所有照片进行排序, 选择尖锐的正面或侧面照片, 丢弃模糊的照片或照片, 显示鼠标面对从其他角度比正面或侧面的看法。
5. 从每个时间点随机选择一张照片, (即过程前2天, 程序后30分钟, 以及过程后150分钟) 为每个鼠标。
6. 裁剪照片以仅显示鼠标的头部, 以使正文位置不可见¹³。
7. 为每张照片创建一个电子表格文件, 并在每张纸上添加一个表, 包括五面部动作单元。
   注: 该文件包含基线照片和照片后的过程。
8. 随机化工作表的顺序。
9. 将计算机屏幕上的文件显示给三名独立人员, 这些人以前受过训练, 使用由兰福德et . 开发的 "特里", 并让他们用3点的比例 (0 = 不存在, 1 = 适度存在, 2 = 明显) 得分面部动作单位。目前)。
   注: 评分依据的是以下参数¹³: 轨道收紧 ("眶面积缩小, 眼睑紧密闭合或眼挤压");鼻子隆起 ("在鼻子的桥梁可看见的被圆的延伸皮肤);面颊凸起 ("面颊肌肉的凸的出现);耳朵位置 ("耳朵从基线位置分离和向后, 或具有垂直脊, 形成由于耳朵被拉回的提示");晶须变化 ("晶须从基线位置向后、正面或向前移动, 仿佛站在末端;胡须也可能聚集在一起 ")。
10. 分析分数, 如下所示 (从兰福德et 。¹³)。
    1. 平均所有的面部动作单位为每张照片, 以产生的 "中" 得分。
       注: 如果一个面部动作单位不能得分, 平均其余的面部动作单位。
    2. 减去平均值的基线照片从平均值的照片后的过程, 以获得一个不同的分数为每一个鼠标。
    3. 测试不同的人之间的差异评分 (非参数测试的相关样本)。
       注: 如果有显著差异 (p < 0.05), 确定是否所有照片的分数或只有几张照片的分数不同的人之间。如果后者是真的, 重复评分这些照片。否则, 这些人应该重复训练, 然后再拍照片。
    4. 如果所有的人的结果没有显著的差异, 平均每只老鼠的不同得分者的差异评分。
    5. 使用非参数统计检验, 比较研究组之间平均差异评分。

4. 穴居行为^8,15,16

1. 在标准不透明的塑料水瓶 (250 毫升, 150 毫米长度, 55 毫米直径, 45 毫米直径的瓶子颈) 上放置 140 "2 克" 的食物颗粒, 以此来准备洞穴⁸。
   注意: 小鼠喜欢宽管, 有68毫米直径的洞穴可以按照执事¹⁶的描述使用。
2. 在驯化的过程前5天, 将洞穴填满食物颗粒在笼子里。
   注意: 笼子里的常规食品分配单位不应该被清空, 但也应该留满食物颗粒, 因为老鼠已经习惯了。
3. 进行两次测试, 2 天前的程序 (基线);执行最后30分钟的开机自检程序。
   1. 让鼠标习惯至少30分钟的观察笼, 在那里拍摄的照片为的。
   2. 将塑料水壶装满与观察笼的后壁平行的食物小球。
   3. 在2小时后的洞穴中, 称食物颗粒 (g)。
4. 计算相对于初始重量的小鼠从洞穴中取出的食物颗粒的重量 (%)。

5. 24 小时观察期

注意: 老鼠单独安置, 如2.2 所述。(图 5), 为期24小时, 以测量食物摄取量、家庭笼活动、巢建筑行为和 FCM 水平。24 h 的观察发生两次: (一) 在程序开始之日前2天 (二)。

1. 食物摄取量
   1. 定期对老鼠进行称量 (例如麻醉前2天, 麻醉前、麻醉后2天、麻醉后的每周), 以评估体重的变化 (评分表的一部分)。
      注意: 体重需要计算每克体重的食物摄取量。在24小时观察期间也可以测量进水量。如果食物摄入量减少, 福利可能会受损。
   2. 确定笼中食物单位 (约100克) 所提供的标准食物饮食 (克) 的初始重量。
   3. 在24小时的观察期结束时确定标准饮食的重量。
   4. 仔细扫描食物单位下方的笼侧, 以便食物溢出, 并添加任何额外的食物颗粒, 发现食品颗粒剩余的食物单位的重量。
   5. 计算每单位体重的食物摄取量。
2. 家庭笼活动
   注: 以下说明是指使用红外线传感器 (请参阅材料表), 但家庭笼子活动也可以用其他程序评估。家庭笼活动从控制级别的偏差 (例如hypoactivity、多动症) 可能是幸福度受损的标志。
   1. 启动程序。
   2. 选择一个采样间隔为1分钟和一个采集时间为24小时, 这意味着脉冲记录每分钟24小时。
      注: 如果实验者在录制开始后几次进入房间, 则只使用句点中的数据, 当鼠标未受到干扰时 (即在黑暗期间)。
   3. 总结10分钟的脉冲间隔。
   4. 计算时间曲线下的区域 (脉冲 x min)。
3. 巢大厦行为
   注意: 复杂和高巢可以作为福祉的指标。
   1. 放置一个方形棉花 nestlet (参见材料表), 其定义的重量 (例如2.0 g) 在笼子中间。
   2. 根据执事¹⁴在第二天早晨, 大约2小时在光打开以后, 在5点刻度上评分巢 (如下所示)。权衡任何 untorn nestlet 件, 至少是最初 nestlet 重量的5%。将巢分如下¹⁴
      1. 如果90% 的 nestlet 完好无损, 则分配 "1" 分。
      2. 指定分数为 "2", 如果它是 50-90% 完好无损。
      3. 分配分数 "3", 如果 50-90% 的 nestlet 被粉碎。
      4. 分配评分 "4", 如果超过90% 被粉碎, 但巢是平的, 少于50% 的周长比鼠标身高时, 蜷缩起来。
      5. 分配评分 "5", 如果超过 90% nestlet 被撕碎和巢是高, 超过50% 的周长高于身高的一个卷曲的鼠标。
4. 粪皮质酮代谢物
   注意: 在控制水平以上的 FCM 的增加反映了24小时 postanesthetic 期间的急性应激水平。
   1. 在24小时观察期结束时使用镊子从笼中收集所有干粪丸, 并清除尿液中的湿颗粒。
   2. 提取 FCM 根据棕榈, et 等。¹⁷, 如下所示。
      1. 干燥粪样品在温度 60-70 °c。
      2. 用灰浆融汇粪便样品。
      3. 将0.05 克的整除与1毫升80% 甲醇在离心管中摇动, 在多涡上进行30分钟。
      4. 离心机样品在 2500 x g 15 分钟。
      5. 将0.5 毫升的上清液注入另一离心管。
      6. 储存粪便样品 (和提取物) 在至少-18 摄氏度。
      7. 用 5α-pregnane-3 b、11 b、21-三元醇-20-一酶免疫分析法 (EIA) 18、19或另一次完全验证的环境影响评估 FCM.
   3. 计算 fcm 浓度相对于基线 fcm 浓度的百分比变化。

6. 自由探索范式

1. 把笼子从架子上拿出来, 在24小时观察期结束时把它放在桌面上。
2. 将网格化笼顶 (不带食物或水瓶) 放在位于45°角的笼中, 置于笼的较长一侧。
   注意: 不要破坏巢, 它充当老鼠的藏身之处, 但将笼顶对角置于巢之上。
3. 显示器或视频-记录小鼠10分钟从距离约1.5 米。
   1. 启动计时器。
   2. 注意当鼠标爬到笼顶 (所有四只爪子放在笼顶) 或离开笼顶 (用一个或更多的爪子在笼底) 的所有时间。
      注意: 一些老鼠可能爬上笼顶, 离开它, 以便沿着笼子的边缘走。一些老鼠也在笼子顶上。把这些病例当作老鼠仍然放在笼子顶上。
4. 根据伯特et计算参数。²⁰。
   1. 分析第一次探测的滞后时间 (秒)。
   2. 分析探索的次数。
   3. 分析勘探的总持续时间 (秒)。
      注意: 第一次勘探的潜伏期很高, 探索的次数少, 总的勘探时间也很低, 这表明有较高的特质焦虑水平。

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结果

本议定书最初是为了评估 C57BL/6JRj 小鼠在单异氟醚麻醉 (一次45分钟麻醉疗程, n = 13 女性) 或重复异氟醚麻醉 (六45分钟麻醉疗程 3-4 天) 后的福祉而制定的。在麻醉疗程之间, n = 13 女性) 与控制小鼠 (n = 6 位女性) 的福利相比,¹⁰, 没有接受麻醉, 但根据相同的措施测试。我们评估了单一经验的异氟醚麻醉和重复异氟醚麻醉对 C57BL/6JRj 小鼠的幸福与未经治疗的控?...

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讨论

该议定书最初是为了评估接受单一麻醉或重复异氟醚麻醉的 C57BL/6JRj 小鼠的福祉而制定的。研究结果证实, 对奢侈品行为的测试以及其他措施 (例如自由探索范式、mg、穴居食物摄取) 都是评估幸福感的敏感方法。反复异氟醚麻醉对特质焦虑相关行为、特征和穴居行为产生短期影响。此外, 反复异氟醚麻醉似乎影响食物摄取量¹⁰。

自由探索范式表明, 减少...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluran	CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH	1214
InfraMot - Sensore Units	TSE Systems	302015-SENS
InfraMot - Control Units	TSE Systems	302015-C/16
InfraMot - Software	TSE Systems	302015-S
Nestlet N	Ancare - Plexx	NES3600
Camera EOS 350D	Canon