Valutazione sistematica del benessere nei topi per procedure usando l'anestesia generale

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un protocollo per valutare il benessere nei topi durante le procedure di anestesia generale. Una serie di parametri comportamentali che indicano livelli di benessere così come metaboliti di glucocorticoidi sono stati analizzati. Il protocollo può servire come un generale di aiuti per stimare il grado di gravità in modo scientifico, animale-centrato.

Abstract

In armonia con il 3R principio (sostituzione, riduzione e perfezionamento) sviluppato da Russel e Burch, ricerca scientifica dovrebbe utilizzare alternative alla sperimentazione animale quando possibile. Quando non c'è alcuna alternativa alla sperimentazione animale, il numero totale di animali da laboratorio utilizzato dovrebbe essere il minimo necessario per ottenere dati importanti. Inoltre, misure di raffinatezza appropriato devono essere applicati per ridurre al minimo dolore, sofferenza e angoscia che accompagna la procedura sperimentale. Le categorie utilizzate per classificare il grado di dolore, sofferenza e angoscia sono non-recupero, lieve, moderata o grave (direttiva europea 2010/63). Per determinare quali categorie applicano nei singoli casi, è fondamentale utilizzare strumenti scientificamente.

Il protocollo di bene-essere-valutazione qui presentato è progettato per le procedure durante la quale viene utilizzata l'anestesia generale. Il protocollo si concentra sui comportamenti di attività, il Mouse smorfia scala e lusso di gabbia a casa come scavare e nido costruzione comportamento come indicatori di benessere. Utilizza anche il paradigma esplorativo gratuito per il comportamento di relazione con l'ansia di tratto. Metaboliti di corticosterone fecale come indicatori di stress acuto sono misurati durante il periodo post-anestetico-24h.

Il protocollo fornisce informazioni scientificamente solide sul benessere dei topi dopo l'anestesia generale. Grazie alla sua semplicità, il protocollo può essere facilmente adattato e integrato in un studio previsto. Anche se non fornisce una scala per classificare l'afflizione in categorie secondo la direttiva europea 2010/63, può aiutare i ricercatori stimare il grado di gravità di una procedura utilizzando i dati scientificamente validi. Fornisce un modo per migliorare la valutazione del benessere in maniera scientifica, animale-centrato.

Introduzione

Direttiva 2010/63 UE¹ prevede che il principio di 3R (sostituzione, riduzione, raffinatezza) sviluppato da Russel e Burch² deve essere applicato ogni volta che la sperimentazione animale è necessario. L'obiettivo finale della direttiva UE è quello di eliminare gradualmente tutti i test sugli animali, ma la direttiva riconosce che, per il momento, alcuni esperimenti sugli animali sono ancora necessari per condurre una ricerca che proteggerà la salute umana e animale. Così, se un esperimento sugli animali non può essere sostituito da alcun metodo alternativo, solo il numero minimo di animali da laboratorio deve essere utilizzato per ottenere risultati affidabili. Inoltre, la quantità di dolore, sofferenza e angoscia che accompagna le procedure sperimentali deve essere minimizzata mediante misure adeguate raffinatezza. Direttiva 2010/63 UE stabilisce che la gravità di una procedura deve essere classificata prospetticamente come mancato recupero, lieve, moderata o grave¹. Come classificazione della gravità è deciso caso per caso, è importante disporre di strumenti scientificamente validi per valutare la gravità di una determinata procedura.

Schede di punteggio come proposto dalla Morton e Griffith³ sono uno strumento essenziale nel rilevare eventuali deviazioni dal normale stato, compresi gli effetti negativi sul benessere⁴. Il Punteggio dei fogli vengono utilizzato per determinare in modo retrospettivo dolore, sofferenza, e afflizione causata da un esperimento e concentrarsi su cambiamenti visibili nello stato fisico del singolo animale (ad es., peso corporeo, pelliccia, andatura). Anche se, allegato VIII della direttiva 2010/63 fornisce esempi di ciascuna categoria di gravità, i ricercatori ancora mancanza strumenti per stimare il livello di gravità di una data procedura utilizzando scientificamente basano dati.

L'assenza di indicatori che mostrano benessere negativo non è l'unico modo per determinare lo stato dell'animale; la presenza di indicatori che punta al benessere positivo è anche importante^5,6,7,8. Ad esempio, animali visualizzare comportamenti di lusso come scavare e comportamento di costruzione del nido solo quando sono soddisfatte tutte le loro necessità essenziali. Se il benessere è ridotto, i comportamenti di lusso sono i primi a declinare^5,7. Protocolli da utilizzare nella valutazione benessere dovrebbero includere indicatori indicando il fisico, fisiologico/biochimici e stati psicologici degli animali al fine di valutare il proprio benessere in un modo dettagliato e completo⁹.

Nel contesto di raffinatezza, un protocollo è stato sviluppato per soddisfare tali requisiti e valutare gli effetti di una procedura che coinvolge l'anestesia generale sul benessere di topi¹⁰. Allo stesso tempo, l'obiettivo era di ridurre al minimo qualsiasi ulteriore stress per consentire la facile integrazione del protocollo in un dato esperimento. Il protocollo ritiene burrowing comportamento, il comportamento di gabbia a casa come attività, assunzione di cibo e nidificazione e comportamento di relazione con l'ansia di tratto. Inoltre, include il Mouse smorfia scala (MGS) e l'analisi non invasiva dei metaboliti di corticosterone nelle feci. Il protocollo è progettato per facilitare la valutazione del benessere in maniera scientifica e animale-centrato e a fornire informazioni sul benessere che supporta la classificazione del grado di gravità. Oltre al Punteggio dei fogli, può fornire informazioni utili per la classificazione della gravità di una procedura. Come il protocollo è facile da realizzare e non richiede ampia dotazione, può essere integrato in un esperimento in corso senza influenzare i risultati di uno studio. Va notato che la ricerca animale: Reporting di In Vivo esperimenti (arrivo) orientamento¹¹ deve essere osservata in tutti gli studi che coinvolgono gli esperimenti sugli animali, con l'obiettivo di migliorare la progettazione, analisi e reporting.

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Protocollo

Lo studio è stato effettuato secondo le linee guida stabilite dal tedesco Animal Welfare Act ed è stato approvato dall'autorità di stato di Berlino ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", numero del permesso: G0053/15).

Nota: L'obiettivo principale di questo protocollo era di studiare l'effetto dell'anestesia ripetuta sui metaboliti glucocorticoide. È stato effettuato un calcolo della dimensione campionaria per determinare il numero di animali da utilizzare: n ≥ 2 × (s / µ₁- µ₂)² × (z_α + z_β)². µ₁- µ₂ è la differenza tra mezzi di popolazione al quale potere e campione sono fatti i calcoli delle dimensioni (α = 5%, β = 80%); z_α = 1.96 e z_β = 0,84 sono i quantili della distribuzione normale standard. La figura 1 illustra la linea del tempo del presente protocollo. Se un parametro del protocollo evidenzia una differenza con il livello di controllo, l'animale deve essere attentamente monitorata e il parametro deve essere misurato dopo un adeguato periodo. Ad esempio, se il comportamento di relazione con l'ansia di tratto è aumentato, questo comportamento deve essere testato ancora una settimana più tardi, al fine di determinare il periodo fino al completo recupero. Intervalli di tempo e periodi definiti nel presente protocollo possono essere adattati per l'uso con altre procedure. Quando si modificano i punti di tempo, periodi di assuefazione dovrebbero essere tenuti come descritto nel protocollo. Al fine di ridurre i fattori che potrebbero influenzare il comportamento dei topi, prove che richiedono ulteriori devono essere effettuate dopo le prove che non disturbano il normale comportamento dei topi. La figura 2 riassume tutti i test del protocollo utilizzando una scheda riassuntiva di punteggio. Figura 3 fornisce scale semplificate del grado di benessere, che offrono una panoramica di come interpretare i risultati del test.

1. habituating topi alla movimentazione di sperimentatore

1. Permettono di topi a habituate all'alloggio degli animali per almeno 2 settimane dopo che sono state ottenute da un altro impianto o fornitore.
2. Casa topi nei gruppi e mantenerle in condizioni standard (temperatura ambiente 22 ± 2 ° C; umidità relativa 55 ± 10%) su un ciclo di luce: buio di 12:12 h.
3. Tutti i gruppi con un tunnel e cotone nestlets come arricchimento standard e fornire cibo e acqua ad libitum.
4. Habituate tutti i topi per il tunnel e/o Coppa di gestione almeno una settimana prima della prova¹².
   Nota: Raccogliendo topi dalla coda può indurre stress o ansia, che a sua volta influenza il benessere e ha anche un impatto sui risultati di questo protocollo¹².

2. preparazione della sala prove comportamento e apparati

Nota: Fornire una stanza separata per il test, idealmente vicino alla sala dove gli animali sono tenuti. Trasportare i topi nelle loro gabbie casa al test camera almeno 60 min prima che si svolge il procedimento. Se possibile, effettuare tutte le prove del presente protocollo nella stessa sala prova dove la procedura è eseguita.

1. Preparare una gabbia di osservazione per verificare burrowing comportamento⁸ e per prendere le fotografie per l'uso del MGS¹³ (Figura 4).
   1. Utilizzare una scatola di vetro con una superficie di circa 220 × 290 mm e un'altezza di 390 mm.
   2. Coprire il pavimento di questa scatola con circa 0,5 cm di materiale da lettiera.
   3. Spargere una manciata di lettiere utilizzate materiale dalla gabbia sopra il nuovo materiale di biancheria da letto per ridurre il disagio nel nuovo ambiente.
   4. Fornire cibo, lo stesso tipo che è normalmente fornito come dieta e acqua.
      Nota: se possibile, utilizzare bottiglie d'acqua, perché i topi possono riempire ciotole d'acqua con materiale da lettiera.
2. Preparare una gabbia (tipo III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) per il periodo di osservazione di 24 h, per cui i topi sono alloggiati individualmente (Figura 5).
   Nota: Al fine di ridurre al minimo la durata delle singole abitazioni, raccogliere dati per nido costruzione comportamento, attività di gabbia a casa, l'ingestione di cibo e metaboliti fecali corticosterone (FCM) durante questo periodo.
   1. Posto nuovo assestamento materiale nella gabbia (circa 0,5 cm di profondità) e dispersione una manciata di lettiere utilizzate materiale senza feci dalla gabbia sopra il nuovo materiale, al fine di ridurre il disagio.
   2. Fornire una nestlet standardizzata e quadrato in cotone di peso definito, come arricchimento ambientale unico (Vedi tabella materiali)¹⁴.
      Nota: Nestlets commerciale potrebbe differire nel peso. Di conseguenza, abbiamo modificato il peso del nestlet descritto da diacono e utilizzato 2,0 g invece di 2,7 g¹⁴.
   3. Montare il sensore a infrarossi sulla parte superiore della gabbia, quando si utilizza un sensore a infrarossi per misurare l'attività della gabbia a casa (Vedi tabella dei materiali).
   4. Fornire cibo, lo stesso tipo che è normalmente fornito come dieta, e acqua ad libitum.

3. Mouse smorfia scala

Nota: Fotografie per i MGS sono prese nella gabbia osservazione in tre momenti: (i) 2 giorni prima della procedura a livelli basali record di MGS, (ii) 30 min dopo la procedura e (iii) 150 min dopo la procedura. Quando il benessere è alterata, punteggi su MGS aumentare. Se aumento MGS punteggi ancora sono osservati dopo 150 min, scattare fotografie aggiuntive in una fase successiva.

1. Utilizzare una fotocamera ad alta definizione per la fotografia.
2. Delicatamente trasferire il mouse nella gabbia osservazione e consentire il mouse per habituate al nuovo ambiente per almeno 30 min.
3. Continuamente prendere circa 30-40 fotografie per ogni volta scegliere entro 1-2 min.
4. Ordinare tutte le fotografie selezionando le fotografie tagliente frontale o laterale e scartando fotografie sfocate o fotografie che mostrano volti del mouse da altre prospettive rispetto Vista frontale o laterale.
5. Selezionare casualmente una fotografia da ogni punto di tempo, (cioè 2 giorni prima della procedura, 30 min dopo la procedura e 150 min dopo la procedura) per ogni mouse.
6. Ritagliare le fotografie per visualizzare solo la testa del mouse in modo che la posizione del corpo non è visibile¹³.
7. Creare un file di foglio di calcolo con un foglio per ogni fotografia e aggiungere una tabella che include le cinque unità di azione facciale di MGS per ogni foglio.
   Nota: Il file contiene fotografie della linea di base, nonché fotografie dopo la procedura.
8. Randomizzare l'ordine dei fogli.
9. Presentazione del fascicolo sullo schermo del computer per tre persone indipendenti, che in precedenza erano addestrate ad utilizzare la MGS sviluppato da Langford et al e li hanno Punteggio ottenuto le unità di azione facciale utilizzando una scala a 3 punti (0 = non presente, 1 = moderatamente presenti, 2 = ovviamente presenti).
   Nota: Punteggio è basato sui seguenti parametri¹³: orbitale di serraggio ("restringimento della zona orbitale, con una palpebra ermeticamente chiuso o spremere un occhio"); rigonfiamento del naso ("arrotondato estensione della pelle visibile sul ponte del naso"); rigonfiamento della guancia ("aspetto convesso del muscolo guancia"); posizione dell'orecchio ("orecchie tirato a parte e torna dalla loro posizione di base o con creste verticali che formano a causa delle punte delle orecchie essendo tirato indietro"); cambiamento di whisker ("movimento di baffi dalla loro linea di base di posizione o all'indietro, contro il viso o in avanti, come se in piedi sull'estremità; baffi possono anche ammassarsi").
10. Analizzare i punteggi, come segue (adattati da Langford et al. ¹³).
    1. Media di tutte le unità di azione facciale per ogni fotografia per generare il Punteggio di MGS.
       Nota: Se una delle unità di azione facciale potrebbe non essere segnata, media le rimanenti unità di azione facciale.
    2. Sottrarre la media per le fotografie della linea di base dalla media per la routine di post fotografie ottenere un punteggio di differenza MGS per ogni mouse.
    3. Test per le differenze nei punteggi MGS differenza tra le persone (test non parametrici per gli esempi correlati).
       Nota: Se c'è una differenza significativa (p < 0,05), determinare se punteggi di tutte le foto o solo punteggi di poche fotografie differiscono tra le persone. Se quest'ultimo è vero, è necessario ripetere il Punteggio di queste fotografie. In caso contrario, le persone dovrebbero ripetere l'addestramento di MGS e quindi segnare le fotografie nuovamente.
    4. Media il MGS differenza punteggi ottenuti da marcatori diversi per ogni mouse, se risultati di tutte le persone non differiscono significativamente.
    5. Utilizzare un test statistico non parametrico per confrontare i punteggi di differenza MGS ha stato in media tra i gruppi di studio.

4. burrowing comportamento^8,15,16

1. Preparare tane inserendo 140 ± 2 g cibo pellet normalmente fornito come dieta in un standard opaco plastica bottiglia d'acqua (250 mL, lunghezza 150 mm, diametro 55 mm, 45 mm di diametro del collo di bottiglia)⁸.
   Nota: Come topi preferiscono ampie tubi, tane con un diametro di 68 mm possono essere utilizzati come descritto da diacono¹⁶.
2. Luogo della tana riempito con palline di cibo nella gabbia casa 5 giorni prima della procedura per l'acclimatazione.
   Nota: L'unità di cibo-erogazione regolare nella gabbia non deve essere svuotato ma anche dovrebbe rimanere riempita con pellet di cibo, i topi sono utilizzati per questo.
3. Eseguire il test due volte, 2 giorni prima dell'intervento (baseline); eseguire anche la procedura di post Ultima 30 min.
   1. Lasciare che il mouse habituate per almeno 30 min per la gabbia di osservazione dove sono state scattate le foto di MGS.
   2. Posizionare la bottiglia di acqua di plastica riempita con cibo pellet parallelamente alla parete posteriore della gabbia osservazione.
   3. Pesare le palline dell'alimento (g) restanti nella tana dopo 2 h.
4. Calcolare il peso del cibo pellet rimosso dalla tana da topi rispetto al peso iniziale (%).

5. 24-h periodo di osservazione

Nota: I topi sono alloggiati singolarmente, come descritto al punto 2.2. (Figura 5), per un periodo di 24 ore, al fine di misurare il cibo assunzione, attività di gabbia a casa, nidificano edificio comportamento e livelli di FCM. L'osservazione di 24-h si svolge due volte: (i) 2 giorni prima della procedura per livelli basali, (ii) il giorno della procedura.

1. Ingestione di cibo
   1. Pesare i topi a intervalli regolari (ad es. 2 giorni prima dell'anestesia, immediatamente prima dell'anestesia, 2 giorni dopo l'anestesia e settimanalmente dopo l'anestesia), al fine di valutare eventuali cambiamenti nel peso corporeo (parte della scheda di valutazione).
      Nota: Il peso corporeo è necessaria per calcolare l'ingestione di cibo per grammo di peso corporeo. Assunzione di acqua può anche essere misurata durante il periodo di osservazione di 24 h. Se si riduce l'assunzione di cibo, benessere potrebbe essere compromessa.
   2. Determinare il peso iniziale della dieta di cibo standard (grammi) fornito nell'unità di cibo della gabbia (circa 100 g).
   3. Determinare il peso della dieta di cibo standard alla fine del periodo di osservazione di 24 h.
   4. Scansione lato gabbia sotto l'unità di cibo con attenzione per fuoriuscita di cibo e aggiungere qualsiasi pellet di cibo extra trovato al peso del cibo pellet restanti nell'unità di cibo.
   5. Calcolare l'ingestione di cibo per unità di peso di corpo.
2. Attività di gabbia a casa
   Nota: Le seguenti istruzioni si riferiscono all'uso di un sensore a infrarossi (Vedi tabella dei materiali), ma attività gabbia a casa può essere valutato anche con programmi alternativi. Deviazione dell'attività di gabbia a casa dai livelli di controllo (ad esempio ipoattività, iperattività) può essere un segno di benessere alterata.
   1. Avviare il programma.
   2. Scegliere un intervallo di campionamento di 1 min e un tempo di acquisizione di 24 h, significato che impulsi sono registrati ogni minuto per 24 h.
      Nota: Se lo sperimentatore entra nella stanza più volte dopo l'avvio di registrazione, utilizzare solo dati da periodi, quando i topi non erano disturbati (cioè durante il periodo scuro).
   3. Riassumere gli intervalli di 10 min di impulsi.
   4. Calcolare l'area sotto la curva di tempo (impulsi × min).
3. Comportamento di costruzione del nido
   Nota: Nidi complessi e alti possono servire come un indicatore di benessere.
   1. Posizionare un nestlet quadrato in cotone (Vedi Tabella materiali) con un peso definito (ad esempio 2,0 g) al centro della gabbia.
   2. Punteggio ottenuto il nido su una scala di 5 punti (Vedi sotto) secondo diacono¹⁴ la mattina seguente, circa 2 h dopo la luce si accende. Pesare qualsiasi pezzi di nestlet illeso che sono almeno il 5% del peso iniziale nestlet. Punteggio ottenuto i nidi come segue¹⁴
      1. Assegnare il Punteggio di "1" Se il 90% della nestlet intatta.
      2. Assegnare il Punteggio di "2" se è intatto il 50-90%.
      3. Assegnare punteggio "3" se è tagliuzzato 50-90% della nestlet.
      4. Assegnare punteggio "4" se più del 90% è tagliuzzato ma nido è piatta, e meno del 50% della relativa circonferenza è superiore di altezza del corpo del mouse quando raggomitolato.
      5. Assegnare punteggio "5" se più di 90% nestlet è tagliuzzato e nido è alto, e più del 50% della relativa circonferenza è superiore di altezza del corpo di un topo rannicchiato.
4. Metaboliti fecali Corticosterone
   Nota: Aumenti di FCM sopra il livello del controllo riflettono i livelli di stress acuto durante il periodo di postanesthetic 24-h.
   1. Raccogliere tutti i pellet fecali asciutti dalla gabbia usando il forcipe alla fine del periodo di osservazione di 24 h ed eliminare bagnato pellet contaminato con l'urina.
   2. Estrarre FCM secondo Palme et al. ¹⁷, come segue.
      1. Campioni fecali asciutti ad una temperatura di 60-70 ° C.
      2. Omogeneizzare i campioni fecali utilizzando un mortaio.
      3. Agitare un'aliquota di 0,05 g con 1 mL di metanolo al 80% in una provetta da centrifuga per 30 minuti su un multi-vortex.
      4. Centrifugare i campioni a 2500 x g per 15 min.
      5. Pipettare 0,5 mL di surnatante in un'altra provetta da centrifuga.
      6. Conservare i campioni fecali (ed estratti) a un minimo di-18 ° C.
      7. Analizzare FCM utilizzando un 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one enzima immunoassay (via)^18,19 o un altro EIA completamente convalidato.
   3. Calcolare la variazione percentuale delle concentrazioni di FCM rispetto le concentrazioni basali di FCM.

6. free paradigma esplorativo

1. Prendere la gabbia a casa dalla rastrelliera e posizionarlo su una superficie di tabella alla fine del periodo di osservazione di 24 h.
2. Posizionare un top gridded gabbia (senza cibo né acqua bottiglie) nella gabbia a un angolo di 45° sul lato più lungo della gabbia.
   Nota: Non distruggere il nido, che serve come nascondiglio per il mouse, ma posizionare la parte superiore di gabbia diagonalmente sopra il nido.
3. Monitor o videoregistrare i topi per 10 min da una distanza di circa 1,5 m.
   1. Avviare il timer.
   2. Nota tutte le volte quando il mouse si arrampica sulla parte superiore della gabbia (con tutte le quattro zampe sulla parte superiore della gabbia) o lascia la cima della gabbia (con uno o più zampe al piano di gabbia).
      Nota: Alcuni topi possono salire fino alla cima della gabbia e lasciarla per camminare lungo il bordo della gabbia. Alcuni mouse posteriore anche sulla parte superiore della gabbia. Trattare questi casi come se i topi erano ancora sulla parte superiore della gabbia.
4. Valutare i parametri che seguono Bert et al. ²⁰.
   1. Analizzare la latenza per prima esplorazione (in secondi).
   2. Analizzare il numero di esplorazioni.
   3. Analizzare la durata totale (secondi) di esplorazione.
      Nota: Un'elevata latenza prima esplorazione, un basso numero di esplorazioni e una bassa durata complessiva di esplorazione può indicare più alti livelli di ansia di tratto.

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Risultati

Questo protocollo è stato originariamente sviluppato per valutare il benessere dei topi C57BL/6JRj che seguono un'unica esperienza di isoflurane anestesia (una sessione di anestesia 45min, n = 13 femmine) o anestesia ripetuta isoflurano (sei sessioni di 45 minuti l'anestesia con 3-4 giorni tra le sessioni di anestesia, n = 13 femmine) rispetto al benessere dei topi di controllo (n = 6 femmine)¹⁰, che ha ricevuto senza anestesia, ma sono stati testati secondo le st...

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Discussione

Il protocollo è stato originariamente sviluppato per valutare il benessere dei topi C57BL/6JRj che hanno ricevuto una sola anestesia o anestesia ripetuta isoflurano. I risultati confermano che prove di comportamenti di lusso, nonché altre misure (ad es. il paradigma esplorativo gratuito, MGS, ingestione di cibo scavatori) erano metodi sensibili per valutare il benessere. L'anestesia ripetuta isoflurano causato effetti a breve termine sul comportamento di relazione con l'ansia di tratto, MGS e comportamento sca...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluran	CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH	1214
InfraMot - Sensore Units	TSE Systems	302015-SENS
InfraMot - Control Units	TSE Systems	302015-C/16
InfraMot - Software	TSE Systems	302015-S
Nestlet N	Ancare - Plexx	NES3600
Camera EOS 350D	Canon