Avaliação sistemática de bem-estar em camundongos para procedimentos com anestesia geral

Resumo

Desenvolvemos um protocolo para avaliar o bem-estar em ratos durante procedimentos com anestesia geral. Uma série de parâmetros comportamentais, indicando níveis de bem-estar, bem como metabólitos de glicocorticoides foram analisados. O protocolo pode servir como uma ajuda geral para estimar o grau de gravidade de forma científica, centrada no animal.

Resumo

De acordo com a 3R princípio (substituição, redução e refinamento) desenvolvido por Russel e Burch, investigação científica deve usar alternativas à experimentação animal, sempre que possível. Quando não há alternativa à experimentação animal, o número total de animais de laboratório usado deve ser o mínimo necessário para obter dados valiosos. Além disso, devem ser aplicadas medidas de refinamento adequado para minimizar a dor, sofrimento e angústia que acompanha o procedimento experimental. As categorias usadas para classificar o grau de dor, sofrimento e angústia são não-cobrança, leve, moderada ou grave (UE Directiva 2010/63). Para determinar quais categorias se aplicam em casos individuais, é crucial usar ferramentas cientificamente.

O protocolo de well-being-avaliação apresentado aqui é projetado para procedimentos durante o qual anestesia geral. O protocolo incide sobre comportamentos de actividade, o rato careta escala e luxo de gaiola em casa como burrowing e ninho edifício comportamento como indicadores de bem-estar. Ele também usa o paradigma exploratório livre de comportamento relacionados à ansiedade do traço. Metabólitos de corticosterona fecais como indicadores de estresse agudo são medidos no período pós-anestésica-24h.

O protocolo fornece informações cientificamente sólidas sobre o bem-estar dos ratos após anestesia geral. Devido à sua simplicidade, o protocolo pode facilmente ser adaptado e integrado em um estudo planejado. Embora ele não fornece uma escala para classificar o perigo em categorias de acordo com a directiva da União Europeia 2010/63, pode ajudar os pesquisadores estimar o grau de gravidade de um procedimento usando dados cientificamente. Ele fornece uma maneira de melhorar a avaliação do bem-estar de uma forma científica, centrada no animal.

Introdução

UE Directiva 2010/63¹ estipula que o princípio do 3R (substituição, redução, refinamento) desenvolvido por Russel e Burch² deve ser aplicada sempre que a experimentação animal é necessária. O objetivo final da directiva da UE é para se livrarem de todos os testes em animais, mas a directiva reconhece que, por enquanto, algumas experiências com animais são ainda necessários para conduzir a pesquisa que irá proteger a saúde humana e animal. Assim, se um experimento animal não pode ser substituído por qualquer método alternativo, apenas o número mínimo de animais de laboratório é para ser usado para obter resultados fiáveis. Além disso, a quantidade de dor, sofrimento e angústia que acompanha procedimentos experimentais deve ser minimizada através de medidas adequadas de refinamento. União Europeia Directiva 2010/63 estipula que a gravidade de um procedimento deve ser prospectivamente classificada como letal, leve, moderada ou grave¹. Classificação de gravidade é decidido em uma base caso-a-caso, é importante ter ferramentas cientificamente para estimar a gravidade de um determinado procedimento.

Folhas de pontuação, como proposto por Morton e Griffith³ são uma ferramenta essencial na detecção de quaisquer desvios do estado normal, incluindo os efeitos negativos sobre o bem-estar⁴. Folhas de pontuação são usadas para determinar retrospectivamente a dor, o sofrimento, e o sofrimento causado por uma experiência e foco em mudanças visíveis no estado físico de cada animal (por exemplo, peso de corpo, peles, marcha). Embora, VIII do anexo da Directiva 2010/63 fornece exemplos de cada categoria de severidade, pesquisadores ainda falta ferramentas para estimar o grau de gravidade de um determinado procedimento usando cientificamente com base em dados.

A ausência de indicadores que mostram o bem-estar negativo não é a única maneira de determinar o estado do animal; a presença de indicadores apontando para bem-estar positivo é também importante^5,6,7,8. Por exemplo, animais exibir comportamentos de luxo como a construção de galerias e ninho edifício comportamento apenas quando todas as suas necessidades essenciais sejam atendidas. Se o bem-estar é reduzido, comportamentos de luxo são os primeiros a recusar a^5,7. Protocolos para ser utilizado na avaliação de bem-estar devem incluir indicadores apontando para o físico, fisiológico/bioquímicos e Estados psicológicos dos animais para avaliar o seu bem-estar em uma forma detalhada e abrangente⁹.

Dentro do contexto de requinte, um protocolo foi desenvolvido para atender a esses requisitos e avaliar os efeitos de um procedimento envolvendo anestesia geral sobre o bem-estar dos ratos¹⁰. Ao mesmo tempo, o objetivo era minimizar qualquer estresse adicional para permitir a fácil integração do protocolo em uma determinada experiência. O protocolo considera a escoar-se comportamento, comportamento de gaiola em casa como atividade, ingestão de alimentos e aninhamento e comportamento relacionados à ansiedade do traço. Além disso, inclui a escala de careta de Mouse (MGS) e a análise não-invasiva de metabólitos de corticosterona em fezes. O protocolo é projetado para facilitar a avaliação do bem-estar de uma forma científica e centrada no animal e para fornecer informações sobre o bem-estar que oferece suporte à classificação do grau de severidade. Além de papéis, pode fornecer informações úteis para a classificação de gravidade de um procedimento. Como o protocolo é fácil de realizar e não requer extenso equipamento, pode ser integrado em um experimento em andamento sem influenciar os resultados de um estudo. Note-se que a pesquisa Animal: relatórios no Vivo experimentos (chegada) directriz¹¹ é para ser observado em todos os estudos que envolvem as experiências com animais, com o objetivo de melhorar a concepção, análise e emissão de relatórios.

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Protocolo

O estudo foi realizado de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo alemão Animal Welfare Act e foi aprovado pela autoridade do estado de Berlim ("Turismo für Gesundheit und Soziales", número de licença: G0053/15).

Nota: O principal objectivo do presente protocolo foi investigar o efeito da anestesia repetida em metabólitos de glicocorticoide. Um cálculo de tamanho de amostra foi realizado para determinar o número de animais a ser usado: n ≥ 2 × (s / µ₁- µ₂)² × (z_α + z_β)². µ₁- µ₂ é a diferença entre meios de população no qual poder e amostra são feitos os cálculos de tamanho (α = 5%, β = 80%); z_α = 1,96 e z_β = 0,84 são o quantiles da distribuição normal padrão. A Figura 1 ilustra a linha de tempo do presente protocolo. Se um parâmetro do protocolo mostra uma diferença com o nível de controle, o animal deve ser monitorado pròxima, e o parâmetro deve ser medido novamente após um período adequado. Por exemplo, se o comportamento de relacionados à ansiedade traço é aumentado, esse comportamento deve ser testado novamente uma semana depois, a fim de ajudar a determinar o período até a recuperação completa. Pontos de tempo e períodos definidos no presente protocolo podem ser adaptados para uso com outros procedimentos. Ao alterar os pontos de tempo, períodos de habituação devem ser mantidos conforme descrito no protocolo. Para reduzir os fatores que possam influenciar o comportamento de ratos, testes que exigem mais manipulação devem ser realizadas após testes que não perturbe o comportamento normal de ratos. A Figura 2 resume todos os testes do protocolo usando uma folha de Pontuação Resumo. A Figura 3 fornece escalas simplificadas do grau de bem-estar, que dão uma visão geral de como interpretar os resultados do teste.

1. habituating ratos para tratamento pelo experimentador

1. Permitir que os ratos para se habituar ao centro animal pelo menos 2 semanas depois de terem sido obtido outra instalação ou fornecedor.
2. Ratos em grupos da casa e mantê-las sob condições normais (temperatura de 22 ± 2 ° C, umidade relativa de 55 ± 10%) em um ciclo de luz: escuro de 12:12 h.
3. Fornecer a todos os grupos com um túnel e algodão nestlets como padrão enriquecimento e providenciar comida e água ad libitum.
4. Se habituar todos os ratos para o túnel e/ou Copa manipulação, pelo menos, uma semana antes do teste¹².
   Nota: Apanhar ratos pela cauda pode induzir stress ou ansiedade, que por sua vez afeta o bem-estar e também tem um impacto sobre os resultados do presente protocolo¹².

2. preparar a sala de testes comportamental e aparelhos

Nota: Fornece uma sala separada para testes, idealmente perto da sala onde os animais são mantidos. Transporte os ratos em jaulas em casa para o teste quarto pelo menos 60 min antes que o procedimento é realizado. Se possível, realizar todos os testes do presente protocolo no mesmo quarto teste onde o procedimento é realizado.

1. Prepare uma gaiola de observação para testar Scelotes comportamento⁸ e para tirar as fotografias para uso no MGS¹³ (Figura 4).
   1. Use uma caixa de vidro com uma área de aproximadamente 220 mm × 290 mm e uma altura de 390 mm.
   2. Cobrir o chão da caixa com aproximadamente 0,5 cm de material de cama.
   3. Espalhe um punhado de fundamento utilizado material da gaiola em casa em cima do novo material de fundamento para reduzir o desconforto causado pelo novo ambiente.
   4. Fornece o alimento, o mesmo tipo que normalmente é fornecido como dieta e água.
      Nota: se possível, use garrafas de água, porque os ratos podem encher água tigelas com fundamento material.
2. Preparar uma gaiola (tipo III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) para o período de observação de 24 horas, para que os ratos estão alojados individualmente (Figura 5).
   Nota: Para minimizar a duração da habitação individual, coletar dados para o ninho, construção de comportamento, atividade de gaiola em casa, ingestão de alimentos e metabolitos corticosterona fecal (FCM) durante este período.
   1. Lugar novo fundamento material na gaiola (aproximadamente 0,5 cm de profundidade) e dispersão de um punhado de material de cama utilizado sem fezes da gaiola em casa em cima do novo material, a fim de reduzir o perigo.
   2. Fornece uma nestlet de algodão quadrado padronizado de um peso definido, como enriquecimento ambiental única (ver tabela de materiais)¹⁴.
      Nota: Nestlets comercial pode diferir em peso. Portanto, modificou o peso do nestlet descrito pelo diácono e usado 2,0 g em vez de 2,7 g¹⁴.
   3. Montar o sensor de infravermelho na parte superior da gaiola, quando usando um sensor infravermelho para medir a atividade de gaiola em casa (veja a tabela de materiais).
   4. Fornecer o alimento, o mesmo tipo que normalmente é fornecido como dieta, e água ad libitum.

3. Mouse careta escala

Nota: As fotografias para os MGS são tomadas na gaiola observação no tempo três pontos: (i) 2 dias antes do procedimento para registro de MGS basais, (ii) 30 min após o procedimento e (iii) 150 min após o procedimento. Quando o bem-estar é prejudicada, pontuações no the m.g. ' s aumentam. Se o golo de MGS aumento ainda é observados após 150 min, tira fotografias adicionais em um estágio posterior.

1. Use uma câmera de alta definição para a fotografia.
2. Delicadamente, transferir o mouse dentro da jaula de observação e permitir o mouse para se habituar ao novo ambiente pelo menos 30 min.
3. Continuamente a demorar cerca de 30-40 fotografias para cada vez que apontam dentro de 1-2 min.
4. Classificar todas as fotografias, selecionando as fotografias nítidas de frontais ou laterais e descartar fotos borradas ou fotografias que mostram rostos de rato a partir de outras perspectivas que vista frontal ou lateral.
5. Selecione aleatoriamente uma fotografia de cada ponto de tempo, (ou seja, 2 dias antes do procedimento, 30 min após o procedimento e 150 min após o procedimento) para cada rato.
6. Recorte as fotografias para exibir apenas a cabeça do rato, para que a posição do corpo não é visível,¹³.
7. Criar um arquivo de planilha com uma folha para cada foto e adicionar uma tabela, incluindo as cinco unidades de ação facial de the m.g. ' s para cada folha.
   Nota: O arquivo contém fotografias de linha de base, bem como fotografias pós procedimento.
8. Randomize a ordem das folhas.
9. Apresentar o arquivo em uma tela de computador para três pessoas independentes, que foram previamente treinadas para usar o MGS desenvolvido por Langford et al e tê-los a marcar as unidades de ação facial usando uma escala de 3 pontos (0 = não presente, 1 = moderadamente presentes, 2 = obviamente presente).
   Nota: Pontuação baseia-se nos seguintes parâmetros¹³: Orbital de aperto ("estreitamento da área orbital, com uma pálpebra hermeticamente fechada ou um aperto de olho"); protuberância do nariz ("arredondado extensão de pele visível na ponte do nariz"); protuberância de bochecha ("convexa aparência do músculo da bochecha"); posição da orelha ("orelhas puxado distante e volta de sua posição de linha de base ou apresentando sulcos verticais que se formam devido às pontas das orelhas, sendo atraído de volta"); mudança dos whiskers ("movimento de bigodes da sua linha de base ou posição para trás, contra o rosto ou para frente, como se de pé na extremidade; bigodes podem também aglutinar-se").
10. Analisar pontuações, como se segue (adaptado de Langford et al ¹³).
    1. Média de todas as unidades de ação facial para cada foto para gerar a pontuação de MGS.
       Nota: Se uma das unidades de ação facial não pode ser marcada, média as restantes unidades de ação facial.
    2. Subtrai a média para as fotografias de linha de base da média para o procedimento de postagem de fotografias obter uma pontuação de diferença MGS para cada rato.
    3. Teste para diferenças nas pontuações MGS diferença entre as pessoas (teste não paramétrico para amostras relacionadas).
       Nota: Se houver uma diferença significativa (p < 0,05), determine se a dezenas de todas as fotografias ou apenas partituras de algumas fotografias diferem entre as pessoas. Se este último for true, repeti a pontuação dessas fotografias. Caso contrário, as pessoas devem repetir o treinamento de MGS e então marcar as fotos novamente.
    4. Média o golo de diferença MGS obtido os marcadores diferentes para cada mouse, se não diferem significativamente os resultados de todas as pessoas.
    5. Use um teste estatístico não paramétrico para comparar as pontuações MGS diferença médias entre os grupos estudados.

4. burrowing comportamento^8,15,16

1. Prepare-se tocas colocando 140 pelotas de alimento do 2G ± normalmente fornecidas como dieta em um padrão opaco plástico garrafa de água (250 mL, comprimento 150 mm, diâmetro de 55 mm, 45 mm de diâmetro do gargalo)⁸.
   Nota: Como os ratos preferem tubos amplo, tocas com um diâmetro de 68 mm podem ser usadas conforme descrito pelo diácono¹⁶.
2. A toca cheio de pelotas de alimento na gaiola em casa 5 dias antes do procedimento para aclimatação.
   Nota: A unidade de alimentos-distribuição regular na gaiola não deve ser esvaziada, mas também deve permanecer repleto de pelotas de alimento, como os ratos são usados para isso.
3. Realizar o teste duas vezes, 2 dias antes do procedimento (linha de base); realizar o último procedimento 30 min post também.
   1. Deixe o mouse se habituar pelo menos 30 min para a gaiola de observação, onde foram tomadas fotografias para o MGS.
   2. Coloque a garrafa de água plástica com esferas de comida paralelas à parede traseira da gaiola observação.
   3. Pese de pelotas de alimento (g) permanecendo na toca após 2 h.
4. Calcule o peso de pelotas de alimento retirado a toca por ratos em relação ao peso inicial (%).

5. 24-h período de observação

Nota: Os ratos estão alojados individualmente, conforme descrito no ponto 2.2. (Figura 5), por um período de 24 h, para medir alimentos ingestão, atividade de gaiola em casa, ninho de comportamento do edifício e níveis da FCM. A observação de 24 horas ocorre duas vezes: (i) 2 dias antes do procedimento para basais, (ii) no dia do procedimento.

1. Ingestão de alimentos
   1. Pese os ratos em intervalos regulares (por exemplo, 2 dias antes da anestesia, imediatamente antes da anestesia, 2 dias após a anestesia e semanal, após a anestesia), a fim de avaliar as alterações no peso corporal (parte da folha de pontuação).
      Nota: O peso corporal é necessária para calcular a ingestão de alimentos por grama de peso corporal. Consumo de água também pode ser medido durante o período de observação de 24 horas. Se a ingestão de alimentos é reduzida, o bem-estar pode ser prejudicada.
   2. Determine o peso inicial da dieta padrão (gramas) fornecido na unidade de comida da gaiola (cerca de 100 g).
   3. Determine o peso da dieta alimentar padrão no final do período de observação de 24 horas.
   4. Varredura do lado da gaiola sob a unidade de alimentos cuidadosamente para derramamento de comida e adicionar qualquer pelotas de alimento extra encontradas para o peso de pelotas de alimento restante na unidade de alimentos.
   5. Calcule a ingestão de alimentos por unidade de peso de corpo.
2. Atividade de gaiola em casa
   Nota: As instruções a seguir referem-se ao uso de um sensor infravermelho (ver tabela de materiais), mas atividade de gaiola em casa também pode ser avaliada com programas alternativos. Desvio de atividade de gaiola em casa de níveis de controle (por exemplo, hipoatividade, hiperatividade) pode ser um sinal de bem-estar prejudicada.
   1. Inicie o programa.
   2. Escolha um intervalo de amostra de 1 min e um tempo de aquisição de 24 h, significando que impulsos são registrados a cada minuto por 24 h.
      Nota: Se o experimentador entra na sala, várias vezes após a gravação, só usar dados de períodos, quando ratos não foram perturbados (ou seja, durante o período escuro).
   3. Resumir a intervalos de 10 min de impulsos.
   4. Calcule a área sob a curva de tempo (impulsos × min).
3. Comportamento de construção de ninho
   Nota: Ninhos complexos e altos podem servir como um indicador de bem-estar.
   1. Coloque uma nestlet de algodão quadrado (ver Tabela de materiais) com um peso definido (por exemplo, 2,0 g) no meio da jaula.
   2. Marca o ninho em uma escala de 5 pontos (veja abaixo) de acordo com o Diácono¹⁴ na manhã seguinte, cerca de 2 h após a luz acende. Pese todas as partes nestlet ileso que são pelo menos 5% do peso inicial de nestlet. Marcar os ninhos como segue¹⁴
      1. Atribua Pontuação de "1" se 90% da nestlet intacto.
      2. Atribua o resultado de "2" se for 50-90% intacto.
      3. Atribuir pontuação "3" se 50-90% do nestlet é desfiado.
      4. Atribuir pontuação "4" se mais de 90% é desfiado mas ninho é plano, e inferior a 50% de sua circunferência é maior do que a altura do corpo do mouse quando enrolado.
      5. Atribuir pontuação "5" se mais de 90% nestlet é desfiado e ninho é alto, e mais de 50% de sua circunferência é maior do que a altura do corpo de um rato enrolado.
4. Metabólitos de corticosterona fecal
   Nota: Aumentos da FCM acima do nível de controle refletem níveis de estresse agudo durante o período de 24 horas pós-anestésica.
   1. Coletar todos os chumbos fecais secos da gaiola usando fórceps no final do período de observação de 24 horas e eliminar molhadas pelotas contaminadas com urina.
   2. Extraia o FCM segundo Palme et al ¹⁷, como se segue.
      1. Amostras fecais secas a uma temperatura de 60-70 ° C.
      2. Homogeneizar as amostras fecais usando um almofariz.
      3. Agite uma alíquota de 0,05 g com 1 mL de metanol a 80% em um tubo de centrifugação por 30 min em um vórtice de multi.
      4. Centrifugar as amostras a 2500 x g, durante 15 min.
      5. Pipete 0,5 mL do sobrenadante para outro tubo de centrifugação.
      6. Armazenar amostras fecais (e extratos) com um mínimo de-18 ° C.
      7. Analise a FCM usando um 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one enzima imunoensaio (EIA)^18,19 ou outro EIA totalmente validado.
   3. Calcule a taxa de variação percentual das concentrações de FCM em relação as concentrações de FCM de linha de base.

6. free paradigma exploratória

1. Pegue a gaiola casa fora do lugar e coloque-o sobre uma superfície de tabela no final do período de observação de 24 horas.
2. Coloque um top quadriculado gaiola (sem alimentos ou garrafas de água) na gaiola em um ângulo de 45° para o lado mais comprido da gaiola.
   Nota: Não destruir o ninho, que serve como um esconderijo para o mouse, mas coloque a parte superior da gaiola diagonalmente acima do ninho.
3. Monitor ou vídeo-registro os ratos durante 10 minutos a uma distância de aproximadamente 1,5 m.
   1. Inicie o temporizador.
   2. Observe todas as vezes quando o mouse sobe até o topo da gaiola (com todas as quatro patas na parte superior da gaiola) ou deixa o topo da gaiola (com uma ou mais patas no chão gaiola).
      Nota: Alguns ratos podem subir até o topo da gaiola e deixá-lo a fim de caminhar ao longo da borda da gaiola. Alguns ratos também traseira na parte superior da gaiola. Trate estes casos como se os ratos ainda estavam na parte superior da gaiola.
4. Avaliar parâmetros seguindo Bert et al ²⁰.
   1. Analise a latência para primeira exploração (em segundos).
   2. Analise o número de explorações.
   3. Analise a duração total (em segundos) de exploração.
      Nota: Uma alta latência a primeira exploração, um baixo número de explorações e uma baixa duração total de exploração pode indicar níveis mais elevados de ansiedade traço.

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Resultados

Este protocolo foi originalmente desenvolvido para avaliar o bem-estar de camundongos C57BL/6JRj, seguindo uma experiência única de isoflurano anestesia (uma sessão de 45 minutos de anestesia, n = 13 fêmeas) ou anestesia repetida isoflurano (seis sessões de 45min anestesia com 3-4 dias entre as sessões de anestesia, n = 13 fêmeas) comparado com o bem-estar dos ratos controle (n = 6 fêmeas)¹⁰, que recebeu sem anestesia, mas foram testados de acordo com as me...

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Discussão

O protocolo foi originalmente desenvolvido para avaliar o bem-estar de camundongos C57BL/6JRj que recebeu uma única anestesia ou anestesia repetida de isoflurano. Os resultados confirmam que testes de comportamentos de luxo, bem como outras medidas (por exemplo, o paradigma exploratório livre, a MGS, ingestão de alimentos Scelotes) eram sensíveis métodos para avaliar o bem-estar. Isoflurano repetidas anestesia causou efeitos a curto prazo no comportamento de relacionados à ansiedade traço, MGS e comportam...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluran	CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH	1214
InfraMot - Sensore Units	TSE Systems	302015-SENS
InfraMot - Control Units	TSE Systems	302015-C/16
InfraMot - Software	TSE Systems	302015-S
Nestlet N	Ancare - Plexx	NES3600
Camera EOS 350D	Canon