基于芯片的数字 PCR 检测新鲜冷冻胃癌组织中的一个CDH1罕见转录变体

摘要

该手稿描述了一种基于芯片的数字 PCR 方法, 用于检测从胃癌患者中获得的新鲜冰冻正常和肿瘤组织中罕见的CDH1转录变体 (CDH1a)。

摘要

CDH1a是CDH1基因的非规范化转录, 它被发现在一些胃癌 (GC) 细胞系中表达, 而在正常的胃粘膜中没有。最近, 我们在 GC 患者的新鲜冰冻肿瘤组织中检测到了CDH1a成绩单变体。本文采用基于芯片的数字 PCR (dPCR) 方法, 研究了该变异体在组织样品中的表达。dPCR 提供了一个准确的, 强健的, 高度敏感的核酸测量的潜力, 并越来越多地用于不同领域的应用。dPCR 能探测稀有目标;此外, dPCR 提供了绝对和精确的核酸定量的可能性, 不需要校准仪和标准曲线。事实上, 反应分区从背景中丰富了目标, 提高了放大效率和对抑制剂的耐受性。这样的特性使 dPCR 成为检测CDH1a稀有脚本的最佳工具。

引言

CDH1基因对 e-钙黏蛋白进行编码, 这是通过调节细胞黏附、存活、增殖和迁移来维持正常胃上皮的关键因素,¹。由于CDH1的有害系或体细胞的改变而导致 e-钙黏附蛋白的丧失, 已与 GC²³的开发相关。来自基因内含子2的非规范转录也被假设在胃癌癌变中起到一定作用^4,5。特别是, 一个这样的成绩单, CDH1a, 已被证明是用 GC 细胞系表达, 但没有从正常胃⁴。最近, 我们在 gc 患者使用基于芯片的 dPCR⁵中检测到气相色谱组织样本中的CDH1a 。dPCR 用于第一次评估在肠道 GC 和正常组织中存在的 CDH1a基因转录。

测定基因表达的金标准方法是实时定量 PCR (qPCR)。但是, 结果数据有时可能是可变的, 质量较差, 尤其是当样本中的目标级别较低时。这种变化可能是由污染物引起的, 它抑制聚合酶活性和底漆退火, 导致非特异的放大和竞争性的副反应⁶。

虽然 dPCR 的基本生物化学原理与 qPCR 相似, 但 dPCR 显示出一些优势, 允许对基因组 dna (gDNA)/互补 dna (cDNA) 分子进行非常精确的测量。事实上, dPCR 是一个最终点的反应, 它依赖于将一个样本的标定分成数千个井, 因此每个井都包含零个或一个目标分子。放大然后发生在包含目标的拷贝的井, 并且由一个萤光信号指示。然后, 通过用二项式泊松统计值确定正向总分区的比值来计算原始样本中的目标分子的绝对数量⁷。

此外, dPCR 技术消除了运行标准曲线的需要, 从而避免了相关的偏差和可变性, 从而可以直接量化目标^8,9;由于其对抑制剂的高耐受性, 它可以独立于污染物和效率产生更精确和可重现的结果¹⁰;它比 qPCR 更灵敏、更特异, 因此是检测稀有靶点的可靠方法。最后, 将样本分成多个反应, 减少了与背景分子的竞争, 提高了目标检测的极限, 使放大成为可能, 并促进了单分子 gDNA/cDNA 的检测⁶.以芯片为基础的核酸的检测和定量 dPCR 已越来越多地应用于拷贝数变异, DNA 片段的量化, 和突变分析^11,12,13, 给出精度和低材料输入要求的方法。另外, dPCR 最近被集成了入分析 rna¹⁴和基因抄本^5,15。

研究方案

该议定书遵循红外人类研究伦理委员会的准则。

注: 本程序专门用于检测人类新鲜冰冻组织中的少量 cDNA 分子。组织切片已被切割在干冰上, 同时仍被冰冻, 从先前经证实的病人衍生的胃肿瘤或正常组织标本。

1. RNA 的分离纯化

1. RNA 提取
   注意: 使用特定产品在引擎盖下执行 RNA 隔离 (请参见材料表)。但是, 市面上有各种隔离套件。
   1. 质 50-100 毫克的细切新鲜冷冻组织样品在1.5 毫升管与1毫升的 RNA 隔离试剂和漩涡大力十五年代. 在-80 ° c 的夜间孵育管。
   2. 在室温下孵育含有样品的试管5分钟, 并由涡流在十五年代混合。
   3. 保持在冰上的管, 增加200µL 的氯仿, 和漩涡大力十五年代。
   4. 孵育管在室温下为六十年代和离心机在 1.2万 x g 为15分钟在4° c。
   5. 在1.5 毫升管中转移水相, 并加入20µg 的糖原。
      注意: 重要的是要小心避免转移任何的界面或有机层, 以减少污染。
   6. 加入500µL 的异丙醇, 倒置管混合, 在冰上孵育10分钟。
   7. 离心管在 1.2万 x g 为15分钟在4° c 沉淀 RNA。
      注: RNA 会出现在试管的侧面和底部的凝胶状颗粒中, 通常在离心后是隐形的。
   8. 除去上清液而不干扰沉淀, 用移1毫升75% 乙醇洗涤。
   9. 离心管在 7500 x g 为5分钟在4° c 和去除上清, 不用干扰药丸。
   10. 让颗粒干燥, 直到沉淀变得透明, 并溶解在50µL 的核糖核酸无水。
   11. 在定量之前, 至少在一夜之间将样品冷冻在-80 ° c。
2. 基因组 DNA 清除与 RNA 纯化
   注: dnasei 消化步骤, 其次是基于柱的 RNA 纯化, 建议用于分析低丰度目标, 以消化污染的 DNA。
   1. 溶解冻干 dnasei I (1500 Kunitz 单位) 在550µL 的核糖核酸无水使用注射器, 混合轻轻地倒置小瓶, 并将重组的库存解决方案分为等分。
   2. 在一个1.5 毫升的管传输的样本量计算与15µg 的 RNA, 10 µL dnasei 消化缓冲剂 (列于材料表), 2.5 µL dnasei I 库存解决方案, 核糖核酸-免费水到100µL. 室温孵育10分钟。
   3. 添加350µL 的组织裂解缓冲液 (从工具箱中, 请参阅材料表) 并由移混合。
   4. 添加250µL 100% 乙醇和混合移。
   5. 将整个卷 (700 µL) 转换为新的自旋柱, 并在 1.2万 x g 上离心十五年代。
   6. 将过滤器转换为新的收集管, 将500µL 80% 乙醇添加到柱上, 然后在 1.2万 x 克上离心2分钟。
   7. 打开旋转柱的盖子, 在 1.2万 x 克上离心5分钟, 用新的收集管将过滤器烘干;然后将过滤器转到1.5 毫升管。
   8. 将14µL 的无核糖核酸水直接添加到过滤器柱上, 并在 1.2万 x g 离心1分钟。
   9. 保持样品在冰上, 并进行量化使用2µL 的样品在一个台式分光光度计或存储在-80 ° c 的 RNA, 直到使用。

2. cDNA 合成

1. 放置 1000 ng RNA, 4 µL 的主混合, 1 µL 的逆转录酶, 和核糖核酸无菌的水到最后的体积20µL 在一个不育的 PCR 管。轻轻地混合, 向下旋转。
2. 在热循环中孵育反应混合物, 应用以下条件: 5 分钟在25° c, 30 分钟在42° c, 5 min 在85° c。
3. 离心管的简要, 并进行 dPCR 分析或存储在-20 ° c, 直到需要。

3. 数字 PCR 反应的建立

1. dPCR 反应混合和样品制备
   1. 在室温下解冻主混合和化验至少20分钟。
   2. 在6µL 的水中, 将 cDNA 样本稀释到 300 ng 的浓度。
   3. 轻轻地漩涡主混合和准备混合在一个无菌管与8.7 µL 的主混合, 0.87 µL 的CDH1a定制设计的化验底漆, 和1.83 µL 核酸无水的最后量11.4 µL。
      注: 对于CDH1a自定义的检测底漆详细信息, 请参阅材料表。
   4. 将准备好的混合物的11.4 µL 转移到稀释的 cDNA 样本, 轻轻地混合, 并简要地离心。
      注: 卷包括20% 的过剩, 以弥补移的体积损失。准备所有样品和无模板控制 (NTC) 的混合。
2. 芯片准备
   注: 为了获得最佳效果, 请尽快加载芯片。
   1. 插入芯片装载器, 等待指示灯变绿。
   2. 通过轻轻地拉回柱塞 1-2 mm, 卸下浸入式液体注射器的盖子, 并松开它以方便这一步, 并将其替换为提示。
   3. 拿一个新的芯片, 并记下在盖子上写的代码, 将它与样品相关联。
   4. 小心地握住盖子的侧面, 剥去保护膜, 并将盖子与粘脸贴在正确的方向上。
   5. 小心地拿起一块芯片, 小心不要触摸内部部分, 并把它加载到芯片窝在正确的位置, 按下杠杆打开钳。
   6. 加载一个新的加载刀片到加载程序, 并轻轻地推动它, 以确保它是牢固到位。
   7. 将 dPCR 反应混合物的14.5 µL 转移到加载刀片上, 而不制造气泡或偏转刀片, 然后按黑色加载按钮将卷放在芯片上。
   8. 使用浸入式液体注射器转移大约20滴到芯片表面注意不要接触表面与提示。
      注意: 重要的是要覆盖整个表面而不溢出液体的边缘。
   9. 旋转装载机臂, 使盖子与芯片接触, 并按下十五年代。
   10. 按下盖子按钮, 释放芯片, 并返回其位置的手臂。
   11. 将组装好的芯片放在45°的角度, 并小心地将浸入式液体与注射器通过填充口, 稍微旋转芯片以确保没有气泡, 并用无菌擦拭去除多余的液体。
   12. 通过轻轻剥离芯片盖顶部的标签, 然后按下填充端口至少5秒来密封芯片机箱。
   13. 将芯片存储在黑暗中, 直到准备好装入热循环。
       注: 准备好的芯片应在2小时内使用。
3. dPCR 反应
   1. 打开盖子, 将适配器安装到两个块上, 即使使用了单个块。
   2. 将芯片放在样品块的正确位置。
      注: 填充端口必须朝向热循环的前部, 使其处于升高的位置, 以允许任何气泡浮到顶部, 而不会干扰芯片的窗口。用空筹码来平衡两个街区。
   3. 将热垫放在样品块上, 以完全覆盖芯片。
   4. 关闭盖子, 开始 PCR 运行, 应用以下条件: 保持在96° c 10 分钟;45周期60° c 为 2 min 和98° c 为三十年代;保持在60° c 为2分钟;保持在4° c。关闭热循环, 在室温下解冻芯片至少10分钟。
      注: 芯片分析必须在一小时内完成。
4. 芯片分析
   1. 打开仪表盖, 卸下散热片, 然后从适配器中取出芯片。
      注意: 将芯片存放在一个黑暗、干净的位置, 直到分析。
   2. 用异丙醇和无菌擦拭清洗芯片表面。
      注意: 检查每个芯片是否有泄漏或潜在的问题。
   3. 将 USB 插入检测器系统以保存数据。
   4. 打开检测系统的芯片托盘, 将芯片正面装入正确位置, 然后关闭托盘。
   5. 等待三十年代进行处理, 然后取出芯片并插入下一条。
   6. 等待分析完成所有处理过的芯片然后插入 USB 到计算机转移文件。
      注: 分析的总时间大约是2到3分钟/芯片。

4. 数据分析和解释

1. 连接到执行所有下游分析所需的基于云的软件平台。
2. 创建项目并导入感兴趣的芯片的所有数据文件。
3. 输入示例名称;选择 "定义芯片" 标签中使用的染料和化验。
4. 通过在 "审阅数据" 选项卡中进行可视化来确定芯片是否可以接受, 检查该样本在芯片上的加载程度以及评价的数据点。
   注: 拒绝少于1.3万评价数据点的芯片。
5. 移动到屏幕右侧所选芯片的散射图;应用阈值为6000的荧光素 amidite (家) 报告染料信号 (Y 轴) 的所有芯片。
   注: 设定的阈值可能根据所使用的化验方法而有所不同。
6. 通过使用套索工具在散射图上选择相对点, 并按 "待定" 键, 消除任何可疑的正信号以防止误报结果。所有剩余的阳性斑点均表明, 所分析的稀有靶点存在 cDNA 拷贝。

结果

使用这里介绍的过程, 我们检查了在胃新鲜冷冻组织中罕见的转录变体CDH1a的表达。dPCR 的分析是在21配对正常和癌症组织样本和11额外的肿瘤样本中进行的。CDH1a在 32 (47%) 个肿瘤中可检测到 15, 而没有正常的组织样本显示这一罕见的转录的存在⁵。在我们的分析中, 不到1.3万数据点的芯片被拒绝, 与非均质加载的芯片一样。图 1

讨论

dPCR 最初开发了为脱氧核糖核酸分子测量^10,11,12,13 , 并且在时间这技术是适应的定量的 rna 并且 RNA 抄本^{5, 14,15}。在本协议中, 我们扩展了应用程序列表, 包括检测来自新鲜冰冻组织样本的稀有记录。为此, 我们使用了相当高的 cDNA (300 ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084