Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

Resumen

El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.

Resumen

CDH1a, una no-canónico transcripción del gen CDH1 , se ha encontrado para ser expresado en algunas líneas celulares de cáncer gástrico (CG), mientras que está ausente en la mucosa gástrica normal. Recientemente, se detectó CDH1a variante de transcripción en los tejidos del tumor congelado obtenidos de pacientes con GC. La expresión de esta variante en muestras de tejido fueron investigada por el chip digital PCR (dPCR) enfoque presentado aquí. dPCR ofrece el potencial para una medición precisa, robusta y altamente sensible de los ácidos nucleicos y cada vez más se utiliza para muchas aplicaciones en diferentes campos. dPCR es capaz de detectar blancos raros; Además, dPCR ofrece la posibilidad de cuantificación absoluta y precisa de los ácidos nucleicos sin necesidad de calibradores y curvas estándar. De hecho, el repartir de reacción enriquece el objetivo del fondo, que mejora la eficiencia de amplificación y tolerancia a los inhibidores. Tales características hacen dPCR una herramienta óptima para la detección de la transcripción rara CDH1a .

Introducción

El gen CDH1 codifica para E-cadherina, un factor clave en el mantenimiento del epitelio gástrico normal a través de la regulación de la adherencia, la supervivencia, proliferación y migración de células¹. Pérdida de la proteína cadherina-como resultado del germline deletéreo o alteraciones somáticas de CDH1 se han asociado con el desarrollo del GC^2,3. Otras transcripciones resultantes del intrón 2 del gen también han presumido para desempeñar un papel en la carcinogénesis gástrica^4,5. En particular, un tal transcripción, CDH1a, se ha demostrado para ser expresados en líneas celulares de GC pero está ausente de los de estómago normal⁴. Recientemente detectamos CDH1a en muestras de tejido de GC de GC pacientes utilizando dPCR basada en chip⁵. dPCR fue utilizado para evaluar, por primera vez, la presencia de la transcripción del gene CDH1a GC intestinal y el tejido normal.

El método estándar de oro para determinar la expresión génica es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Sin embargo, los datos resultantes a veces pueden ser variable y de mala calidad, especialmente cuando el nivel de objetivo en la muestra es bajo. Esta variabilidad puede ser causada por contaminantes, los cuales inhiben la actividad de polimerasa y el recocido de la cartilla, conduciendo a la amplificación inespecífica y de reacciones del lado competitivo⁶.

Aunque los principios bioquímicos básicos de dPCR son similares a los de la qPCR, dPCR muestra algunas ventajas, lo que permite mediciones muy precisas de DNA genómico (gDNA) / complementarios las moléculas de ADN (cDNA). De hecho, dPCR es una reacción de punto final que se basa en repartir calibrado de una muestra en miles de pozos, para que cada uno también contiene cero o molécula de un solo objetivo. Amplificación se produce sólo en los pozos que contienen una copia del blanco y se indica mediante una señal fluorescente. Entonces, el número absoluto de moléculas Diana en la muestra original puede calcularse determinando la proporción de positivos a particiones total con binomial Poisson estadísticas⁷.

Además, la técnica de dPCR elimina la necesidad para el funcionamiento de una curva estándar y, por tanto, el sesgo asociado y variabilidad, lo que permite una cuantificación directa de objetivos^8,9; produce resultados más precisos y reproducibles independientemente de contaminantes y eficiencia debido a su alta tolerancia a los inhibidores de la¹⁰; es más sensible y específica que la qPCR y por lo tanto es un método fiable para la detección de un blanco raro. Por último, el repartir de la muestra en reacciones múltiples reduce la competencia con las moléculas de fondo y mejora el límite de detección de blancos, permitiendo la amplificación y facilitar la detección de las moléculas individuales del gDNA/cDNA⁶ . La detección y cuantificación de ácidos nucleicos por dPCR basada en chip se ha aplicado cada vez más para copiar la variación en el número, fragmentos de cuantificación del ADN y mutación analiza^11,12,13, dado el precisión y el material de baja entrada de requisito del método. Además, dPCR recientemente se ha integrado en el análisis de ambos microRNAs¹⁴ y gene transcripción^5,15.

Protocolo

El protocolo sigue las pautas del Comité de ética de investigación humana de primera.

Nota: Este procedimiento está diseñado específicamente para la detección de un bajo número de moléculas de cDNA en tejidos humanos, congelado. Las secciones de tejido se han reducido en hielo seco, mientras que siguen congeladas, de tumor gástrico paciente derivado previamente validado o muestras de tejido normal.

1. purificación y aislamiento de ARN

1. Extracción de RNA
   Nota: El aislamiento de RNA se lleva a cabo bajo la campana con un producto específico (véase Tabla de materiales). Sin embargo, una variedad de kits de aislamiento están comercialmente disponibles.
   1. Homogeneizar 50-100 mg finamente cortadas congeladas en fresco de muestra de tejido en un tubo de 1,5 mL con 1 mL del reactivo de aislamiento de RNA y vortex vigorosamente durante 15 s. incubar los tubos a-80 ° C durante la noche.
   2. Incubar el tubo que contiene la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos y mezclar con un vórtex durante 15 s.
   3. Mantenga el tubo en hielo, añada 200 μL de cloroformo y agitar vigorosamente durante 15 s.
   4. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 60 s y centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
   5. Transferir la fase acuosa en un tubo de 1,5 mL y agregar 20 μg de glucógeno.
      Nota: Es importante evitar cuidadosamente transferir cualquier de la interfase o capa orgánica con el fin de reducir la contaminación.
   6. Añadir 500 μl de isopropanol, invertir el tubo para mezclar e incubar en hielo durante 10 minutos.
   7. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C para precipitar el RNA.
      Nota: RNA estará presente en un pellet de gel-como en el lado y la parte inferior del tubo, a menudo invisible después de la centrifugación.
   8. Quite el sobrenadante sin molestar el precipitado y lave con 1 mL de etanol al 75% mediante pipeteo.
   9. Centrifugar el tubo a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante sin perturbar el pellet.
   10. Que el sedimento seco hasta que el precipitado se vuelve transparente y disolver en 50 μl de agua libre de ARNasa.
   11. Congelar las muestras a-80 ° C al menos durante la noche antes de la cuantificación.
2. Eliminación de ADN genómico y purificación de RNA
   Nota: Un paso de digestión ADNsa, seguido por una purificación de RNA base de columna, se recomienda para el análisis de los objetivos de baja abundancia para digerir DNA contaminante.
   1. Disolver el liofilizado DNasa I (1.500 unidades de Kunitz) en 550 μl de ARNasa-libre del agua utilizando una jeringa, mezclar suavemente por inversión del frasco y dividir la solución reconstituida en alícuotas.
   2. El volumen calculado de la muestra con 15 μg de RNA de transferencia en un tubo de 1.5 mL, 10 μl de la digestión de la ADNsa buffer del kit (enumeradas en Tabla de materiales), 2.5 μl de DNasa de solución madre y libre de Rnasa de agua a 100 μl. incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   3. Añadir 350 μl de tampón de lisis del tejido (del kit, consulte la Tabla de materiales) y mezclar mediante pipeteo.
   4. Añadir 250 μl de etanol al 100% y mezclar mediante pipeteo.
   5. Transferir todo el volumen (700 μL) en una nueva columna de spin y centrifugar a 12.000 x g durante 15 s.
   6. Transferir el filtro a un tubo nuevo de colección, Añadir 500 μl de etanol al 80% a la columna y centrifugar a 12.000 x g durante 2 minutos.
   7. Abra la tapa de la columna de spin y centrifugar a 12.000 x g durante 5 min con un tubo de colección nuevo para secar el filtro; luego transferir el filtro a un tubo de 1,5 mL.
   8. Agregue 14 μl de agua libre de ARNasa directamente en la columna de filtro y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto.
   9. Mantener las muestras en hielo y proceder a la cuantificación con 2 μl de la muestra en un espectrofotómetro de mesa o guardar el ARN a-80 ° C hasta su uso.

2. síntesis de cDNA

1. Lugar 1.000 ng de RNA, 4 μL de la mezcla principal, 1 μl de transcriptasa reversa y agua libre de ARNasa a un volumen final de 20 μl en un tubo estéril de la polimerización en cadena. Mezclar suavemente y desactivación.
2. Incubar la mezcla de reacción en el termociclador, aplicando las siguientes condiciones: 5 min a 25 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 minutos a 85 ° C.
3. Centrifugar los tubos brevemente y proceder al análisis de dPCR o almacenar a-20 ° C hasta que se necesite.

3. configurar la reacción de PCR digital

1. reacción de dPCR mezcla y preparación de muestras
   1. Descongelar la mezcla principal y el ensayo a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos.
   2. Diluir las muestras de cDNA para una concentración de 300 ng de 6 μl de agua.
   3. Suavemente vortex el amo mezclar y preparar la mezcla en un tubo estéril con 8.7 μl de la mezcla principal, 0.87 μl del primer ensayo de diseño personalizado CDH1a y 1.83 μl de agua libre de nucleasa para un volumen final de 11.4 μL.
      Nota: Para CDH1a ensayo diseñado personalizado primer detalles ver la Tabla de materiales.
   4. Transferir 11,4 μL de la mezcla preparada a la muestra de cDNA diluido, mezclar suavemente y centrifugar brevemente.
      Nota: Volúmenes incluyen exceso de 20% para compensar la pérdida de volumen de pipeteo. Preparar la mezcla de todas las muestras y no control de la plantilla (NTC).
2. Preparación de la viruta
   Nota: Para obtener resultados óptimos de carga las fichas tan pronto como sea posible.
   1. Enchufe el cargador chip y esperar hasta que el indicador luminoso se pone verde.
   2. Retire la tapa de la jeringa de líquido de inmersión tirando suavemente hacia atrás el émbolo 1-2 mm y para facilitar este paso y reemplazarlo con una punta de lanza.
   3. Un nuevo chip y tomar nota del código escrito en la tapa para asociar a la muestra.
   4. Coloque la tapa con cuidado por su lado, retire la película protectora y coloque la tapa con la cara pegajosa hacia arriba en la orientación correcta.
   5. Cuidadosamente levante un chip, teniendo cuidado de no para tocar la parte interna y cargarlo en el nido de chip en la posición correcta, presionando hacia abajo la palanca para abrir la abrazadera.
   6. Cargar una nueva hoja de carga en el cargador y empújelo suavemente para asegurarse de que esté firmemente en su lugar.
   7. Transferencia de 14,5 μl de la mezcla de reacción de dPCR sobre la cuchilla de carga sin hacer burbujas de aire o desviar la hoja, después de que prensa el negro carga botón para distribuir el volumen en el chip.
   8. Utilizar la jeringa de líquido de inmersión para transferir unos 20 gotas sobre la superficie del chip teniendo cuidado de no para tocar la superficie con la punta.
      Nota: Es importante cubrir toda la superficie sin derramar líquido sobre los bordes.
   9. Gire el brazo de la cargadora para hacer la tapa entra en contacto con el chip y presione hacia abajo para 15 s.
   10. Presione el botón para liberar el chip y volver el brazo a su posición.
   11. Sostenga el chip montado en un ángulo de 45° con cuidado prescindir la jeringa a través del puerto de llenado de líquido de inmersión, gire el chip un poco para asegurarse de que no hay burbujas de aire y retire cualquier exceso de líquido con un paño estéril.
   12. Sellar la caja de la viruta de peeling suavemente lejos la etiqueta encima de la tapa de la viruta y la prensa sobre el puerto de llenado para por lo menos 5 s.
   13. Guardar el chip en la oscuridad hasta que esté listo para cargar en el termociclador.
       Nota: Puede usarse chips preparados dentro de 2 h.
3. reacción de dPCR
   1. Abra la tapa e instale a los adaptadores para ambos bloques, incluso cuando se utiliza un solo bloque.
   2. Coloque las fichas en el bloque de muestra en la posición correcta.
      Nota: El orificio de llenado debe estar orientado hacia la parte delantera del termociclador en una posición elevada para permitir que cualquier burbuja de aire para flotar en la parte superior sin molestar a la ventana de la viruta. Utilizar fichas vacías para equilibrar los dos bloques.
   3. Coloque la almohadilla térmica sobre el bloque de muestras para cubrir completamente las virutas.
   4. Cierre la tapa y comenzar la PCR ejecutar, aplicando las siguientes condiciones: mantener a 96 ° C por 10 min; 45 ciclos de 60 ° C por 2 min y a 98 ° C por 30 s; mantener a 60 ° C por 2 min; mantener a 4 ° C. Apague el termociclador y descongelar los chips a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos.
      Nota: Análisis de la viruta deben realizarse dentro de una hora.
4. Análisis de la viruta
   1. Abra la tapa del instrumento y quite las almohadillas térmicas, luego retire las virutas de los adaptadores.
      Nota: Almacenar las virutas en un lugar oscuro y limpio hasta su análisis.
   2. Limpie la superficie del chip con isopropanol y un paño estéril.
      Nota: Inspeccione cada chip para fugas o posibles problemas.
   3. Inserte el USB en el sistema detector para guardar los datos.
   4. Abrir la bandeja del chip del sistema detector, cargar el chip boca arriba en la posición correcta y cierre la bandeja.
   5. Esperar 30 s para el procesamiento, quite el chip e Inserte el siguiente.
   6. Espere a que el análisis ser completado para todos los chips de procesado y luego inserte el USB en un ordenador para transferir los archivos.
      Nota: El tiempo total de análisis es alrededor de 2 a 3 min y virutas.

4. interpretación y análisis de datos

1. Conecte a la plataforma de software en la nube necesaria para llevar a cabo todos los análisis posteriores.
2. Crear un proyecto e importar todos los archivos de datos de las fichas de interés.
3. Introduzca el nombre de la muestra; seleccionar el tinte y análisis utilizados en la pestaña de "Chips de definir".
4. Determinar si el chip es aceptable, visualizar en la pestaña de "Datos del informe", revisando minuciosamente cómo la muestra fue cargada en el chip y cuántos puntos son evaluables.
   Nota: Rechazan chips con menos de 13.000 puntos de datos evaluables.
5. Pasemos a la trama de la dispersión de la viruta seleccionada a la derecha de la pantalla; un umbral de 6.000 para las señales de tinte fluoresceína amidite (FAM) reportero (eje y) se aplica a todas las fichas.
   Nota: El umbral puede variar sobre la base de los ensayos utilizados.
6. Quite cualquier dudosas señales positivas para evitar resultados falsos positivos, seleccionando el lugar relativo de la dispersión solar usando la herramienta lazo y pulsando en "indeterminado". Todos los restantes puntos positivos indican la presencia de copias cDNA del raro objetivo analizado.

Resultados

Utilizando el procedimiento presentado aquí, se revisaron para la expresión de la variante rara transcripción CDH1a en tejidos gástricos congelado. El análisis de dPCR fue realizado en muestras de tejido de normal y cáncer 21-emparejados y en 11 muestras de tumor adicionales. CDH1a era perceptible en los tumores de 15 clientes de los 32 (47%), mientras que no hay muestras de tejido normal demostraron la presencia de esta rara transcripción⁵...

Discusión

dPCR fue desarrollado originalmente para el ADN molecular medidas^10,11,12,13 y en el tiempo que esta tecnología fue adaptada para la cuantificación de microRNAs y RNA transcripciones^{5, 14,15}. En este protocolo hemos ampliado la lista de aplicaciones que incluyen la detección de las transcripciones ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084