Détection d’une variante de transcription Rare CDH1 dans les tissus frais congelés de Cancer gastrique par puce numérique PCR

Résumé

Le manuscrit décrit une puce numérique PCR pour détecter une variante rare du transcript CDH1 (CDH1a) en mode normal frais-congelé et tissus tumoraux obtenus de patients atteints de cancer gastrique.

Résumé

CDH1a, un relevé de notes non canoniques du gène CDH1 , s’est avéré être exprimée dans certaines lignées cellulaires de cancer de l’estomac (GC), considérant qu’il est absent dans la muqueuse gastrique normale. Récemment, nous avons détecté CDH1a variante de transcription dans les tissus frais congelés tumeur provenant de patients atteints de GC. L’expression de cette variante dans les échantillons de tissus a été étudiée par l’approche de la PCR (dPCR) en numérique de puce, présentée ici. dPCR offre le potentiel pour une mesure précise, robuste et hautement sensible d’acides nucléiques et est de plus en plus utilisé pour de nombreuses applications dans différents domaines. dPCR est capable de détecter des cibles rares ; en outre, dPCR offre la possibilité pour la quantification précise et absolue d’acides nucléiques sans nécessiter de calibrateurs et courbes d’étalonnage. En fait, la réaction de partitionnement enrichit la cible de l’arrière-plan, ce qui améliore l’efficacité de l’amplification et la tolérance aux inhibiteurs. Ces caractéristiques rendent dPCR un outil optimal pour la détection de la transcription de rares CDH1a .

Introduction

Le gène CDH1 code E-cadhérine, un facteur clé dans le maintien de l’épithélium gastrique normal grâce à la régulation de l’adhérence, la survie, la prolifération et la migration des cellules¹. Perte de protéine E-cadhérine par suite de la lignée germinale délétère ou des altérations somatiques de CDH1 a été associées au développement de GC^2,3. Non-canonical transcriptions résultant de l’intron 2 du gène ont également émis l’hypothèse pour jouer un rôle dans la cancérogenèse gastrique^4,5. En particulier, une telle transcription, CDH1a, s’est avérée être exprimée dans les lignées cellulaires GC mais est absente de l' estomac normal⁴. Nous avons décelé récemment CDH1a dans des échantillons de tissus de GC de patients GC à l’aide de la puce dPCR⁵. dPCR a permis d’évaluer, pour la première fois, la présence de la transcription de gène de CDH1a en GC intestinal et dans les tissus normaux.

La méthode de l’étalon-or pour déterminer l’expression des gènes est PCR quantitative en temps réel (qPCR). Toutefois, les données qui en résulte peuvent parfois être variable et de mauvaise qualité, surtout quand le niveau de la cible dans l’échantillon est faible. Cette variabilité peut être causée par des contaminants, qui inhibent l’activité polymérase et apprêt recuit, conduisant à l’amplification non spécifique et compétitif côté réactions⁶.

Bien que les principes biochimiques de dPCR sont semblables à ceux de qPCR, dPCR montre certains avantages, permettant des mesures très précises de l’ADN génomique (ADNg) / complémentaires des molécules d’ADN (ARNC). En effet, dPCR est une réaction de point d’arrêt qui s’appuie sur le partitionnement calibrée d’un échantillon à des milliers de puits, afin que chacun contient bien zéro ou une molécule cible unique. Amplification puis se produit seulement dans les puits contenant une copie de la cible et est indiquée par un signal fluorescent. Le nombre absolu des molécules cibles dans l’échantillon initial peut ensuite être calculé en déterminant le rapport positif au totales partitions à l’aide de binomial Poisson statistiques⁷.

En outre, la technique dPCR élimine la nécessité d’une courbe d’étalonnage en cours d’exécution et, par conséquent, le biais associés et la variabilité, ce qui permet une quantification directe de cibles^8,9; elle produit des résultats plus précis et reproductibles indépendamment de contaminants et d’efficacité en raison de sa grande tolérance aux inhibiteurs¹⁰; Il est plus sensible et plus spécifique que la qPCR et est donc une méthode fiable pour la détection d’une cible rare. Enfin, la répartition de l’échantillon dans plusieurs réactions réduit la compétition avec les molécules de fond et améliore la limite de détection de la cible, permettant l’amplification et de faciliter la détection des molécules simples de l’ADNg/ADNc⁶ . La détection et la quantification d’acides nucléiques par puce dPCR a été appliquée de plus en plus pour copier le numéro variation, fragments de quantification de l’ADN et analyse de mutation^11,12,13, compte tenu de la précision et les matières radioactives faiblement exigence de la méthode d’entrée. En outre, dPCR a récemment été intégré dans l’analyse de ces deux microARN¹⁴ et gène transcriptions^5,15.

Protocole

Le protocole suit les directives de l’IRST Human Research Ethics Committee.

Remarque : Cette procédure est spécialement conçue pour la détection d’un faible nombre de molécules de cDNA dans les tissus humains frais congelé. Les sections de tissu ont été coupées sur la glace sèche, alors qu’il est encore gelé, précédemment validé patient dérivé de tumeur gastrique ou des échantillons de tissus normaux.

1. isolement et purification

1. Extraction de l’ARN
   Remarque : ARN s’effectue sous le capot à l’aide d’un produit spécifique (voir la Table des matières). Cependant, une variété de kits d’isolation sont disponibles dans le commerce.
   1. Homogénéiser 50-100 mg d’échantillon de tissu de frais-congelé finement découpée dans un tube de 1,5 mL avec 1 mL du réactif d’isolement ARN et vortex vigoureusement pendant 15 s. Incuber les tubes à-80 ° C durant la nuit.
   2. Incuber le tube contenant l’échantillon à température ambiante pendant 5 min et mélanger au Vortex pendant 15 s.
   3. Maintenir le tube sur la glace, ajouter 200 µL de chloroforme et vortex vigoureusement pendant 15 s.
   4. Incuber les tubes à température ambiante pendant 60 s et centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
   5. Transférer la phase aqueuse dans un tube de 1,5 mL et ajouter 20 µg de glycogène.
      Remarque : Il est important de soigneusement éviter de transférer les interphase ou la couche organique afin de réduire la contamination.
   6. Ajouter 500 µL d’isopropanol, renversant le tube pour mélanger et incuber sur glace pendant 10 min.
   7. Centrifuger le tube à 12 000 g pendant 15 min à 4 ° C à précipiter la RNA.
      Remarque : Les ARN sera présent dans un culot de type gel sur le côté et le bas du tube, souvent invisible après centrifugation.
   8. Retirez le surnageant sans déranger le précipité et lavez-le avec 1 mL d’éthanol 75 % de pipetage.
   9. Centrifuger le tube à 7 500 g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant sans déranger le culot.
   10. Laisser le diabolo sécher jusqu'à ce que le précipité devient transparent et dissoudre dans 50 µL d’eau exempte de RNase.
   11. Congeler les échantillons à-80 ° C au moins une nuit avant de quantification.
2. Élimination de l’ADN génomique et purification de RNA
   Remarque : Une étape de digestion de DNase, suivie d’une purification de RNA basée sur les colonnes, est recommandée pour les analyses de faible abondance cibles afin de digérer l’ADN contaminant.
   1. Dissoudre la lyophilisé DNase I (1 500 unités de Kunitz) dans 550 µL de RNase-libre de l’eau à l’aide d’une seringue, mélanger doucement en retournant le flacon et diviser la solution reconstituée en aliquotes.
   2. Transférer dans un tube de 1,5 mL le volume calculé d’échantillon avec 15 µg d’ARN, 10 µL de DNase Digestion de la trousse (énumérées dans Table des matières), 2,5 µL de DNase I stock solution tampon et eau exempte de RNase à 100 µL. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
   3. Ajouter 350 µL de tampon de lyse tissulaire (dans le kit, voir Table des matières) et de la composition de pipetage.
   4. Ajouter 250 µL d’éthanol à 100 % et mélanger en pipettant également.
   5. Transférer la totalité du volume (700 µL) dans une nouvelle colonne à centrifuger et centrifuger à 12 000 x g pendant 15 s.
   6. Transférer le filtre dans un nouveau tube de prélèvement, ajouter 500 µL d’éthanol à 80 % de la colonne et centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min.
   7. Ouvrez le couvercle de la colonne et centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min avec un nouveau tube de prélèvement pour sécher le filtre ; transférer ensuite le filtre dans un tube de 1,5 mL.
   8. Ajouter 14 µL d’eau exempte de RNase directement à la colonne de filtrage et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min.
   9. Conserver les échantillons sur la glace et procéder à une quantification à l’aide de 2 µL de l’échantillon sur un spectrophotomètre de table ou stocker l’ARN à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

2. synthèse de cDNA

1. Place 1 000 ng d’ARN, 4 µL du mélange maître, 1 µL de la transcriptase inverse et RNase-libre de l’eau pour un volume final de 20 µL dans un tube stérile de la PCR. Mélanger doucement et tournez en bas.
2. Incuber le mélange réactionnel dans un thermocycleur, appliquer les conditions suivantes : 5 min à 25 ° C, 30 min à 42 ° C, 5 min à 85 ° C.
3. Centrifuger les tubes brièvement et procéder à l’analyse dPCR ou conserver à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

3. réaction de PCR numérique mis en place

1. réaction de dPCR mélanger et préparation des échantillons
   1. Décongeler le master mix et le dosage à température ambiante pendant au moins 20 min.
   2. Diluer les échantillons de cDNA à une concentration de 300 ng dans 6 µL d’eau.
   3. Doucement vortex le capitaine mélanger et préparer le mélange dans un tube stérile avec 1,83 µL d’eau exempte de nucléase 8,7 µL du mélange maître et 0,87 µL de l’amorce de dosage conçu personnalisé CDH1a pour un volume final de 11,4 µL.
      Remarque : Pour plus de détails CDH1a personnalisé conçu Test amorce Voir la Table des matières.
   4. Transfert de 11,4 µL du mélange prêt à l’échantillon dilué cDNA, mélanger doucement et centrifuger brièvement.
      NOTE : Volumes comprennent les excès de 20 % pour compenser la perte de volume de pipetage. Préparer le mélange pour tous les échantillons et un contrôle sans modèle (NTC).
2. Préparation de la puce
   Remarque : Pour des résultats optimaux charger les puces dès que possible.
   1. Branchez le chargeur de la puce et attendez que le voyant lumineux devient vert.
   2. Retirez le capuchon de la seringue de liquide d’immersion en tirant doucement le piston 1-2 mm et relâchez-le pour faciliter cette étape et le remplacer par un bout.
   3. Prenez une nouvelle puce et prenez note du code écrit sur le couvercle pour l’associer à l’échantillon.
   4. Tenez le couvercle avec soin à ses côtés, Décollez le film protecteur et placer le couvercle avec la face collante vers le haut dans le bon sens.
   5. Avec précaution, ramasser une puce, en prenant soin de ne pas pour toucher la partie interne et charger sur le nid de la puce dans la position correcte en appuyant sur le levier pour ouvrir la pince.
   6. Charger une nouvelle lame de charge sur le chargeur et le pousser doucement pour s’assurer qu’il est fermement en place.
   7. Transférer les 14,5 µL du mélange dPCR réaction sur la lame de chargement sans faire de bulles d’air ou dévier la lame, après qui presse le noir bouton pour distribuer le volume sur la puce de chargement.
   8. Utiliser la seringue de liquide d’immersion pour transférer environ 20 gouttes sur la surface de la puce prenant soin de ne pas pour toucher la surface avec la pointe.
      Remarque : Il est important de couvrir toute la surface sans renverser le liquide sur les bords.
   9. Tourner le bras de chargeur pour faire le couvercle entrent en contact avec la puce et appuyer sur pendant 15 s.
   10. Appuyez sur le bouton du couvercle pour libérer la puce et remettre le bras à sa position.
   11. Maintenez la puce Assemblée à un angle de 45° et soigneusement distribuer le liquide d’immersion avec la seringue dans l’orifice de remplissage, faire pivoter la puce légèrement pour s’assurer qu’aucune bulle d’air et enlever tout excès de liquide avec un chiffon stérile.
   12. Scellez le cas de la puce en douceur épluchant loin l’étiquette sur le dessus le couvercle de la puce et de la presse sur l’orifice de remplissage au moins 5 s.
   13. Stocker la puce dans l’obscurité jusqu’au moment de charger dans le thermocycleur.
       NOTE : Puces préparées doivent être utilisés dans les 2 h.
3. réaction de dPCR
   1. Ouvrez le couvercle et installez les adaptateurs pour les deux blocs, même lorsqu’un seul bloc est utilisé.
   2. Placez les jetons sur le bloc de l’échantillon dans la position correcte.
      Remarque : L’orifice de remplissage doit être orienté vers l’avant le thermocycleur en position surélevée pour permettre les bulles d’air à flotteur vers le haut sans déranger la fenêtre de la puce. Puces vides permet d’équilibrer les deux blocs.
   3. Posez le pad thermique sur le bloc pour couvrir complètement les puces.
   4. Fermer le couvercle et commencer la PCR exécuter, appliquer les conditions suivantes : tenir à 96 ° C pendant 10 min ; 45 cycles de 60 ° C pendant 2 min et 98 ° C pendant 30 s ; tenir à 60 ° C pendant 2 min ; tenir à 4 ° C. Désactiver le thermocycleur et décongeler les puces à température ambiante pendant au moins 10 min.
      Remarque : Analyse de la puce doit être effectuée dans l’heure.
4. Analyse de la puce
   1. Ouvrez le couvercle de l’instrument et retirer les protections thermiques, puis enlever les copeaux des adaptateurs.
      NOTE : Conserver les puces dans un endroit sombre et propre jusqu'à l’analyse.
   2. Nettoyer la surface de la puce avec l’alcool isopropylique et un chiffon stérile.
      Remarque : Vérifiez chaque puce de fuites ou de problèmes potentiels.
   3. Insérez la clé USB dans le système de détecteur pour enregistrer les données.
   4. Ouvrir le bac à confettis du système détecteur, charger la puce face vers le haut dans la position correcte et puis fermez le bac.
   5. Attendre 30 s à la transformation, puis retirer la puce et insérer celle qui suit.
   6. Attendez que l’analyse qui doit être rempli pour toutes les puces transformés puis insérer la clé USB dans l’ordinateur pour transférer les fichiers.
      Remarque : La durée totale de l’analyse est environ 2 à 3 min/puce.

4. interprétation et analyse des données

1. Se connecter à la plate-forme de cloud computing logiciels nécessaire pour effectuer toutes les analyses en aval.
2. Créez un projet et importer tous les fichiers de données des puces d’intérêt.
3. Entrez le nom de l’échantillon ; Sélectionnez le colorant et le dosage utilisé dans l’onglet « Définir des jetons ».
4. Déterminer si la puce est acceptable en visualisant l’il dans l’onglet « Données d’examen », vérifier comment soigneusement l’échantillon a été chargé sur la puce et les points de données combien sont évaluables.
   NOTE : Rejeter les jetons avec moins de 13 000 points de données évaluables.
5. Aller le diagramme de dispersion de la puce sélectionnée sur le côté droit de l’écran ; appliquer un seuil de 6 000 pour les signaux de colorant fluorescéine amidite (FAM) journaliste (axe y) pour tous les jetons.
   Remarque : Le seuil mis en place peut-être varier selon les tests utilisés.
6. Supprimer n’importe quel des signaux positifs douteux afin d’éviter des résultats faussement positifs en sélectionnant la place relative sur le scatter plot en utilisant l’outil lasso et en appuyant sur « indéterminée ». Toutes les places restantes de positifs indiquent la présence de copies de cDNA de la cible rare analysés.

Résultats

À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons vérifié pour l’expression de la variante rare de transcription CDH1a dans les tissus frais congelés gastriques. L’analyse par dPCR a été réalisée sur des échantillons de tissu normal et le cancer 21 paires et dans 11 échantillons de tumeur supplémentaires. CDH1a a été détecté dans 15 des 32 (47 %) des tumeurs, alors qu’aucun échantillon de tissus normaux ont montré la présence de cette transc...

Discussion

dPCR a été initialement développé pour ADN moléculaire mesures^10,11,12,13 et dans le temps, que cette technologie a été adaptée pour la quantification des microARN et RNA transcription^{5, 14,15}. Dans ce protocole, nous avons étendu la liste des applications à inclure la détection des transcr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084