Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

Özet

El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.

Özet

CDH1a, CDH1 gene, kanonik olmayan bir transkript bulundu bazı mide kanseri (GC) hücre hatlarında ifade edilecek yok ise normal mide mukozasında. Son zamanlarda, GC ile hastalardan elde edilen taze donmuş tümör dokularda CDH1a transkript varyantı tespit ettik. Bu varyant doku örneklerinde ifade burada sunulan çip tabanlı dijital PCR (dPCR) yaklaşım tarafından araştırılmıştır. dPCR Nükleik asitlerin doğru güçlü ve son derece hassas bir ölçüm için potansiyel sunmaktadır ve giderek farklı alanlardan birçok uygulama için kullanılmaktadır. dPCR nadir hedefleri tespit yeteneğine sahiptir; Buna ek olarak, dPCR Nükleik asitlerin KALİBRATÖRLER ve standart Eğriler için gerek kalmadan mutlak ve kesin miktar için imkanı sunuyor. Aslında, reaksiyon bölümleme amplifikasyon ve toleransı inhibitörleri ile artırır arka plan hedef zenginleştiriyor. Bu tür özellikleri dPCR CDH1a nadir transkript tespiti için optimum bir takım olun.

Giriş

CDH1 gen E-cadherin, önemli bir faktör normal Gastrik epitel hücre adezyon, hayatta kalma, yayılmasını önleme ve geçiş¹düzenlenmesi aracılığıyla bakım dahil için kodlar. Zararlı germline sonucunda E-cadherin protein kaybı veya somatik değişikliklere CDH1 GC^2,3gelişimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Sigara-kurallı transkript intron 2 gen / doğan da mide karsinojenezis^4,5' te bir rol olan. Özellikle, bir tür transkript, CDH1a, GC hücre hatlarında ifade edilecek göstermiştir ama yok normal mide⁴. Son zamanlarda CDH1a GC doku örneklerinde dPCR çip tabanlı⁵kullanarak GC hastalardan tespit ettik. dPCR değerlendirmek, ilk kez, CDH1a gen transkript bağırsak GC ve normal doku varlığı için kullanıldı.

Gen ifadesinin belirlemek için altın standart yöntem gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) dir. Ancak, sonuçta elde edilen veriler bazen değişken olabilir ve kalitesiz, özellikle ne zaman hedef örnek düzeyi düşüktür. Bu değişkenlik polimeraz etkinlik ve astar tavlama, non-spesifik amplifikasyon ve rekabetçi yan reaksiyonlar⁶yol inhibe kirletici neden olabilir.

DPCR Temel biyokimyasal prensipleri qPCR benzer olmakla birlikte, dPCR genomik DNA (gDNA) çok hassas ölçümler için izin bazı avantajları gösterir / Tamamlayıcı DNA (cDNA) molekülleri. Gerçekten de, dPCR böylece her de sıfır veya bir tek hedef molekül içerir, kalibre edilmiş bir örnek wells, binlerce içine bölümleme üzerinde dayanan bir son nokta reaksiyondur. Amplifikasyon sonra yalnızca bir kopyasını hedef içeren kuyu içinde oluşur ve floresan bir sinyal ile belirtilir. Orijinal örnek hedef molekülleri kesin sayısı sonra binom Poisson istatistikleri⁷kullanarak toplam bölümler için olumlu oranını belirleyerek hesaplanabilir.

Buna ek olarak, dPCR teknik standart bir eğri çalıştırmak için gereksinimini ortadan kaldırır ve bu nedenle, ilişkili önyargı ve değişkenliği, hedefleri^8,9; doğrudan bir miktar için izin kirletici ve verimliliği inhibitörleri¹⁰onun yüksek tolerans nedeniyle bağımsız olarak daha hassas ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir; daha hassas ve qPCR daha belirli ve böylece nadir bir hedef tespiti için güvenilir bir yöntemdir. Son olarak, arka plan molekülleri ile rekabet azaltır örnek birden çok tepkiler bölümleme ve hedef tespit, amplifikasyon mümkün verme ve gDNA/cDNA^{6 tek molekülleri algılama kolaylaştırmak sınırı artırır} . Algılama ve miktar Nükleik asitlerin çip tabanlı dPCR tarafından giderek uygulanmış sayı varyasyon kopyalamak için miktar DNA parçaları ve mutasyon analizleri verilen^11,12,13, hassas ve düşük malzeme gereksinimi yönteminin girdi. Buna ek olarak, dPCR son zamanlarda her iki mikroRNA'lar¹⁴ ve gen transkript^5,15analiz entegre edilmiştir.

Protokol

Protokol IRST insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.

Not: Bu yordam insan taze donmuş dokularda cDNA moleküllerinin düşük bir sayı tespiti için özel olarak tasarlanmıştır. Doku bölümleri hala donmuş, hasta kaynaklı önceden doğrulanmış Gastrik tümör ya da normal doku örnekleri ise kuru buza kesmiş olduk.

1. RNA izolasyon ve arıtma

1. RNA çıkarma
   Not: RNA izolasyon belirli bir ürün kullanarak başlık altında gerçekleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek). Ancak, yalıtım kitleri çeşitli ticari olarak kullanılabilir.
   1. Düzgün kesilmiş taze donmuş doku örneği 1,5 mL tüp içinde 50-100 mg 1 mL RNA izolasyon reaktif ve girdap ile şiddetle-gecede-80 ° C'de tüpler için 15 s. Incubate homojenize.
   2. Örnek 5 min ve mix için oda sıcaklığında vortexing 15 tarafından içeren tüp kuluçkaya s.
   3. Tüp buz üstünde tutmak, kloroform ve şiddetle 15 için girdap 200 µL ekleyin s.
   4. 60 s için oda sıcaklığında tüpler ve 4 ° C'de 15 dakika 12.000 x g, santrifüj kuluçkaya
   5. 1.5 mL tüp içinde sulu faz transfer ve glikojen 20 µg ekleyin.
      Not: Dikkatle Interphase veya organik katman kirliliği azaltmak için aktarılmasını önlemek önemlidir.
   6. İsopropanol, mix ve 10 min için buz üzerinde kuluçkaya tüpü ters çevirme 500 µL ekleyin.
   7. Tüp 4 ° C'de RNA çökelti 15dk için 12.000 x g, santrifüj kapasitesi.
      Not: RNA jel benzeri Pelet yan ve tüp, sık sık aralıklarla sonra görünmez altındaki mevcut olacaktır.
   8. Süpernatant çökelti bozmadan kaldırmak ve pipetting tarafından % 75 etanol 1 mL ile yıkayın.
   9. Tüp 7,500 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Pelet bozmadan kaldırın.
   10. Çökelti saydam hale gelene kadar kuru ve su RNase free 50 µL içinde erimesi Pelet izin.
   11. Örnekleri miktar önce en az bir gecede-80 ° C'de dondurmak.
2. Genomik DNA eleme ve RNA arıtma
   Not: bir sütun tabanlı RNA saflaştırma tarafından takip bir Dnaz sindirim adım bulaşıcı DNA sindirmek için düşük-bereket hedefleri analizleri için önerilir.
   1. I (1500 Kunitz adet) 550 µL RNase free, kullanarak, karışımı yavaşça şişeyi, ters çevirme tarafından su ve Sulandırılan hisse senedi çözüm aliquots bölmek lyophilized Dnaz geçiyoruz.
   2. Bir 1,5 mL tüp içinde örnek hesaplanan hacmi RNA'ın 15 µg ile transfer için 10 µL Dnaz sindirim tampon seti (listelenen Tablo malzemeler), 2,5 µL Dnaz, ben hisse senedi çözüm ve RNase free su 100 µL. için Incubate, oda sıcaklığında 10 dakika için.
   3. Doku lizis arabelleği 350 µL ekleyin ( Malzemeleri masaseti, görmek) ve mix pipetting tarafından.
   4. Pipetting tarafından 250 µL % 100 etanol ve karışımı ekleyin.
   5. Tüm birimi (700 µL) yeni spin sütun ve 15 için 12.000 x g, santrifüj içine transfer s.
   6. Filtrenin yeni bir koleksiyon tüp içine aktarmak, sütun ve 2 min için 12.000 x g, santrifüj 500 µL % 80 etanol ekleyin.
   7. Spin sütun ve 5 min için 12.000 x g, santrifüj kapak filtre kuruması için yeni bir koleksiyon tüp ile açın; ardından filtreyi bir 1,5 mL tüp aktarın.
   8. 14 µL RNase free su doğrudan filtre sütun ve 1 dk. için 12.000 x g, santrifüj ekleyin.
   9. Buz üzerinde örnekleri tutmak ve örnek 2 µL bir tezgah üstü Spektrofotometre kullanarak miktar geçin veya RNA-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.

2. cDNA sentezi

1. RNA, ana Mix 4 µL, ters transkriptaz ve RNase free su steril bir PCR tüp 20 µL son hacmiyle 1 µL yer 1000 ng. Karışımı yavaşça ve spin aşağı.
2. Aşağıdaki koşullar uygulayarak bir termal cycler tepki karışımda kuluçkaya: 25 ° C, 42 ° C, 85 ° C'de 5 dk, 30 dk, 5 dk
3. Kısaca tüpler santrifüj kapasitesi ve dPCR analiz için devam etmek ya da -20 ° gerekinceye kadar C'de depolayın.

3. dijital PCR reaksiyon kurmak

1. dPCR reaksiyon mix ve hazırlık örnek
   1. Ana mix ve tahlil için en az 20 dakika oda sıcaklığında erimek.
   2. CDNA örnekleri için 300 bir konsantrasyon seyreltik su 6 µL ng.
   3. Yavaşça girdap master mix ve steril tüp 8.7 µL ana karışımı, CDH1a özel tasarlanmış tahlil astar 0,87 µL ve 1.83 µL nükleaz ücretsiz su karışımında 11,4 µL son bir hacim için hazırlamak.
      Not: CDH1a özel tasarlanmış tahlil astar Ayrıntılar için Malzemeler tablobakın.
   4. Hazırlanan karışımı 11,4 µL seyreltilmiş cDNA örneğe transfer karışımı yavaşça ve kısaca santrifüj kapasitesi.
      Not: Pipetting birim kaybı telafi etmek için % 20 fazla birimler içerir. Mix tüm örneklerini ve bir şablon kontrol (NTC) için hazırlayın.
2. Çip hazırlık
   Not: en iyi sonuçlar için en kısa zamanda fişleri yükleyin.
   1. Çip yükleyici takın ve gösterge ışığı yeşile kadar bekleyin.
   2. Daldırma sıvı şırınganın kapağını yavaşça pistonu geri çekerek çıkarın 1-2 mm ve serbest bırakmak o bu adımı kolaylaştırmak ve bir ucu ile değiştirmek için.
   3. Yeni bir çip ve örnek ile ilişkilendirmek için kapak üzerinde yazılı kodunu not al.
   4. Kapağı dikkatlice onun yanında tutun, koruyucu film peel away ve kapak ile yapışkan yüzü yukarı doğru yönde yerleştirin.
   5. Dikkatli bir şekilde iç kısmına dokunmamaya dikkat çekici bir yonga, almak ve kelepçe açmak için kolu aşağı basarak doğru pozisyonda çip yuvada üzerine yükleyin.
   6. Yeni bir yükleme bıçak üzerine yükleyici yüklemek ve yavaşça sıkıca yerinde olduğundan emin olmak için itin.
   7. 14,5 µL üzerine yükleme bıçak dPCR reaksiyon karışımı hava kabarcıkları yapmadan aktarmak veya bıçak, hangi basın sonra çipi birimde dağıtmak için düğmesini yükleme siyah saptırma.
   8. Daldırma sıvı şırınga ucu ile yüzey dokunmak dikkat çekici küçük parça yüzeyine yaklaşık 20 damla aktarmak için kullanın.
      Not: Tüm yüzey üzerinde kenarları sıvı dökmeden karşılamak önemlidir.
   9. Çip temas gel de için 15 aşağı tuşuna basın kapak yapmak için yükleyici kol döndürmek s.
   10. Çip serbest bırakmak ve kol konumuna döndürmek için kapak düğmesine basın.
   11. Birleştirilmiş çip bir 45 ° açıyla tut ve dikkatle daldırma sıvı dolgu bağlantı noktası üzerinden şırınga dağıtmak, biraz hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olmak için çip döndürün ve herhangi bir aşırı sıvı bir steril bezle çıkarın.
   12. Yavaşça uzakta etiket üstünde tepe-in belgili tanımlık küçük parça kapağı ve sıkıştırma için en az 5 dolgu bağlantı noktası üzerinden peeling tarafından çip durumda mühür s.
   13. Çip termal cycler yüklemek için hazır kadar karanlıkta saklamak.
       Not: Hazırlanan cips içinde 2 h kullanılmalıdır.
3. dPCR tepki
   1. Kapağı açın ve tek bir blok kullanıldığında bile bağdaştırıcıların her iki blok için yükleyin.
   2. Fişleri örnek blok doğru pozisyonda yerleştirin.
      Not: Dolgu bağlantı noktası termal cycler yükseltilmiş bir konumda float üst herhangi bir hava kabarcıkları çip pencere bozmadan izin vermek için önüne doğru odaklı olmalıdır. Boş cips iki blok dengelemek için kullanın.
   3. Termal pad tamamen fişleri kapsayacak şekilde örnek blok yatıyordu.
   4. Kapağı kapatın ve aşağıdaki koşullar uygulama çalıştırmak, PCR başlatın: 10 dk; 96 ° C'de tutun 60 ° C için 2 dk ve 98 ° C 45 devir için 30 s; 2 min için 60 ° C'de tutun; 4 ° C'de tutun Termal cycler açmak ve fiş en az 10 dakika oda sıcaklığında erimek.
      Not: Chip analiz bir saat içinde gerçekleştirilmesi gerekir.
4. Çipi analiz
   1. Araç kapağını açın ve termal yastıkları kaldırın, sonra fişleri bağdaştırıcıları kaldırın.
      Not: çipleri analiz kadar karanlık, temiz bir yerde saklayın.
   2. Çip yüzeyi isopropanol ve steril mendil ile temizleyin.
      Not: her küçük parça için sızıntıları veya olası sorunları inceleyin.
   3. USB verileri kaydetmek için Dedektör sistemi yerleştirin.
   4. Detektör sisteminin çip tepsisini açmak, çipi yukarı doğru pozisyonda yük ve tepsiyi kapatın.
   5. 30 bekle s işleme, sonra yonga kaldırmak ve bir sonraki ekleyin.
   6. İşlenmiş yongaları için tamamlanması daha sonra bir bilgisayara dosya aktarmak için USB takın analizi için bekleyin.
      Not: Toplam analiz yaklaşık 2 3 dk/çip için zamanı.

4. veri analizi ve yorumu

1. Aşağı akım analizleri yürütmek için gereken bulut tabanlı yazılım platformu bağlayın.
2. Bir proje oluşturmak ve tüm veri dosyaları faiz fiş alın.
3. Örnek adını girin; boya ve tahlil "Define Chips" sekmesinde kullanılan seçin.
4. Çipi nasıl iyice örnek çip dolu olduğunu ve ne kadar çok sayıda veri noktası değerlendirilebilen denetleme "Gözden geçirme veri" sekmesinde görüntülenmesi tarafından kabul edilebilir olup olmadığını.
   Not: daha az 13.000 değerlendirilebilen veri noktaları ile fiş reddetmek.
5. Ekranın sağ tarafındaki seçili çipin dağılım çizim için taşımak; 6000 floresein amidite (FAM) muhabir boya sinyalleri (y ekseni) için bir eşik için tüm fişleri geçerli.
   Not: kullanılan deneyleri temel alınarak ayarlanan eşik değişebilir.
6. Kement aracını kullanarak ve "belli değil" tuşuna basarak dağılım göreli oracıkta seçerek yanlış pozitif sonuçlar önlemek için herhangi bir şüpheli olumlu sinyaller arsa kaldır. Tüm kalan olumlu noktalar analiz nadir hedef kopyalarını cDNA varlığını gösterir.

Sonuçlar

Burada sunulan yordamı kullanarak, Gastrik taze donmuş dokularda nadir transkript değişken CDH1a bir ifade için kontrol ettik. DPCR göre analiz 21 eşleştirilmiş normal ve kanser doku örnekleri ve 11 ek tümör örnekleri gerçekleştirildi. CDH1a 32 üzerinden 15 (% 47) tümör tespit iken bu nadir transkript⁵varlığı yok normal doku örneği gösterdi. Homojen olmayan yükleme çiplerle olduğu gibi bizim analizi, daha az 13.000 veri ...

Tartışmalar

dPCR Aslında DNA moleküler ölçümleri^10,11,12,13 ve miktar mikroRNA ve RNA transkript^{5için bu teknoloji uyarlanmıştır zamanında geliştirildi, 14,15}. Bu protokol için taze donmuş Doku örneklerinden elde edilen nadir transkript tespiti dahil etmek için uygulamaların listesini genişletmi?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084