칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

요약

원고는 칩 기반 디지털 PCR 분석 결과를 신선한 냉동 정상에 드문 CDH1 사본 이체 (CDH1a) 및 위 암 환자에서 얻은 종양 조직 검출을 설명 합니다.

초록

반면 결 석 CDH1a, CDH1 유전자의 정식이 아닌 대 본 일부 위 암 (GC) 셀 라인에 표현 될 발견 되었습니다 정상 위 점 막에서. 최근에, 우리는 GC 가진 환자에서 얻은 신선한 냉동 종양 조직에 CDH1a 사본 이체를 감지. 조직 샘플에서이 이체의 식 칩 기반 디지털 PCR (dPCR) 접근 방식에 의해 여기에 제시 된 조사 했다. dPCR 핵 산의 정확한, 강력한, 그리고 매우 중요 한 측정에 대 한 잠재력을 제공 하 고 점점 더 다양 한 분야에 많은 응용 프로그램에 대 한 활용. dPCR는 감지 드문 목표; 또한, dPCR는 교정기 및 표준 곡선에 대 한 필요 없이 핵 산의 완전 하 고 정확한 정량화에 대 한 가능성을 제공합니다. 사실, 증폭 효율과 억제제에 내성 향상 배경에서 대상을 풍요롭게 반응 분할. 이러한 특성 dPCR CDH1a 희소 한 대 본의 검출을 위한 최적의 도구를 확인합니다.

서문

CDH1 유전자 세포 접착, 생존, 확산, 및 마이그레이션¹의 규제를 통해 정상적인 위 상피의 유지에 관여 하는 핵심 요소 E cadherin 위한 인코딩합니다. 해로운 생식의 결과로 전자 cadherin 단백질의 손실 또는 CDH1 의 체세포 변경 GC^2,3의 개발과 관련 된 되었습니다. Intron의 유전자 2에서 발생 하는 비 정식 성적 증명서 또한 위 발암^4,5에 역할을 가설 되어 있다. 특히, 이러한 한 사본, CDH1a, GC 셀 라인에 표현 될 표시 되었습니다 하지만 결 석 정상 위⁴에서. 우리는 최근 칩 기반 dPCR⁵를 사용 하 여 GC 환자에서 GC 조직 샘플에서 CDH1a 를 감지. dPCR CDH1a 유전자 사본 장 GC에 정상 조직에의 존재를 처음으로 평가 하는 데 사용 되었다.

유전자 발현을 확인 하기 위해 표준 방법은 실시간 양이 많은 PCR (정량)입니다. 그러나, 결과 데이터 때로는 변수 수 이며 가난한 품질, 특히 때 샘플에는 대상의 수준 낮은. 이 변화는 일반적인 증폭 및 경쟁 측 반응⁶뇌관 어 닐 링, 및 중 합 효소 활동을 억제 하는 오염 물질에 의해 발생할 수 있습니다.

DPCR의 기본적인 생 화 확 적인 원리는 정량의 그들과 유사 하, dPCR genomic DNA (gDNA)의 매우 정확한 측정을 위해 수 있도록 하는 몇 가지 장점을 보여줍니다 / 보완 DNA (cDNA) 분자. 실제로, dPCR 각각 잘 0 또는 단일 대상 분자 포함 되도록 수천 웰 스, 샘플의 보정 분할에 의존 하는 끝점 반응입니다. 증폭 대상의 복사본을 포함 하는 우물에만 발생 합니다 그리고 형광 신호에 의해 표시 됩니다. 원래 샘플에서 대상 분자의 절대 수 다음 이항 포아송 통계⁷를 사용 하 여 전체 파티션을 긍정적인의 비율을 결정 하 여 계산할 수 있습니다.

DPCR 기술 표준 곡선을 실행 하기 위한 필요성을 제거 하는 또한, 및, 따라서, 연결 된 바이어스 및 다양성, 대상^8,9;의 직접 정량화에 대 한 허용 그것은 오염 물질과 효율성 억제제¹⁰; 높은 관용 때문에 독립적으로 더 정확 하 고 재현 가능한 결과 생산 하 그것 더 과민 하 고 정량, 보다 구체적 이며 따라서 드문 대상의 검출에 대 한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 마지막으로, 여러 반응으로 샘플의 분할 배경 분자와 경쟁 줄어들고 대상 검출, 증폭을 가능 하 게 하 고 gDNA/cDNA^{6의 단일 분자의 검출 한계 향상} . 검색 및 칩 기반 dPCR에 의해 핵 산의 정량화 점점에 적용 된 복사 번호 유사, DNA의 정량화는 파편, 그리고 돌연변이 분석^11,,1213, 주어진는 정밀도 낮은 자료 입력 방법의 요구 사항. 또한, dPCR는 최근 두 microRNAs¹⁴ 그리고 유전자 사본^5,15의 분석에 통합 되었습니다.

프로토콜

프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

참고:이 절차는 신선한 냉동 인간의 조직에 cDNA 분자의 낮은 수의 탐지를 위해 특별히 설계 되었습니다. 조직 섹션 동안 여전히 동결, 이전 검증된 환자 파생 위 종양 또는 정상적인 조직 샘플에서 드라이 아이스에 잘라 왔다.

1. RNA 분리 및 정화

1. RNA 추출
   참고: 특정 제품을 사용 하 여 후드 RNA 격리 수행 ( 재료의 표참조). 그러나, 격리 키트의 다양 한 상업적으로 사용할 수 있습니다.
   1. 균질 RNA 격리 시 약 및 소용돌이의 1 mL와 함께 1.5 mL 튜브에 잘게 잘린된 신선한 냉동 조직 샘플의 50-100 mg 적극적으로 15 미 품에 대 한 튜브-80 ° C에서 하룻밤.
   2. 15 vortexing에 의해 5 분 및 혼합에 대 한 실 온에서 샘플을 포함 하는 튜브를 품 어 s.
   3. 얼음에 튜브를 유지, 클로 프롬, 및 15에 대 한 적극적으로 소용돌이의 200 µ L 추가 s.
   4. 60 s에 대 한 실 온에서 튜브와 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기를 품 어
   5. 1.5 mL 튜브에 수성 단계를 전송 하 고 glycogen의 20 µ g을 추가 합니다.
      참고: 그것은 신중 하 게 오염을 줄이기 위해 interphase 또는 유기 층을 전송 하지 않도록 하는 것이 중요입니다.
   6. 소 프로 파 놀, 혼합, 및 10 분 동안 얼음에 품 어 튜브 반전의 500 µ L를 추가 합니다.
   7. 12000 x g RNA 침전 하 4 ° C에서 15 분 동안에 튜브 원심
      참고: RNA 사이드와 원심 분리 후 자주 보이지 않는 튜브의 하단에 젤 같은 펠 릿에 표시 됩니다.
   8. 침전을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 pipetting으로 75% 에탄올의 1 mL와 함께 그것을 씻어.
   9. 4 ° C에서 5 분 동안 7500 x g에서 튜브 원심 고는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
   10. 펠 릿 침전 투명 하 게 될 때까지 건조 하 고 50 µ L RNase 무료 물에 용 해 보자.
   11. 부 량 전에 적어도 하룻밤-80 ° C에서 샘플을 동결.
2. 게놈 DNA 제거 및 RNA 정화
   참고: 열 기반 RNA 정화 뒤 DNase 소화 단계는 오염 DNA를 소화 하기 위해 낮은 풍부 목표의 분석에 대 한 권장.
   1. 동결 건조 된 DNase (1500 Kunitz 단위) RNase 무료의 550 µ L에 주사기, 유리병, 반전으로 부드럽게 혼합을 사용 하 여 물 어 aliquots로 재구성된 재고 솔루션 분할 해산.
   2. 15 µ g의 RNA 샘플의 계산된 볼륨 1.5 mL 튜브에 전송, DNase 소화의 10 µ L 버퍼 키트 ( 재료의 테이블에나열 된), DNase의 2.5 µ L에서에서 나 재고 솔루션 및 100 µ L. 물 RNase 무료 10 분 동안 실 온에서 품 어.
   3. 조직 세포의 용 해 버퍼의 350 µ L 추가 (장비, 재료의 표참조) pipetting으로 혼합.
   4. Pipetting으로 100% 에탄올과 혼합의 250 µ L를 추가 합니다.
   5. 새로운 스핀 열 및 15 12000 x g에서 원심 분리기로 전체 볼륨 (700 µ L) 전송 s.
   6. 새로운 컬렉션 튜브로 필터를 전송, 열 및 2 분 12000 x g에서 원심 분리기를 80% 에탄올 500 µ L를 추가 합니다.
   7. 새로운 컬렉션 튜브 필터; 건조 스핀 열 및 5 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기의 뚜껑을 열으십시오 다음 1.5 mL 튜브에 필터를 전송.
   8. 필터 십 분 12000 x g에서 원심 분리기에 직접 RNase 무료 물 14 µ L를 추가 합니다.
   9. 얼음에 샘플을 계속 벤치 정상 분 광 광도 계에는 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 정량화를 진행 하거나 사용까지-80 ° C에서 RNA를 저장할.

2입니다. cDNA 합성

1. RNA, 믹스 마스터의 4 µ L, 역전사, 및 살 균 PCR 튜브에서 20 µ L의 최종 볼륨을 RNase 무료 물 1 µ L의 장소 1000 ng. 부드럽게 혼합 하 고 아래로 회전.
2. 다음과 같은 조건 적용 열 cycler에 반응 혼합 품 어: 25 ° C, 42 ° C, 85 ° c.에 5 분에서 30 분에서 5 분
3. 튜브를 짧게 원심 dPCR 분석을 진행 하거나 필요할 때까지-20 ° C에서 저장.

3. 디지털 PCR 반응 설정

1. dPCR 반응 혼합 및 준비 샘플
   1. 적어도 20 분 동안 실 온에서 시험 하 고 마스터 믹스 해 동.
   2. 300의 농도에 cDNA 샘플 희석 물 6 µ L에서 ng.
   3. 부드럽게 소용돌이 마스터 믹스와 믹스 마스터 믹스의 8.7 µ L, CDH1a 사용자 정의 설계 분석 결과 뇌관의 0.87 µ L과 nuclease 무료 물 1.83 µ L 무 균 튜브에 11.4 µ L의 최종 볼륨에 대 한 준비.
      주: CDH1a 사용자 정의 설계 분석 결과 뇌관 세부 정보에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
   4. 준비 된 믹스의 11.4 µ L 희석된 cDNA 샘플을 전송, 부드럽게, 혼합 하 고 짧게 원심.
      참고: 볼륨 20% 초과를 pipetting 볼륨 손실에 대 한 보상을 포함 됩니다. 모든 샘플 및 아무 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대 한 믹스를 준비 합니다.
2. 칩 준비
   참고: 최적의 결과 대 한 로드 칩 최대한 빨리.
   1. 칩 로더에 연결 하 고는 표시등이 녹색 밝혀 졌 때까지 기다립니다.
   2. 살짝 다시 플런저를 당겨 침수 액체 주사기의 뚜껑을 제거 1-2 mm이 고이 단계를 촉진 하 고 팁을 공개.
   3. 새로운 칩을 받아 고 샘플 연관 뚜껑에 작성 된 코드의 숙지 합니다.
   4. 뚜껑 신중 하 게 그것의 측면에 의해, 보호 필름 벗 겨 누른 올바른 방향에서 위로 끈 적 얼굴 뚜껑을 배치.
   5. 신중 하 게 칩을 내부 부분을 건드리지 않도록 돌을 선택 하 고 열 클램프 레버를 눌러 올바른 위치에 있는 칩 둥지에 그것을 로드.
   6. 로더에 새로운 로드 블레이드를 로드 하 고 부드럽게 되도록 그것 확고 하 게 자리에 밀어.
   7. 기포 없이 로드 블레이드에 dPCR 반응 혼합의 14.5 µ L을 전송 배포는 칩에 볼륨 버튼을 로드 블랙은 보도 후 블레이드, 왜곡 또는.
   8. 침수 액체 주사기를 사용 하 여 전송 팁과 표면 접촉 하지 않도록 주의 복용 칩 표면에 약 20 방울.
      참고: 그것은 가장자리에 액체를 흘리 고 하지 않고 전체 표면을 커버 하는 것이 중요입니다.
   9. 칩을 접촉 하 고 15 눌러 뚜껑을 로더 팔 회전 s.
   10. 칩을 놓고 팔의 위치에 반환을 뚜껑 단추를 누릅니다.
   11. 조립된 칩 45 ° 각도로 하 고 신중 하 게 채우기 포트를 통해 주사기로 침수 액체 분배, 칩 없는 기포 확인을 약간 회전 누른 살 균 삭제 기능으로 어떤 과잉 액체를 제거.
   12. 부드럽게 필 링 멀리 칩 뚜껑과 보도 위에 레이블 적어도 5에 대 한 채우기 포트를 통해 하 여 칩 케이스를 밀봉 s.
   13. 열 cycler에서 로드할 준비가 될 때까지 어둠 속에 칩을 저장 합니다.
       참고: 준비 된 칩 2 시간 이내 사용 해야 합니다.
3. dPCR 반응
   1. 뚜껑 열고 단일 블록을 사용 하는 경우에 두 블록에 어댑터를 설치 합니다.
   2. 올바른 위치에 샘플 블록에 칩을 놓습니다.
      참고: 채우기 포트 칩의 윈도우를 방해 하지 않고 상단에 떠 있는 공기 방울을 허용 하는 높은 위치에서 열 cycler의 앞 쪽으로 지향 되어야 합니다. 빈 칩을 사용 하 여 두 개의 블록을 균형.
   3. 칩을 완전히 커버 샘플 블록에 열 패드를 하다.
   4. 뚜껑을 닫고 PCR 실행, 다음과 같은 조건 적용 시작: 10 분; 96 ° C에서 개최 30 60 ° C 2 분 및 98 ° C의 45 주기 s; 2 분;에 대 한 60 ° C에서 개최 4 ° c.에서 개최 열 cycler 끄고 칩 적어도 10 분 동안 실 온에서 해 동.
      참고: 칩 분석 1 시간 내에서 수행 되어야 합니다.
4. 칩 분석
   1. 악기의 뚜껑을 열고 열 패드를 제거 다음 어댑터에서 칩을 제거 합니다.
      참고: 분석까지, 깨끗 한 위치에 칩을 저장 합니다.
   2. 소 프로 파 놀과 살 균 지우기 칩 표면 청소.
      참고: 누수 또는 잠재적인 문제에 대 한 각 칩을 검사 합니다.
   3. 데이터를 저장 하는 검출기 시스템에 USB를 삽입 합니다.
   4. 검출기 시스템의 칩 트레이 열고, 올바른 위치에 있는 칩 보여지는 로드 한 다음 트레이 닫습니다.
   5. 30 대기 처리용, s 다음 칩을 제거 하 고 다음 중 하나를 삽입.
   6. 모든 처리 칩에 대 한 완료 후 파일을 전송 하는 컴퓨터에 USB를 삽입 분석을 기다립니다.
      참고: 분석에 대 한 총 시간은 약 3 분/칩 2 이다.

4. 데이터 분석 및 해석

1. 모든 다운스트림 분석을 수행 하는 데 필요한 클라우드 기반 소프트웨어 플랫폼에 연결 합니다.
2. 프로젝트를 만들고 관심의 칩의 모든 데이터 파일을 가져올.
3. 샘플 이름;을 입력합니다 염료 및 분석 결과 "정의 칩" 탭에서 사용을 선택 합니다.
4. 얼마나 철저 하 게 샘플 칩에 로드 된 및 얼마나 많은 데이터 요소는 evaluable 검사 "검토 데이터" 탭에 그것을 시각화 하 여 칩 허용 인지 확인 합니다.
   참고: 보다 13000 evaluable 데이터 요소에 대 한 칩을 거부 합니다.
5. 화면;의 오른쪽에 선택한 칩의 점도로 이동 모든 칩에 6000 fluorescein amidite (FAM) 기자 염료 신호 (y 축)에 대 한 임계값을 적용 합니다.
   참고: 설정 임계값 사용 분석에 근거 하 여 달라질 수 있습니다.
6. 제거는 분산형에 상대적인 자리를 선택 하 여 거짓 긍정적인 결과 방지 하기 위해 어떤 모호한 긍정적인 신호 플롯 올가미 도구를 사용 하 고 "미정"에서. 모든 나머지 긍정적인 명소 드문 대상 분석의 cDNA 복사본의 존재를 나타냅니다.

결과

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리는 위 신선한 냉동 조직에 드문 사본 이체 CDH1a 의 표현에 대 한 확인 합니다. DPCR에 의해 분석 및 11 추가 종양 샘플 21 쌍 정상 및 암 조직 샘플에서 수행 되었다. 아니 정상적인 조직 샘플 보여이 희소 한 대 본⁵의 존재 하는 반면 CDH1a 15 중 32 (47%) 종양에서 감지 했다. 우리의 분석으로 비 균질 로드 칩 미...

토론

dPCR는 원래 위해 개발 DNA 분자 측정^10,11,,1213 시간 microRNAs 및 RNA 사본^{5의 정량화에이 기술을 적응 했다 , 1415}. 이 프로토콜에서 우리는 신선한 냉동 조직 샘플에서 파생 된 희귀 증명서의 탐지를 포함 하는 응용 프로그램의 목록을 확...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084