Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Zusammenfassung

Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.

Zusammenfassung

CDH1a, eine nicht-kanonischen Abschrift des CDH1 -Gens hat gefunden worden, um in einigen Zelllinien von Magenkrebs (GC) ausgedrückt werden, während er fehlt in normale Magenschleimhaut. Vor kurzem erkannt wir CDH1a Abschrift Variante in Tiefkühlfrische Tumorgewebe von Patienten mit GC erhalten. Der Ausdruck dieser Variante in Gewebeproben wurde von der Chip-basierten digitalen PCR (dPCR) Ansatz hier vorgestellten untersucht. dPCR bietet das Potential für eine präzise, robust und hochempfindlichen Messung von Nukleinsäuren und wird zunehmend für viele Anwendungen in verschiedenen Bereichen genutzt. dPCR ist in der Lage erkennen selten Ziele; Darüber hinaus bietet dPCR die Möglichkeit für absolute und präzise Quantifizierung von Nukleinsäuren ohne die Notwendigkeit für Kalibratoren und Standardkurven. In der Tat bereichert die Reaktion Partitionierung das Ziel aus dem Hintergrund, der Verstärkung Effizienz und Toleranz gegenüber Inhibitoren verbessert. Diese Eigenschaften machen dPCR ein optimales Tool für die Erkennung der CDH1a selten Abschrift.

Einleitung

Das CDH1 -Gen kodiert für E-Cadherin, ein entscheidender Faktor bei der Aufrechterhaltung der normalen Magen Epithel durch die Regulierung der Zelle Adhäsion, überleben, Proliferation und Migration¹beteiligt. Verlust von E-Cadherin-Protein durch schädliche Keimbahn oder somatischen Veränderungen des CDH1 wurde die Entwicklung von GC^2,3zugeordnet. Nicht-kanonische Transkripte aus Intron 2 des Gens haben auch vermutet, um eine Rolle im Magen Karzinogenese^4,5. Insbesondere eine solche Abschrift, CDH1a, hat gezeigt, dass im GC Zell-Linien ausgedrückt werden aber fehlt aus dem normalen Magen-⁴. Wir haben vor kurzem CDH1a in GC Gewebeproben von GC Patienten mittels Chip-basierte dPCR⁵festgestellt. dPCR wurde verwendet, um zum ersten Mal das Vorhandensein der CDH1a gen Abschrift im Darm GC und im Normalgewebe zu bewerten.

Die Gold-Standard-Methode zur Bestimmung der Genexpression ist real-time quantitative PCR (qPCR). Die resultierenden Daten können jedoch manchmal Variable und von schlechter Qualität, vor allem wenn das Ziel in der Probe ist gering. Diese Variabilität kann durch Verunreinigungen, die Polymeraseaktivität und Grundierung glühen, hemmen, führt zu unspezifischen Verstärkung und wettbewerbsfähige Seite Reaktionen⁶verursacht werden.

Obwohl die biochemischen Grundlagen der dPCR ähnlich denen der qPCR sind dPCR zeigt einige Vorteile, so dass für sehr genaue Messungen von genomischer DNA (gDNA) / ergänzende DNA (cDNA) Moleküle. In der Tat ist dPCR ein Endpunkt Reaktion, die stützt sich auf die kalibrierten Partitionierung einer Probe in Tausende von Brunnen, so dass jeder gut Null oder ein Einzelziel-Molekül enthält. Verstärkung dann tritt nur in den Vertiefungen, die mit einer Kopie des Ziels und wird durch ein Fluoreszenzsignal angezeigt. Die absolute Zahl der Zielmoleküle in der ursprünglichen Probe kann dann berechnet werden, bestimmen das Verhältnis von positiven zu total Partitionen mit binomischen Poisson Statistiken⁷.

Darüber hinaus die dPCR Technik eliminiert die Notwendigkeit für eine Standardkurve ausgeführt und somit die damit verbundenen Vorurteile und Variabilität, so dass für eine direkte Quantifizierung der Ziele^8,9; Es liefert präzise und reproduzierbare Ergebnisse unabhängig von Verunreinigungen und Effizienz durch seine hohe Toleranz gegenüber Inhibitoren¹⁰; Es ist empfindlicher und spezifischer als qPCR und ist somit eine zuverlässige Methode zum Nachweis von seltenen Ziel. Schließlich die Aufteilung der Probe in mehrere Reaktionen reduziert den Wettbewerb mit Hintergrund-Moleküle und verbessert die Grenze der Zielerfassung, wodurch Verstärkung möglich und erleichtert die Erkennung von einzelnen Molekülen gDNA/cDNA⁶ . Die Erkennung und Quantifizierung von Nukleinsäuren durch Chip-basierte dPCR zunehmend zum Kopieren von Nummer Variante angewendet wurde, Quantifizierung von DNA-Fragmenten und Mutation analysiert^11,12,13, angesichts der Präzision und geringen Material Eingang Anforderung der Methode. Darüber hinaus wurde vor kurzem dPCR in die Analyse der beiden Micro-RNAs¹⁴ und gen Transkripte^5,15integriert.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien des menschlichen Ethik-Forschungskommission IRST.

Hinweis: Dieses Verfahren ist speziell für die Erkennung von eine geringe Anzahl von cDNA-Moleküle im menschlichen Tiefkühlfrische Geweben entwickelt. Die Gewebeschnitte wurden auf Trockeneis, gekürzt, während noch gefroren, aus zuvor validierten Patienten abgeleitet Magen-Tumor oder normalen Gewebeproben.

(1) RNA Isolierung und Reinigung

1. RNA-Extraktion
   Hinweis: RNA Isolierung erfolgt unter der Haube mit einem spezifischen Produkt (siehe Tabelle der Materialien). Jedoch eine Vielzahl von Isolierung Kits sind im Handel erhältlich.
   1. Homogenisieren Sie 50-100 mg von fein geschnittenen Tiefkühlfrische Gewebeprobe in einem 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL RNA Isolierung Reagenz und Vortex energisch für 15 S. Inkubation der Rohre bei-80 ° C über Nacht.
   2. Inkubieren Sie das Rohr mit der Probe bei Raumtemperatur für 5 min und Mischung von vortexen für 15 s.
   3. Halten Sie das Rohr auf dem Eis, fügen Sie 200 µL Chloroform und kräftig vortexen 15 s.
   4. Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 60 s und Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min bei 4 ° c
   5. Übertragen der wässrigen Phase in einem 1,5 mL Röhrchen und fügen Sie 20 µg von Glykogen.
      Hinweis: Es ist wichtig, sorgfältig zu vermeiden Übertragung der Interphase oder organischen Schicht um Kontamination zu reduzieren.
   6. Fügen Sie 500 µL Isopropanol, invertieren die Röhre zu mischen, und inkubieren Sie für 10 min auf Eis.
   7. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12.000 x g für 15 min bei 4 ° C, RNA auszufällen.
      Hinweis: RNA wird in eine Gel-artige Pellet auf der Seite und Boden des Röhrchens, oft unsichtbar nach Zentrifugation vorhanden sein.
   8. Entfernen Sie den Überstand ohne Störung des Niederschlags zu und waschen Sie ihn mit 1 mL 75 % Ethanol durch pipettieren.
   9. Das Rohr auf 7.500 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand zu entfernen, ohne zu stören das Pellet.
   10. Lassen Sie die Pellets trocknen, bis der Niederschlag transparent wird und in 50 µL RNase-freies Wasser auflösen.
   11. Die Proben bei-80 ° C vor der Quantifizierung mindestens über Nacht einfrieren.
2. Genomische DNA-Beseitigung und Reinigung der RNA
   Hinweis: Ein DNase Verdauung Schritt, gefolgt von einer spaltenbasierten RNA Läuterung, Analysen von niedrig-Fülle Ziele empfiehlt sich für um kontaminierende DNA zu verdauen.
   1. Lösen Sie die gefriergetrockneten DNase auf (1.500 Kunitz Einheiten) in 550 µL RNase-freies Wasser mit einer Spritze, Mischung sanft durch die Durchstechflasche umdrehen / unterteilen die rekonstituierte Stammlösung in Aliquote.
   2. In einer 1,5 mL Tube das berechnete Volumen der Probe mit 15 µg RNA übertragen, 10 µL der DNase Verdauung Puffer aus dem Kit (im Table of Materials), 2,5 µL DNase I-Stammlösung und RNase-freies Wasser zu 100 µL. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
   3. Fügen Sie 350 µL Gewebe Lyse Puffer (aus dem Kit, siehe Tabelle of Materials) und Mischen von pipettieren.
   4. Fügen Sie 250 µL aus 100 % Ethanol und Mischung von pipettieren.
   5. Übertragen Sie das gesamte Volumen (700 µL) in einer neuen Spin-Spalte und Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 s.
   6. Übertragen Sie den Filter in eine neue Kollektion-Röhre, die Spalte und die Zentrifuge bei 12.000 x g für 2 min fügen Sie 500 µL von 80 % Ethanol hinzu.
   7. Öffnen Sie den Deckel des Spin-Spalte und Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min mit einem neuen Sammlung Schlauch um den Filter zu trocknen; übertragen Sie dann den Filter auf eine 1,5 mL-Tube.
   8. Fügen Sie direkt auf die Filterspalte und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min 14 µL RNase-freies Wasser.
   9. Die Proben auf Eis und fahren Sie mit Quantifizierung mit 2 µL der Probe auf einem Benchtop-Spektralphotometer oder speichern Sie, die RNA bei-80 ° C bis zur Verwendung.

(2) cDNA Synthese

1. Statt 1.000 ng RNA, 4 µL des master-Mix, 1 µL Reverse Transkriptase und RNase-freies Wasser zu einem Endvolumen von 20 µL in ein steriles Röhrchen PCR. Vorsichtig mischen und spin-down.
2. Inkubieren Sie die Reaktion-Mix in einem Thermocycler, die folgenden Bedingungen: 5 min bei 25 ° C, 30 min bei 42 ° C, 5 min bei 85 ° C.
3. Zentrifugieren Sie die Rohre kurz und gehen Sie zum dPCR Analyse oder Lagerung bei-20 ° C bis benötigt.

3. digitale PCR-Reaktion einrichten

1. dPCR Reaktion mischen und Probenvorbereitung
   1. Tauen Sie den master-Mix und die Probe bei Raumtemperatur für mindestens 20 Minuten.
   2. Verdünnen Sie die cDNA-Proben zu einer Konzentration von 300 ng in 6 µL Wasser.
   3. Sanft Wirbel Master mischen und die Mischung in ein steriles Röhrchen mit 8,7 µL des master-Mix, 0,87 µL der CDH1a benutzerdefinierte gestaltete Assay Grundierung und 1,83 µL Nuklease-freies Wasser einem Endvolumen von 11,4 µL vorbereiten.
      Hinweis: CDH1a benutzerdefinierte gestaltete Assay Grundierung Details finden Sie in der Tabelle der Materialien.
   4. 11.4 µL der vorbereiteten Mischung der verdünnten cDNA-Probe übertragen, vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren.
      Hinweis: Bände enthalten 20 % Selbstbeteiligung Volumenverlust von Pipettieren zu kompensieren. Bereiten Sie die Mischung für alle Proben und einem keine Vorlage-Kontrolle (NTC).
2. Chip-Vorbereitung
   Hinweis: Für optimale Ergebnisse laden Sie die Chips so bald wie möglich.
   1. Der Chip-Lader stecken Sie ein und warten Sie, bis die Kontrolllampe grün leuchtet.
   2. Entfernen Sie die Kappe der Immersion Flüssigkeit Spritze durch den Kolben vorsichtig zurückziehen 1-2 mm und loslassen, um diesen Schritt zu erleichtern, und ersetzen Sie es mit einer Spitze.
   3. Nehmen Sie einen neuen Chip und notieren Sie den Code auf dem Deckel der Probe zuzuordnende geschrieben.
   4. Halten Sie den Deckel sorgfältig an ihrer Seite, ziehen Sie die Schutzfolie und legen Sie den Deckel mit dem klebrigen Gesicht nach oben in der richtigen Ausrichtung.
   5. Sorgfältig holen Sie einen Chip, kümmert sich nicht um den internen Teil berühren ab und laden Sie es auf die Chipnest in der richtigen Position durch herunterdrücken des Hebels um die Klemme zu öffnen.
   6. Laden Sie ein neues laden-Blatt auf den Loader zu und schieben Sie ihn sanft, um sicherzustellen, dass es fest im Ort ist.
   7. 14.5 µL dPCR Reaktion Mischung auf die Beladung Klinge ohne Luftblasen zu übertragen oder Ablenkung die Klinge nach dem Drücken der schwarzes laden Schaltfläche, um die Lautstärke auf dem Chip zu verteilen.
   8. Verwenden Sie die Immersion Flüssigkeit Spritze ca. 20 Tropfen auf die Chipoberfläche kümmert sich nicht um die Oberfläche mit der Spitze berühren zu übertragen.
      Hinweis: Es ist wichtig, die gesamte Fläche zu decken, ohne zu verschütten Flüssigkeit über die Kanten.
   9. Drehen Sie den Lader Arm machen den Deckel kommen in Kontakt mit dem Chip und drücken Sie für 15 s.
   10. Taste die Deckel lassen Sie den Chip und den Arm in seine Position zurück.
   11. Den montierten Chip in einem Winkel von 45° zu halten und sorgfältig verzichten die Immersionflüssigkeit mit der Spritze durch die Einfüllöffnung, Drehen des Chips leicht um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind und überschüssigen Flüssigkeit mit einem sterilen Tuch zu entfernen.
   12. Versiegeln den Chip-Fall sanft Peeling entfernt das Etikett auf dem Chip Deckel und Presse über die Einfüllöffnung für mindestens 5 s.
   13. Speichern Sie den Chip im Dunkeln erst unmittelbar in den Thermocycler zu laden.
       Hinweis: Vorbereitete Chips sollten innerhalb von 2 h eingesetzt werden.
3. dPCR Reaktion
   1. Öffnen Sie den Deckel und installieren Sie die Adapter für beide Blöcke zu, auch wenn ein einzelner Block verwendet wird.
   2. Legen Sie die Chips auf die probenblock in der richtigen Position.
      Hinweis: Die Einfüllöffnung muss auf der Vorderseite der Thermocycler in einer erhöhten Position um Luftblasen zu schweben nach oben zu ermöglichen, ohne zu stören das Fenster des Chips ausgerichtet werden. Verwenden Sie leere Chips, die beiden Blöcke auszugleichen.
   3. Legen Sie das Wärmeleitpad auf der probenblock vollständig bedecken die Chips.
   4. Schließen Sie den Deckel und starten Sie die PCR ausführen, die folgenden Bedingungen: halten Sie bei 96 ° C für 10 min; 45 Zyklen von 60 ° C für 2 min und 98 ° C für 30 s; halten Sie bei 60 ° C für 2 min; bei 4 ° c zu halten Schalten Sie den Thermocycler und tauen Sie die Chips bei Raumtemperatur mindestens 10 min lang.
      Hinweis: Chip-Analyse muss innerhalb einer Stunde durchgeführt werden.
4. Chip-Analyse
   1. Öffnen Sie den Deckel des Gerätes und entfernen Sie die Wärmeleitpads, dann entfernen Sie die Späne aus dem Adapter.
      Hinweis: Bewahren Sie die Chips in einer dunklen, saubere Lage bis zur Analyse.
   2. Reinigen Sie die Chipoberfläche mit Isopropanol und ein steriles Tuch.
      Hinweis: Untersuchen Sie jeder Chip auf Lecks oder potenzielle Probleme.
   3. Stecken Sie den USB in das Detektorsystem zum Speichern der Daten.
   4. Öffnen Sie die Spänewanne das Detektorsystem, laden Sie den Chip nach oben in die richtige Position und schließen Sie das Fach.
   5. Warten Sie 30 s für Verarbeitung, dann entfernen Sie den Chip und setzen Sie die nächsten ein.
   6. Warten Sie, bis die Analyse für die verarbeiteten Chips abgeschlossen sein, dann stecken den USB an einen Computer übertragen.
      Hinweis: Die Gesamtzeit für die Analyse ist etwa 2 bis 3 min/Chip.

(4) Daten-Analyse und Interpretation

1. Schließen Sie an die Cloud-basierte Software-Plattform erforderlich, um alle nachgeschalteten Analysen durchführen.
2. Erstellen Sie ein Projekt und importieren Sie alle Datendateien des Chips von Interesse.
3. Geben Sie den Probennamen; Wählen Sie die Farbe und Assay verwendet im Register "Definieren Chips".
4. Bestimmen Sie, ob der Chip ist durch die Visualisierung es im Reiter "Daten", überprüfen, wie gründlich die Probe auf den Chip geladen wurde und wie viele Datenpunkte auswertbar sind akzeptabel.
   Hinweis: Lehnen Sie Chips mit weniger als 13.000 auswertbaren Datenpunkte ab.
5. Fahren Sie mit dem Streudiagramm des ausgewählten Chips auf der rechten Seite des Bildschirms; alle Chips eine Schwelle von 6.000 für die Fluorescein Amidite (FAM) Reporter Farbstoff Signale (Y-Achse) zuweisen.
   Hinweis: Die Schwelle richten Sie variieren aufgrund der Assays verwendet.
6. Entfernen Sie keine dubiosen positive Signale zu falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, durch die Auswahl der relativen Stelle auf die Streuung plot mit dem Lasso-Werkzeug und drücken auf "unbestimmt". Alle verbleibenden positiven Punkte deuten auf das Vorhandensein von cDNA Exemplare des seltenen Ziels analysiert.

Ergebnisse

Bei der hier vorgestellten Verfahren haben wir uns für den Ausdruck der seltenen Transkript Variante CDH1a im Magen Tiefkühlfrische Gewebe. Die Analyse von dPCR wurde auf 21 gepaart normalen und Krebszellen Gewebeproben und in 11 zusätzliche Tumorproben durchgeführt. CDH1a war in 15 von 32 (47 %) Tumoren nachweisbar, wobei keine normalen Gewebeproben die Anwesenheit von dieser seltenen Transkript^{5 zeigte}. In unserer Analyse wurden Chips mit we...

Diskussion

dPCR wurde ursprünglich entwickelt für DNA-molekulare Messungen^10,11,12,13 und in der Zeit, die diese Technologie adaptiert wurde für die Quantifizierung von Micro-RNA und RNA Transkripte^{5, 14,15}. In diesem Protokoll haben wir erweitert die Liste der Anwendungen zur Erkennung von seltenen Transkrip...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIazol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glycogen 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit	QIAGEN	74204
iScript cDNA Synthesis kit	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT custom designed assay	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo  Scientific	75002402
Thermocycler (Labcycler)	Sensoquest	011-103
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Dual Flat Block Sample Module	Thermo Fisher Scientific	4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Scientific	4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord	Thermo Fisher Scientific	4489084