非体外循环冠状动脉旁路移植术治疗慢性心肌缺血的外科猪模型

摘要

该协议提出了一种外科大动物模型, 慢性, 单血管缺血, 导致区域异常, 但不会造成梗塞, 称为冬眠心肌。在慢性缺血的建立后, 动物用非泵浦的利马-小伙子冠状动脉旁路移植术治疗 revascularize 缺血性组织。

摘要

慢性心肌缺血损害心功能, 但不导致梗塞, 称为冬眠心肌 (HM)。冠状动脉疾病 (CAD) 患者的一个大的临床子集有, 除了造成功能受损, 使他们在心律失常和未来心脏事件更高的风险。这种情况的标准治疗是血管重建, 但这已被证明是一个不完善的治疗。大多数临床前心脏研究的重点是梗死模型的心脏缺血, 留下这个子集的慢性缺血患者大多缺乏服务。为了解决这一研究中的差距, 我们开发了一种具有良好特征和高度可重复性的猪冬眠心肌模型, 因为猪是人类心脏疾病的理想转化模型。除了建立这种独特的疾病模型, 我们已经优化了一个临床相关的治疗模式的冠状动脉旁路手术的猪。这使我们能够准确地研究旁路手术对心脏疾病的影响, 以及调查其他或替代疗法。该模型通过在一只年轻的猪的左前降 (童子) 动脉内植入一个小蟒蛇来手术诱导单血管狭窄。随着猪的生长, 蟒蛇造成了逐渐的狭窄, 导致慢性缺血的区域功能受损, 但保持组织的生存能力。在冬眠心肌表型的建立后, 我们进行非体外循环冠状动脉旁路移植手术, revascularize 缺血性区域, 模仿临床患者的金本位治疗。

引言

冠心病 (CHD) 影响了估计在美国的1550万人¹ , 是全球死亡的主要原因之一。虽然近年来冠心病的死亡率下降了, 但病人和保健系统的发病率和负担仍然很高¹。严重 CAD 的初级治疗是血管重建, 改善生存和减少心绞痛^2,3,4。然而, 心脏功能往往仍然压抑, 特别是在增加的工作量和可能进展到心力衰竭^5,6。冠状动脉旁路手术 (CABG) 治疗慢性缺血的临床试验表明, 生存和症状有改善, 但弹射分数仅显示 8-10% ^7,8的适度改善。我们的创新性和良好特征的猪慢性心肌缺血模型是一个渐进性血管狭窄的临床 CAD 模型。我们已经表明减少的心肌收缩力导致的血液流量的逐步减少⁹。心肌不梗塞, 可以保持在这种情况下可行。恢复是可能的, 虽然结果是可变的, 即使及时的血管重建。长期缺血性心肌仍然可行的特点是减少血流量和功能休息与保留收缩储备已被称为 HM 和治疗需要冠状动脉搭桥术。虽然 HM 重建术应恢复收缩功能, 实验和临床观察表明, 恢复不完整^8,10。

HM 的特点是存在的可行的, 但功能失调的心肌存在减少区域血流¹¹。尽管在休息时收缩力和新陈代谢活动受损, 但在强心剂刺激下, 他能够表现出功能性和新陈代谢的储备¹²。在大多数的冠心病患者中都有怀疑, 包括广泛的疾病。在这项协议中, 我们展示了我们建立的猪模型, 它绕过左内乳动脉 (利马) 到童子动脉, 模仿临床情况。猪提供了一个很好的模型的心脏疾病超过其他大型动物, 因为他们没有心外膜桥接络。这允许小男孩的狭窄导致区域缺血¹³。

在这里, 我们描述了通过在童子动脉中创建单血管狭窄来诱导猪冬眠心肌的手术方法。当慢性缺血已经建立 (8 周后植入的小伙子蟒蛇), 我们描述了重建的方法, 在我们的猪模型的临床治疗: 非体外循环冠状动脉旁路移植。这些手术方法不仅可用于研究慢性心肌缺血的临床相关模型, 还可以探讨旁路手术对心脏缺血的影响, 以及试验电位交替或辅助治疗心肌缺血的疗效。

研究方案

所有动物研究都获得了明尼阿波利斯 VA 医疗中心和明尼苏达大学的机构动物护理和使用委员会的批准。遵循目前的国家卫生研究院的使用和护理实验动物指南。

1. 冬眠手术

1. 动物制剂
   1. 要创建冬眠心肌模型, 使用5周的老, 女性, 约克郡猪, 它的重量在8-10 公斤的范围内以9.2 公斤作为平均重量。
   2. 对于手术前的健康监测, 在手术前3天内对动物进行称量。
   3. 在开始麻醉前将动物快速12小时。确保在任何时候都能为禁食的动物提供水。
   4. 在手术前给予 SR 丁丙诺啡0.18 毫克/千克 IM 24 小时。
2. 感应
   1. 用6.6 毫克/千克 tiletamine-zolazepam 和甲苯噻嗪鸡尾酒给予肌肉, 使动物镇静。允许5-15 分钟的药物鸡尾酒生效。
   2. 用70% 异丙醇擦拭三倍于静脉注射导管, 制备耳静脉灌装。
      注: 如果耳静脉不足, 可使用另一种外周静脉 (即头)。
   3. 双眼涂抹眼部软膏, 防止角膜干燥。
   4. 如有必要, 可通过管理1-2 毫克/千克丙泊酚 IV 或用3升/分钟的氧气和3% 异氟醚进行屏蔽, 以允许气管插管。
      注意: 当眨眼反射或颚音缺失时, 动物被认为是适当的麻醉。
   5. 用适当大小的气管导管插管动物。
3. 手术
   1. 一旦动物被麻醉, 剃掉左胸区进行手术。
   2. 以每分钟10-15 次呼吸来启动机械通气. 在1-4 升/分, 和异氟醚之间的1.0 和3.0% 之间设置氧气, 以维持手术平面的麻醉。
   3. 把监控装置放在动物身上。监测设备应包括心电图, 血压, 温度和脉搏脉搏。
   4. 将 iv 导管与0.9% 正常生理盐水的静脉注射液连接起来, 速度为5-10 毫升/千克/小时。
   5. 灌装用 FDA 批准的手术磨砂准备左侧胸。
   6. 每隔5-15 分钟对麻醉深度进行评估. 记录基线生命体征 (心率、心电图、₂、血压、ETCO₂和温度) 每15分钟。
      注意: 当眨眼反射或颚音缺失时, 动物被认为是适当的麻醉。
   7. 当动物躺在右侧时, 将不育的窗帘从脊柱的左侧放到肩胛骨上, 在无菌领域的第三个肋骨空间居中。
      注: 无菌场涉及左前肩, 包括腋窝区继续到胸骨到第六肋空间 cranially。
   8. 使用一个目标模式, 用 FDA 批准的手术方法 (如葡萄糖洗必泰) 或碘外科擦洗2分钟轻轻擦洗田间。
   9. 用清水冲洗田野, 再用 FDA 批准的方法清洗两次, 2 分钟. 在洗涤之间用水冲洗手术场, 然后用无菌毛巾或 4 x 4 厘米纱布海绵将其干燥。
   10. 用碘溶液喷洒区域, 用无菌窗帘将整个动物 (手术场除外) 披上。使用蒸汽或气体灭菌消毒的仪器, 礼服和窗帘的程序。
   11. 在第二、第三和第四肋处使用0.3 毫升 0.5% bupivicaine 的肋间神经阻滞。
   12. 在开胸前给125毫克的头孢唑啉 IV。
       注: 1.5 毫克/千克司可林 IV 可作为麻痹剂, 以减少肌肉运动的每个外科医生的要求, 在打开胸腔。
   13. 通过左开胸术暴露心脏。在心脏操作之前, 给2毫克/千克 IV 丸的利多卡因防止心律失常。用单烙做侧第三空间开胸切口。切口应从肩胛骨的颅骨侧面延伸至腋面积约10厘米. 使用烧灼切割皮肤和底层肌组织允许进入胸腔。
   14. 放置一个 finochietto 肋骨牵引器, 进入胸腔的第三肋空间, 以收回肺。
   15. 用 2-0 polyglactin 的缝合线将心包切开并缩回一侧, 露出童子动脉和静脉。用纱布覆盖的刮刀牵引器收回左心房附属物。
   16. 使用虹膜剪刀, 打开膜在小伙子。
   17. 坦率地解剖大约 0.25 cm 部分的童子动脉大约 1 cm 远端到小伙子和扬抑动脉结。用直角钳包围小伙子。
   18. 在动脉周围放置两个4-0 聚酯缝合, 不施加任何张力。
   19. 将一个直径为1.5 毫米的塑料 c 形蟒蛇置于第一对角线上, 而不阻塞该容器。
   20. 保护它与两个4-0 聚酯领带包围的小伙子。
   21. 松散关闭心包使用 2-0 polyglactin 缝合在一个简单的中断模式。
   22. 在肋间肌层闭合时, 进行呼吸保持, 从胸部取出空气。仔细监测麻醉机上的气道压力表, 以保持在适当范围内的压力20-30 厘米的水和释放时完成。
       注意: 这消除了手术后的胸管的需要。
   23. 使用2-0 和3-0 可吸收缝线, 以标准的方式关闭肌肉和皮肤层。
   24. 使用皮肤粘合剂在切口皮肤闭合。
   25. 在手术结束时, 按照切口长度在多个部位管理1毫克/千克布比卡因肌肉的总剂量。在运输到回收区前管理 meloxicam 0.2 毫克/千克平方。
   26. 当皮肤层关闭时, 将动物从呼吸机上断奶。
   27. 把动物连接到麻醉机上, 直到它能自发地呼吸, 保护反射开始返回。
   28. 不要取出气管导管, 直到动物吞下才能保护呼吸道。
   29. 在切口上应用三抗生素软膏无菌、无粘附敷料。
4. 术后
   1. 记录心率, 呼吸率, 体温和粘膜颜色每15分钟, 直到动物可以保持胸骨位置无可及。
   2. 不要让动物无人看管, 直到它能举起并抬起头, 并且可以独立站立。
   3. 给 meloxicam (0.2 毫克/千克) 皮下。
   4. 管理持续释放丁丙诺啡6小时后, 最初的手术前剂量。
   5. 将敷料留在切口上3天, 如果它保持清洁和干燥。如果衣服弄脏了就换掉。
   6. 观察手术后5天的疼痛水平, 一般的健康状况和切口情况。
      注意: 现在有一只小猪鬼脸秤可以用来评估这些动物术后的疼痛程度¹⁴。使用半剂量 meloxicam 每天需要一次突破疼痛。
   7. 单人房的动物在恢复期的5天, 以限制活动, 并允许伤口愈合。
   8. 允许8周充分发展冬眠心肌表型。

2. 血管重建或关闭泵旁路

1. 动物制剂
   1. 在手术前3天内称动物体重。
   2. 在手术前将动物快速12小时。确保在任何时候都能为禁食的动物提供水。
   3. 在手术前给予持续释放丁丙诺啡0.18 毫克/千克肌肉24小时。
2. 感应
   1. 用6.6 毫克/千克 tiletamine zolazepam/甲苯噻嗪鸡尾酒肌肉使动物镇静。镇静后5-15 分钟, 准备耳静脉灌装导管放置。
      注: 如果耳静脉不足, 可使用另一种外周静脉 (即头)。
   2. 双眼涂抹眼膏。
   3. 1-2 毫克/千克丙泊酚诱导麻醉。
   4. 用适当大小的气管导管插管动物。
3. 手术
   1. 剃须动物的胸骨, 左侧胸和股骨三角形的手术。
   2. 将机械通气设置为每分钟10-15 次呼吸, 氧气为1-4 升/分钟, 异氟醚在 1.0-3.0% 的情况下, 需要维持手术平面的麻醉。
   3. 将监测设备 (心率、心电图、₂、直接血压、ETCO₂和温度) 放置在动物身上。
   4. 将 iv 导管连接至 iv 滴, 并与正常生理盐水或系。
   5. 灌装用聚维酮碘擦洗或其他 FDA 批准的方法准备皮肤。
   6. 评估动物的麻醉深度。
      注意: 当眼睛或颚反射没有时, 动物被认为是被深深麻醉的。
   7. 定位动物背, 准备以前描述的皮肤, 用无菌毛巾将动物披上。
   8. 对股动脉和插管进行切割。使用单烙创建一个大约3厘米皮肤切口在股动脉, 以揭露它的插管。
   9. 在切口后进行股神经阻滞, 允许精确放置药物。将股骨套管连接到传感器, 以监测手术期间的血压。
   10. 使用电烧灼切割从胸骨到剑突的过程, 以及切割肌肉, 脂肪和结缔组织到胸骨的水平。
   11. 用振荡锯把胸骨分开。
       注: 使用摆动锯, 而不是标准胸骨锯避免潜在的心肌损伤从心包粘连的结果, 切口的胸壁放置在小伙子。
   12. 管理利多卡因 (2 毫克/千克 IV 负荷剂量, 50 µg/千克/分钟连续 IV 输液), 以防止心律失常。在500毫升的生理盐水中稀释利多卡因, 浓度为1毫克/毫升。
   13. 用直梅奥剪刀将后胸骨板分开。
   14. 用胸腔牵引器暴露胸腔。
   15. 用单电烧灼的粘连。
   16. 使用相同的牵引器, 与左胸骨边界温和海拔由助手, 解剖左内乳房动脉从胸壁。
   17. 用 hemoclips 控制动脉分支。
   18. Heparinize 动物用100-300 单位/公斤肝素 iv。
   19. 3分钟后, 将动脉与远端缝合。准备嫁接的近端。
   20. 打开并收回心包。确认利马的长度足以到达该小伙子的适当的吻合口部位。
   21. 使用带心脏稳定器、弹簧夹和适当大小的腔内装置的离泵技术, 执行利马到小伙子吻合7-0 聚丙烯缝合。
   22. 在左侧胸的肋骨之间放置一个胸管, 外部化并附着在真空中, 从胸腔中取出空气15-30 分钟。
   23. 用图八模式近似 #5 聚酯缝线的胸骨。
   24. 关闭肌肉, 皮下和皮肤层在通常的方式, 如在冬眠手术中描述。取出胸管, 同时执行佛氏机动, 以消除任何残余空气从胸腔和关闭切口与一个皮肤缝合。
   25. 在皮肤上涂抹皮肤粘合剂以保护胸骨切口。用7-0 聚丙烯缝线轻轻取出股骨导管, 用包绳模式修复动脉。使用 2-0 polyglactin 缝合在 subcuticular 模式下关闭皮肤。
   26. 在手术结束时, 按照切口长度在多个部位管理1毫克/千克布比卡因肌肉的总剂量。
   27. 在运输到回收区前, 管理 meloxicam 0.2 毫克/千克。
   28. 在休眠过程中遵循操作后的协议。

结果

在最初的冬眠手术后, 临床成像技术, 如血管造影或心脏 MRI (图 1A) 可以观察到大于70% 的狭窄。手术后8周, 回声或心脏 MRI 对区域功能的分析显示在增加的工作负载下功能减少 (图 2)。这可以通过刺激心脏与多巴酚丁胺 (5 毫克/千克/分钟), 并测量周向应变和区域壁厚。PET 成像显示, 与同一心脏的非童子领地相比, 冬眠?...

讨论

在这里, 我们表明, 我们的猪模型, 准确地模仿病人的临床经验, 单血管疾病和保留左心室功能。在血管重建之前, 单血管的动物在全球功能上表现出最小的损伤, 以弹射分数来衡量, 但区域壁增厚明显减少。在血管重建术后, 三月的 CMR 成像显示保留的生存能力和移植通畅性, 但持续的区域功能障碍, 如低剂量多巴酚丁胺压力测试的收缩储备的估计指出。

初始休眠操作有几个关键?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bair Hugger	3M	Model 505	Patient Warming system
SR Buprenorphine 10 mg/mL	Abbott Labs	NADA 141-434	Post operative Analgesic
Surgical Spring Clip	Applied Medical	A1801	Clamp end of LIMA after takedown
Arterial Line Kit	Arrow	ASK-04510-HF	Femoral catheter for blood pressure monitoring
1000mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1324X	IV replacement fluid
250 mL 0.9% saline	Baxter	UE1322D	Replacement IV Fluid
500mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1323Q	Drug delivery, Provide mist for Blower Mister
Flo-thru 1.0	Baxter	FT-12100	used to anastomos LIMA to L
Flo-thru 1.25	Baxter	FT-12125
Flo-thru 1.5	Baxter	FT-12150
Flo-thru 2.0	Baxter	FT-12200
Cloroprep	Becton Dickenson	260815	Surgical skin prep
Meloxicam	Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.	0010-6013-01	NSAID for analgesia
Hypafix	BSN Medical	4210	Secure wound dressing and IV catheters
IV Tubing for Blower Mister	Carefusion	42493E	Adapts to IV Fluids for Blower/Mister
Bovie Cautery hand piece	Covidien	E2516	Hemostasis
Chest Tube	Covidien	8888561043	Evacuates air from chest cavity
Monopolar Cautery	Covidien	Valleylab FT10	Hemostasis
Telpha pad	Covidien	2132	Sterile wound dressing
4-0 Tevdek II Strands	Deknatel	7-922	Suture to secure constrictor around LAD
Propofol	Diprivan	269-29	Induction agent
long blade for laryngoscope	DRE	12521	Allows for visualization of trachea for intubation
ECG Pads	DRE	1496	Monitor heart rhythm
laryngoscope	DRE	12515
Anesthesia Machine + ventilator	DRE Drager- Fabius Tiro	DRE0603FT	Deliver Oxygen and inhalant to patient
5 Ethibond	Ethicon	MG46G	Suture
0 Vicryl	Ethicon	J208H	Suture
2-0 Vicryl	Ethicon	J317H	Suture
3-0 Vicryl	Ethicon	VCP824G	Suture
7-0 Prolene	Ethicon	M8702	Suture
Dermabond	Ethicon	DNX12	Skin adhesive
Ligaclips	Ethicon	MSC20	Surgical Staples for LIMA takedown
Sterile Saline 20 mL	Fisher Scientific	20T700220	Flush for IV catheters
Telazol 100 mg/mL	Fort Dodge	01L60030	Pre operative Sedative
Triple Antibiotic Ointment	Johnson & Johnson	23734	Topical over wound
6.0 mm ID endotracheal tube	Mallinckrodt	86049	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
1" medical tape	Medline	MMM15271Z	Secure wound dressing and IV catheters
4.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43040	Establish airway for Hibernation
4.5 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43045	Establish airway for Hibernation
5.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43050	Establish airway for Hibernation
6.5 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43065	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
7.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43070	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
Bair Hugger Blanket -  Large size, underbody	Medline	AUG55501	Patient Warming system
Basic pack	Medline	DYNJP1000	Sterile drapes and table cover
Bone Wax	Medline	ETHW31G	Hemostasis of cut bone
Suction  tubing	Medline	DYND50223
Suction Container	Medline	DYNDCL03000
1 mL Syringe	Medtronic/Covidien	1188100777	Administer injectable agents
12 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881512878	Administer injectable agents
20 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881520657	Administer injectable agents
3 mL Syinge	Medtronic/Covidien	1180300555	Administer injectable agents
6  mL Syringe	Medtronic/Covidien	1180600777	Administer injectable agents
60 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881560125	Administer injectable agents
Blower Mister Kit	Medtronic/Covidien	22120	Clears surgical field for vessel anastomosis
Roncuronium	Mylan	67457-228-05	Neuromuscular blocking agent
# 40 clipper blade	Oster	078919-016-701	Remove hair from surgery sites
Hair Clipper	Oster	078566-011-002	Remove hair from surgery sites
Bupivicaine	Pfizer	00409-1161-01	Local Anesthetic
Cephazolin	Pfizer	00409-0805-01	Antibiotic
Heparin	Pfizer	0409-2720-03	anticoaggulant
Lidocaine 2%	Pfizer	00409-4277-01	Local Anesthetic/ antiarrthymic
Succinylcholine 20 mg/mL	Pfizer	00409-6629-02	Neuromuscular blocking agent
Anesthesia Monitor	Phillips  Intellivue	MP70	Supports ventilation with inhalant
Artificial Tears	Rugby	0536-1086-91	Lubricate eyes to prevent corneal drying
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Sigma Aldrich	B9275	Pre operative Analgesic for survivial procedures
Isoflurane	Sigma Aldrich	CDS019936	General Anesthestic- Inhalant
36” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX563	Connect art. Line  to transducer
48” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX564	Connect art. Line  to transducer
Jelco 18 ga IV catheter	Smiths medical	4054	IV access in Revasc, MRI and Term
Jelco 20 ga IV catheter	Smiths medical	4059	IV access in the MRI
Jelco 22 ga  IV catheter	Smiths medical	4050	IV access in Hibernation Procedure
OPVAC Synergy II	Terumo Cardiovascular System	401-230	Heart positioner and Stabilizer
Sternal Saw/ Necropsy Saw	Thermo Fisher	812822	Used to open chest cavity
Delrin Constrictor	U of MN	Custom made	Creates stenosis of LAD
Oxygen Tank E cylinder	various	various	Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter
Pressure Transducer	various	Must adapt to anesthesia monitor	Monitor direct arterial pressures
Xylazine 100 mg/mL	Vedco	468RX	Pre operative Sedative/ analgesic