标准化生物力学条件下小鼠软骨骨折愈合的微创模型分析

摘要

本协议描述了一种微创内固定技术, 采用髓内螺钉规范化稳定股骨骨折, 可用于分析软骨骨愈合的小鼠。

摘要

骨愈合模型是必要的分析骨折愈合的复杂机制, 以改善临床骨折治疗。在过去的十年中, 在骨科研究中增加了老鼠模型的使用, 这很可能是因为老鼠模型提供了大量的基因改良菌株和特殊的抗体来分析骨折愈合的分子机制。为了控制生物力学条件, 具有良好特征的内固定技术是强制性的, 也在小鼠。在这里, 我们报告的设计和使用闭合骨愈合模型, 以稳定股骨骨折的小鼠。采用医用不锈钢制成的髓内螺钉, 通过与主要使用的简单髓内针相比, 可提供轴向和旋转稳定性, 这表明完全缺乏轴向和旋转稳定性。用髓内螺钉实现的稳定性可以分析软骨愈合。大量的愈伤组织, 在与螺钉稳定后接受, 提供了理想的条件, 以收获组织的生物化学和分子分析。螺钉使用的另一个好处是, 螺钉可以用微创技术插入股骨, 而不会引起软组织损伤。总之, 螺钉是一种独特的植入物, 最好能用于闭合性骨折愈合模型, 提供标准化的生物力学条件。

引言

由于广泛的抗体和基因改良的动物, 小鼠的骨愈合研究是非常需要的。这些事实允许研究骨骼愈合的分子机制¹。在过去的几年中, 不同的骨骼愈合模型的小鼠已经开发了²。这些模型可以分为开放模型, 其中骨骼是 osteotomized 使用开放的外侧手术方法和封闭模型, 其中骨是骨折的基础上, 由 Bonnares 和埃霍恩介绍的断裂模型³。使用这种技术, 一个标准化的横向骨折可以由一个3点弯曲装置和髓内植入物可以插入通过一个小的内侧 parapatellar 切口的微创技术, 以避免重大软组织创伤。

髓内螺钉可用于小鼠闭合性骨折的稳定。螺杆提供旋转和轴向稳定性。这是通过断开压缩通过近端线程和远端头⁴实现的。螺钉的进一步优点是手术技术简单, invasivity 低, 种植体重量低, 最显著的是, 与其他髓内固定相比, 提供标准化和可控制的生物力学条件的稳定性更高。植入⁵。事实上, 在最闭合的断裂模型中, 碎片只通过简单的针脚稳定, 这与完全缺乏旋转和轴向稳定性以及高的针脚风险和断裂脱位有关。这会明显影响愈合过程, 这可能导致延迟愈合或非联合形成。

众所周知, 骨折固定的稳定性对愈合过程有巨大影响^6,7。高刚性固定的结果膜内愈合, 而不刚性固定, 这可能允许 micromovements 在骨折间隙, 导致软骨愈合。骨折与髓内螺钉的稳定主要表现为软骨愈合与大量的愈伤组织, 特别是经过2周的骨折愈合。收获大量愈伤组织的可能性可以通过不同的技术分析多种参数。

本文报道了小鼠髓内螺钉的设计和应用, 以及在正常软骨骨愈合实验研究中的优缺点。

研究方案

所有的程序都是根据国家卫生研究院关于使用实验动物的指导方针进行的, 并遵循机构指南 (Landesamt Verbraucherschutz、Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst、萨尔布吕肯、德国)。

1. 外科器械和植入物的制备

1. 选择手术刀刀片 (大小 15), 小拭子, 细钳, 27 克针, 非可吸收5-0 缝合, 剪刀和针持有人从显微外科仪器盒。
2. 解锁髓内螺钉、导丝 (直径 0.3/0.2 毫米、10厘米长)、定心钻头 (0.5 毫米直径) 和手钻 (图 1; 请参阅材料表)。
   注: 髓内螺钉 (0.5 毫米直径, 17.2 毫米长度) 是由医疗级不锈钢制成, 用于逆行植入股骨。该螺钉有一个近端螺纹 (直径0.5 毫米, 4 毫米长度) 与鼻子 (0.2 毫米直径, 0.4 毫米长度) 在尖端和远端锥形头 (0.8 毫米直径, 0.9 毫米长度), 以实现骨折压缩以及轴向和旋转稳定性。
3. 将植入物和所有手术器械暴露在消毒液中 (96% 酒精) 5 分钟或消毒 (蒸汽灭菌, 130 摄氏度, 25 分钟)。消毒或灭菌后, 将仪器放置在操作布上。将操作布直接放置在小动物操作桌旁。

2. 动物、麻醉和镇痛

1. 根据所讨论的研究问题, 选择小鼠的应变、年龄和性别。
   注: 本研究使用 12-至14周的雄性 CD-1 小鼠。适当的体重使用髓内螺钉是在25-35 克之间。
2. 麻醉小鼠腹腔注射15毫克/千克甲苯噻嗪和75毫克/千克氯胺酮。通过脚趾夹来确认麻醉。使用眼部润滑剂, 以保护动物的眼睛在麻醉期间的干燥。麻醉后, 将鼠标置于散热器下, 保持体温恒定。在手术过程中, 动物受到反复脚趾捏的监测, 以确保适当的麻醉面。
3. 应用盐酸曲马多在饮用水 (1.0 毫克/毫升) 镇痛从1天之前的手术, 直到3天手术后。
   注: 镇痛和感染预防应符合国家和机构在进行实验的相关指导方针。

3. 外科手术和髓内螺钉植入术

1. 手术前, 剃掉整条右后腿, 涂上脱毛膏。5分钟后, 取出奶油, 用清水清洁腿部。然后, 使用96% 酒精消毒液。Betadine 或洗必泰可以添加到酒精, 以确保完全无菌。
2. 在无菌条件下, 将鼠标放在小动物操作台上的仰卧位上。弯曲右膝, 允许前路髁膝。使用手术刀刀片在右膝上执行5毫米内侧 parapatellar 切口。
3. 用手术刀刀片和拭子仔细地调动髌骨韧带。然后, 用细钳将髌骨侧面移位, 以暴露股骨髁间凹槽。
4. 在两个髁之间, 在股骨中部完全打开髁间凹槽。请确保钻孔的深度不要超过1.0 毫米。
   1. 使用 0.5 mm 定心钻头和手钻 (图 1C和D,图 2), 以慢速和45°偏移腹部到股骨轴进行手动钻孔。在钻探过程中, 持续减少角度到0°偏移 (平行与骨轴的股骨)。当达到1.0 毫米深度时, 停止钻孔。
5. 在髁间凹槽处打开骨后, 将27克针插入髓内腔, 使其在股骨的全长。通过27克针的旋转运动, 手动将股骨髓内腔固定。向前推针, 以穿孔的皮质骨在大转子下部。
6. 取出27克针, 并将导丝通过股骨远端。
   1. 用手术刀刀片 (尺寸 15) 在导丝上进行皮肤切口, 并将导丝向前推, 直到导丝两端都在外面。请务必把导丝放到位。
7. 使用断头台创建定义闭合的断裂。
   1. 将鼠标放在断头台下的右腿位置。确保股骨的骨干部分放在断头台的中间。
   2. 将重量 (200 克) 从所定义的25.5 厘米的距离中除去。
8. 使用 x 射线设备控制断开的配置和断开位置以及导丝 (图 3) 的位置 (请参阅材料表)。
9. 将髓内螺钉与远端的鼻部连接至0.2 毫米导丝, 并在连续压力下将其插入股骨, 并顺时针旋转。
   1. 当达到足够扭矩时, 驱动轴的剪切。
   2. 卸下导丝下部。
10. 用5-0 合成、单丝、美容整形聚丙烯缝合术, 将髌骨重新定位, 用一条缝合固定髌骨肌腱。使用相同的材料和大小的单一缝合闭合伤口。使用 x 射线设备控制碎片和螺钉位置放射学上的减少 (请参阅材料表)。
11. 把动物放在散热器下, 直到他们从麻醉中恢复。不要离开动物无人看管, 直到他们恢复足够的意识, 以保持腹卧床。把动物送到动物设施的单人笼子里。在头24小时内, 不要将动物送回其他动物的公司, 即使他们已经完全从麻醉中恢复过来。
12. 每天仔细监视动物。在头三天内用1.0 毫克/毫升的饮用水维持术后镇痛。继续镇痛如果, 在手术后的4天, 动物仍然显示疼痛的证据, 如发声, 躁动, 缺乏机动性, 没有新郎, 异常的姿势, 和缺乏正常的环境兴趣。当动物无痛时, 终止镇痛。
13. 实验结束时, 弄死的巴比妥过量。

结果

从皮肤切口到伤口闭合的手术时间为20分钟。手术可以在没有立体显微镜的情况下进行。术后每天对动物进行监测。术后镇痛在2天后终止, 因为没有动物在这个时间段后显示疼痛的证据。在手术后2天内, 动物也显示正常的负重。在整个观察期内未观察到伤口感染。

2周后的放射性分析表明, 愈伤组织的形成, 弥合骨折间隙 (

讨论

手术步骤的关键步骤是找到正确的入口点的螺钉植入在股骨中部髁在髁间凹槽, 以及最佳方向平行的针骨轴为扩孔髓内腔。为了避免输入位置不正确, 外科医生应该准备好切口, 直到达到最佳的视野。为了控制扩孔过程中的定位, 应将小鼠的股骨固定在手指的稳定位置。另一个关键步骤是将螺钉插入到股骨上方的导丝上, 因为导丝可以从近端骨碎片中滑出, 导致骨折脱位。在这种情况下, 外科医生可?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Screw	RISystem AG	221,100
Guide wire	RISystem AG	521,100
Centering bit	RISystem AG	590,205
Hand drill	RISystem AG	390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head)	Fink Walter GmbH	8822428
Suture (5-0 Prolene)	Ethicon	8614H
Forceps	Braun Aesculap AG &CoKG	BD520R
Scissors	Braun Aesculap AG &CoKG	BC100R
Needle holder	Braun Aesculap AG &CoKG	BM024R
27 G needle	Braun Melsungen AG	9186182
Scalpel blade size 15	Braun Aesculap AG &CoKG	16600525
Heat radiator	Sanitas	605.25
Depilatory cream	Asid bonz GmbH	NDXZ10
Eye lubricant	Bayer Vital GmbH	2182442
Xylazine	Bayer Vital GmbH	1320422
Ketamine	Serumwerke Bernburg	7005294
Tramadol	Grünenthal GmbH	2256241
Disinfection solution (SoftaseptN)	Braun Melsungen AG	8505018
CD-1 mice	Charles River	22
X-ray Device	Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation	2321A0988
Fracture device small	RISystem AG	891,100