Eine Minimal-Invasive Modell Endochondral Frakturheilung bei Mäusen unter standardisierten Bedingungen biomechanische Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine minimal-invasive Osteosynthese-Technik mit einem intramedullären Schraube für standardisierte Stabilisierung des Femur-Frakturen, die zum Analysieren der Endochondral Knochenheilung bei Mäusen.

Zusammenfassung

Heilende Knochenmodelle sind notwendig, um die komplexen Mechanismen der Frakturheilung zur Verbesserung der klinischen Frakturbehandlung analysieren. Während des letzten Jahrzehnts wurde ein vermehrter Einsatz von Mausmodellen in der orthopädischen Forschung festgestellt, wahrscheinlich weil Maus-Modelle eine große Anzahl von genetisch veränderten Stämmen und spezielle Antikörper für die Analyse der molekularen Mechanismen der Frakturheilung bieten. Um die biomechanischen Bedingungen zu steuern, sind gut charakterisierten Osteosynthese-Techniken obligatorisch, auch bei Mäusen. Hier berichten wir über die Gestaltung und Nutzung von einem geschlossenen Knochenheilung Modell Femur-Frakturen bei Mäusen zu stabilisieren. Die intramedulläre Schraube, medizinischem Edelstahl bietet durch Bruch Kompression eine axiale und rotatorische Stabilität im Vergleich zu der am meisten verwendete einfache intramedulläre Pins, die einen völligen Mangel an axial- und Rotations-Stabilität zeigen. Die Stabilität erreicht, indem die intramedulläre Schraube ermöglicht die Analyse der Endochondral Heilung. Eine große Menge von Kallus Gewebe, erhielt nach der Stabilisierung mit der Schraube, bietet ideale Bedingungen zum Gewebe für biochemische und molekulare Analysen zu ernten. Ein weiterer Vorteil der Verwendung der Schraube ist die Tatsache, dass die Schraube in das Femur mit einer minimal-invasiven Technik eingefügt werden kann, ohne Schäden an den Weichteilen. Zusammenfassend ist die Schraube ein einzigartiges Implantat, die ideal einsetzbar in geschlossenen Frakturheilung Modelle bieten standardisierte biomechanische Bedingungen.

Einleitung

Knochen Heilung Studien an Mäusen sind in der großen Nachfrage wegen ein breites Spektrum von Antikörpern und gentechnisch veränderte Tiere. Diese Tatsachen lassen um die molekularen Mechanismen der Knochenheilung¹zu studieren. In den letzten Jahren entwickelt verschiedene Knochenheilung Modelle für Mäuse wurden². Diese Modelle können in offene Modelle, in die Knochen osteotomized ist mit einem offenen seitlichen chirurgischen Ansatz und geschlossene Modelle, in denen der Knochen gebrochen ist, basierend auf dem Bruch-Modell von Bonnares und Einhorn³eingeführt unterteilt werden. Mit diesem Verfahren eine standardisierte Quere Fraktur kann durch ein 3-Punkt-Biegung-Gerät erzeugt werden und intramedulläre Implantate eingesetzt werden, durch einen kleinen medialen Parapatellar Schnitt in einer minimal-invasiven Technik einen großen weichen Gewebetrauma zu vermeiden.

Die intramedulläre Schraube kann für geschlossene Fraktur Stabilisierung bei Mäusen angewendet werden. Die Schnecke bietet Rotations- und axiale Stabilität. Dies wird durch die Kompression der Fraktur durch einen proximalen Thread und eine distale Kopf⁴erreicht. Weitere Vorteile der Schraube sind der einfache Operationstechnik, niedrige Grad der Invasivität, die niedrige Implantat-Gewicht und vor allem eine höhere Stabilität, die Bereitstellung von standardisierten und kontrollierter biomechanischer Bedingungen im Vergleich zu anderen intramedulläre ⁵-Implantate. In der Tat in den meisten geschlossenen Fraktur-Modellen, die Fragmente sind nur durch einfache Pins, die einen völligen Mangel an Rotations- und axiale Stabilität und ein hohes Risiko für Pin zugeordnet ist stabilisiert und auch Fraktur Dislokation. Dies kann deutlich den Heilungsprozess beeinflussen die verzögerte Heilung oder Pseudarthrose Bildung führen können.

Es ist bekannt, dass die Stabilität der Frakturfixation einen enormen Einfluss auf die heilenden Prozess^{6,7 hat}. Eine hohe starre Fixierung führen intramembranous Heilung, während eine weniger starre Fixierung, die Micromovements in den Frakturspalt ermöglichen kann, im Endochondral Heilung ergeben. Stabilisierung der Fraktur mit der intramedullären Schraube zeigt überwiegend eine Endochondral Heilung mit einer großen Menge von Kallus Gewebe, besonders nach 2 Wochen der Frakturheilung. Die Möglichkeit, eine große Menge von Kallus Gewebe zu ernten ermöglicht die Analyse von mehreren Parametern durch verschiedene Techniken.

Hier berichten wir über die Gestaltung und Anwendung der intramedullären Schraube bei Mäusen, sowie auf ihre vor- und Nachteile in experimentellen Studien über normale Endochondral Knochenheilung.

Protokoll

Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien der National Institutes of Health für den Einsatz von Versuchstieren durchgeführt und institutionellen Leitlinien (Forschungsdefizite Für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, gefolgt (Deutschland).

1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten und Implantaten

1. Wählen Sie eine Skalpellklinge (Größe 15), einen kleinen Tupfer, feine Pinzette, 27 G Nadel, ein 5: 0-nicht resorbierbare Naht, Schere und einen Nadelhalter aus der mikrochirurgischen Instrument.
2. Entpacken Sie die intramedulläre Schraube, den Führungsdraht (0,3/0,2 mm Durchmesser, 10 cm Länge), Zentrier-Bohrer (0,5 mm Durchmesser) und die Handbohrmaschine (Abbildung 1; siehe Tabelle of Materials).
   Hinweis: Die intramedulläre Schraube (0,5 mm Durchmesser, Länge 17,2 mm) besteht aus medizinischem Edelstahl für retrograde Implantation in den Oberschenkelknochen. Die Schraube hat einen proximalen Thread (0,5 mm Durchmesser, 4 mm Länge) mit einer Nase (0,2 mm Durchmesser, 0,4 mm Länge) an der Spitze und distalen kegelförmigen Kopf (0,8 mm Durchmesser, Länge 0,9 mm), Fraktur Kompression sowie axial- und Rotations-Stabilität zu erreichen.
3. Setzen Sie der Implantate und alle chirurgischen Instrumente für eine desinfizierende Lösung (96 % igem Alkohol) für 5 min oder Sterilisieren Sie (Dampfsterilisation, 130 ° C, 25 min). Legen Sie nach Desinfektion oder Sterilisation die Instrumente auf einem Betrieb Tuch. Positionieren Sie das Betrieb Tuch direkt neben dem kleinen Tier OP-Tisch.

(2) Tiere, Anästhesie und Analgesie

1. Wählen Sie die Belastung, Alter und Geschlecht der Mäuse nach der Studie-Frage, die angesprochen wird.
   Hinweis: Für diese Studie wurden 12 bis 14 Wochen alten männliche CD-1 Mäusen verwendet. Das entsprechende Körpergewicht die intramedulläre Schraube zu verwenden ist zwischen 25-35 g.
2. Die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 15 mg/kg Xylazin und 75 mg/kg Ketamin zu betäuben. Bestätigen Sie die Anesthetization von Zehe Prise. Wenden Sie Auge Schmiermittel zum Schutz der Tiere Augen vor dem Austrocknen während der Narkose. Platzieren Sie nach Induktion der Anästhesie den Mauszeiger unter einem Heizkörper Wärme um die Körpertemperatur konstant zu halten. Während des Verfahrens wurden Tiere mit wiederholten Zehe Prise Sicherstellung eine geeignete Ebene der Narkose überwacht.
3. Beantragen Sie Tramadol-Hydrochlorid in das Trinkwasser (1,0 mg/mL) Analgesie ab 1 Tag vor der Operation bis zum 3. Tag nach der Operation.
   Hinweis: Analgesie und Infektion Prävention sollte in Absprache mit den jeweiligen Richtlinien des Landes und der Institution wo sind die Experimente durchgeführt werden.

(3) chirurgischen Eingriff und intramedulläre Schraube Implantation

1. Rasieren Sie vor der Operation das gesamte rechts Hinterbein und wenden Sie eine Enthaarungscreme an. Entfernen Sie nach 5 min die Creme und reinigen Sie das Bein mit Wasser zu. Wenden Sie dann eine Desinfektionslösung mit 96 % igem Alkohol. Betadine oder Chlorhexidin kann der Alkohol vollständig Asepsis sicherzustellen hinzugefügt werden.
2. Platzieren Sie unter aseptischen Bedingungen den Mauszeiger in die Rückenlage auf dem kleinen Tier OP-Tisch. Beugen Sie das rechte Knie an einem anterioren Zugang zu den Kondylen des Knies zu ermöglichen. Führen Sie einen 5 mm mediale Parapatellar Schnitt am rechten Knie mit dem Skalpell-Messer.
3. Das Patella Band vorsichtig mit dem Skalpell-Messer und den Tupfer zu mobilisieren. Dann, Verschieben der Kniescheibe seitlich mit den feinen Pinzette interkondylären Kerbe des Oberschenkelknochens aussetzen.
4. Öffnen Sie die interkondylären Kerbe genau in der Mitte des Femur zwischen beiden Kondylen. Achten Sie darauf, nicht 1,0 mm in der Tiefe für die Bohrung.
   1. Start manuelle Bohren mit einer langsamen Geschwindigkeit und einem 45° Offset ventral, der Femur-Achse mit dem 0,5 mm Zentrierung Bohrer und Handbohrer (Abbildung 1 und D, Abbildung 2). Während des Bohrens kontinuierlich sinken Sie den Winkel 0° Offset (parallel mit der Knochen-Achse des Femur). Bei eine Tiefe von 1,0 mm erreichen Bohren zu stoppen.
5. Nach dem Öffnen des Knochens an der interkondylären Kerbe, setzen Sie die 27 G Nadel in den intramedullären Hohlraum über die ganze Länge des Oberschenkelknochens. Ries die intramedulläre Hohlraum des Oberschenkelknochens manuell durch Drehbewegungen der 27 G Nadel. Schieben Sie die Nadel nach vorne um zu die Kortikalis auf den Trochanter Major proximal zu perforieren.
6. Entfernen Sie die 27 G Nadel und wenden Sie den Führungsdraht durch den distalen Teil des Oberschenkelknochens.
   1. Machen Sie einen Hautschnitt mit einem Skalpellklinge (Größe 15) proximal über den Führungsdraht und schieben Sie den Führungsdraht nach vorne, bis beide Enden des Führungsdrahtes außerhalb sind. Achten Sie darauf, den Führungsdraht in Position zu halten.
7. Erstellen einer definierten geschlossene Fraktur mit der Guillotine.
   1. Platzieren Sie den Mauszeiger in Seitenlage mit dem rechten Bein unter die Guillotine. Stellen Sie sicher, dass die Diaphysen Teil des Oberschenkelknochens in der Mitte der Guillotine platziert wird.
   2. Ziehen Sie das Gewicht (200 g) aus den definierten Abstand von 25,5 cm.
8. Die Konfiguration der Fraktur und Fraktur Position sowie die Position des Führungsdrahtes (Abbildung 3) mit dem Röntgengerät zu kontrollieren (siehe Tabelle der Materialien).
9. Schließen Sie die intramedulläre Schraube mit der Nase am distalen Ende um 0,2 mm Führungsdraht und stecken Sie ihn in das Femur unter ständigem Druck und Drehung im Uhrzeigersinn.
   1. Scher der Antriebswelle wenn genügend Drehmoment erreicht wird.
   2. Entfernen Sie den Führungsdraht proximal.
10. Positionieren Sie die Patella und befestigen Sie Patellasehne zu den Muskeln mit einer einzigen Naht mit einem 5: 0 Synthetik, Monofile, nonabsorbable Polypropylen Naht. Verwenden Sie einzelne Fäden aus dem selben Material und Größe, um die Wunde zu schließen. Die Reduzierung der Fragmente und der Schneckenposition radiologisch mit dem Röntgengerät zu kontrollieren (siehe Tabelle der Materialien).
11. Halten Sie die Tiere unter der Hitze-Heizkörper, bis sie aus der Narkose zu erholen. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Tiere bis sie ausreichend aufwachte haben um ventrale liegen zu erhalten. Die Tiere in einzelne Käfige in der Tierstation zurück. Nicht zurück die Tiere an die Gesellschaft anderer Tiere während der ersten 24 h, auch wenn sie aus der Narkose vollständig erholt haben.
12. Verfolgen Sie die Tiere sorgfältig jeden Tag. Postoperative Analgesie mit Tramadol-Hydrochlorid in das Trinkwasser mit einer Dosierung von 1,0 mg/mL in den ersten drei Tagen zu erhalten. Weiter Analgesie, wenn am 4. Tag nach der Operation, die Tiere immer noch Schmerzen, Beweis durch Vokalisierung, Unruhe, mangelnde Mobilität, scheitern zu pflegen, abnorme Körperhaltung und Mangel an normale Zinsen in einer Umgebung. Analgesie zu kündigen, wenn die Tiere sind schmerzfrei.
13. Am Ende des Experiments einschläfern des Tieres durch eine Überdosierung von Barbituraten.

Ergebnisse

Die Betriebszeit von Hautschnitt Verschluss aufgezogen war 20 min. Die Operation kann ohne ein Stereo-Mikroskop durchgeführt werden. Postoperativ wurden die Tiere täglich überwacht. Postoperative Analgesie wurde nach 2 Tagen abgebrochen, da keines der Tiere Beweis der Schmerz nach dieser Zeit zeigte. Die Tiere zeigten auch normale Belastung innerhalb von 2 Tagen nach der Operation. Wundinfektionen wurden nicht während des gesamten Beobachtungszeitraums beobachtet.

Diskussion

Wichtige Schritte des chirurgischen Eingriffs, den richtige Einstiegspunkt für die Implantation der Schraube in der Mitte des Femur Kondylen an der interkondylären Kerbe sowie die optimale Ausrichtung der Nadel parallel zur Achse für das Reiben von Knochen zu finden sind die intramedulläre Hohlraum. Um eine falsche Eingabe-Position zu vermeiden, sollte der Chirurg die Kerbe vorbereiten, bis eine optimale Sicht erreicht ist. Um die Orientierung beim reiben zu kontrollieren, sollte das Femur der Mäuse mit den Fingern ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Screw	RISystem AG	221,100
Guide wire	RISystem AG	521,100
Centering bit	RISystem AG	590,205
Hand drill	RISystem AG	390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head)	Fink Walter GmbH	8822428
Suture (5-0 Prolene)	Ethicon	8614H
Forceps	Braun Aesculap AG &CoKG	BD520R
Scissors	Braun Aesculap AG &CoKG	BC100R
Needle holder	Braun Aesculap AG &CoKG	BM024R
27 G needle	Braun Melsungen AG	9186182
Scalpel blade size 15	Braun Aesculap AG &CoKG	16600525
Heat radiator	Sanitas	605.25
Depilatory cream	Asid bonz GmbH	NDXZ10
Eye lubricant	Bayer Vital GmbH	2182442
Xylazine	Bayer Vital GmbH	1320422
Ketamine	Serumwerke Bernburg	7005294
Tramadol	Grünenthal GmbH	2256241
Disinfection solution (SoftaseptN)	Braun Melsungen AG	8505018
CD-1 mice	Charles River	22
X-ray Device	Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation	2321A0988
Fracture device small	RISystem AG	891,100