Un modello come minimo dilagante per analizzare Endochondral frattura la guarigione nei topi in condizioni standardizzate di biomeccaniche

Riepilogo

Questo protocollo descrive una tecnica di osteosintesi mininvasiva utilizzando una vite intramidollare per standardizzato stabilizzazione delle fratture di femore, che può essere usato per analizzare endocondrale ossa guarigione nei topi.

Abstract

Modelli di guarigione ossea sono necessari per analizzare i complessi meccanismi di frattura che guarisce per migliorare il trattamento delle fratture cliniche. Durante l'ultimo decennio, è stato notato un maggiore utilizzo di modelli murini in ricerca ortopedica, molto probabilmente perché i modelli murini offrono un gran numero di ceppi geneticamente modificati e particolari anticorpi per l'analisi dei meccanismi molecolari della guarigione della frattura. Per controllare le condizioni biomeccaniche, tecniche di osteosintesi ben caratterizzati sono obbligatorie, anche nei topi. Qui, segnaliamo sulla progettazione e l'uso di un osso chiuso modello curativo per stabilizzare le fratture di femore nei topi. La vite intramidollare, in acciaio inox medicale, fornisce attraverso compressione frattura una stabilità assiale e rotazionale rispetto ai perni intramidollari semplice usato principalmente, che mostrano una completa mancanza di stabilità assiale e rotazionale. La stabilità raggiunta dalla vite intramidollare permette l'analisi di endochondral guarigione. Una grande quantità di tessuto di callo, ricevuto dopo stabilizzazione con la vite, offre le condizioni ideali per la raccolta del tessuto per le analisi biochimiche e molecolari. Un ulteriore vantaggio dell'uso della vite è il fatto che la vite può essere inserita nel femore con tecnica mininvasiva senza indurre danni al tessuto molle. In conclusione, la vite è un unico impianto che può essere utilizzato idealmente in frattura chiusa guarigione modelli che offrono condizioni biomeccaniche standardizzate.

Introduzione

Guarigione ossea condotti in topi sono molto richiesti a causa di un ampio spettro di anticorpi e animali geneticamente modificati. Questi fatti permettono di studiare i meccanismi molecolari di¹di guarigione ossea. Negli ultimi anni, diversa ossa guarigione modelli per topi sono stati sviluppati². Questi modelli possono essere diviso in modelli aperti, in cui l'osso è osteotomized utilizzando un approccio chirurgico laterale aperto e in modelli chiusi, in cui l'osso è fratturato sulla base del modello di frattura introdotto da Bonnares ed Einhorn³. Utilizzando questa tecnica, una frattura trasversale standardizzata può essere prodotta da un dispositivo di piegatura di 3 punti e intramidollare impianti possono essere inseriti attraverso un'incisione pararotulea mediale piccolo in una tecnica mini-invasiva evitando un trauma dei tessuti molli principali.

La vite intramidollare può essere applicata per la stabilizzazione della frattura chiusa in topi. La vite offre stabilità rotazionale e assiale. Ciò si ottiene mediante compressione frattura attraverso un filo di prossimale e distale testa⁴. Ulteriori vantaggi della vite sono la semplice tecnica chirurgica, impiantare il basso grado di invasività, il basso peso e, soprattutto, una maggiore stabilità fornendo condizioni biomeccaniche standardizzate e controllate rispetto ad altri intramidollare gli impianti⁵. Infatti, nei modelli più chiusi di frattura, i frammenti sono stabilizzati solo da semplice PIN, che è associato con una completa mancanza di stabilità rotazionale e assiale e un elevato rischio di perno e anche frattura lussazione. Questo può influenzare notevolmente il processo di guarigione, che può provocare la guarigione ritardata o mancata unione formazione.

È noto che la stabilità della fissazione di frattura ha un enorme impatto sulla guarigione processo^6,7. Una fissazione rigida alta risultati nella guarigione intramembranous, mentre una fissazione meno rigida, che potrebbe consentire micromovimenti del divario di frattura, con la conseguente guarigione endochondral. Stabilizzazione della frattura con la vite intramidollare Mostra principalmente un endochondral guarigione con una grande quantità di tessuto di callo, particolarmente dopo 2 settimane di guarigione di frattura. La possibilità di raccogliere una grande quantità di tessuto callo permette l'analisi di più parametri con tecniche diverse.

Qui, segnaliamo sulla progettazione e applicazione della vite intramidollare nei topi, così come sui suoi vantaggi e svantaggi in studi sperimentali su endochondral normale guarigione ossea.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite secondo le direttive del National Institutes of Health per l'uso di animali da esperimento e seguivano le linee guida istituzionali (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Germania).

1. preparazione di strumenti chirurgici e protesi

1. Selezionare una lama per bisturi (taglia 15), un piccolo tampone, una pinzetta, un ago da 27 G, una sutura non riassorbibile 5-0, forbici e un porta-aghi nella finestra strumento microsurgical.
2. Disimballare la vite intramidollare, il filo guida (0,3/0,2 mm di diametro, 10 cm di lunghezza), la punta di centraggio (0,5 mm di diametro) e il trapano a mano (Figura 1; Vedi Tabella materiali).
   Nota: La vite intramidollare (0,5 mm di diametro, 17,2 mm di lunghezza) è fatta in acciaio inox medicale per impianto retrogrado nel femore. La vite ha una filettatura prossimale (diametro 0,5 mm, 4 mm di lunghezza) con un naso (0,2 mm di diametro, lunghezza 0,4 mm) in punta e distale testa a forma di cono (diametro 0,8 mm, 0,9 mm di lunghezza) per raggiungere la frattura di compressione, nonché stabilità assiale e rotazionale.
3. Esporre gli impianti e tutti gli strumenti chirurgici per una soluzione disinfettante (96% di alcool) per 5 min o sterilizzarli (sterilizzazione a vapore, 130 ° C, 25 min). Dopo la disinfezione o la sterilizzazione, mettere gli strumenti su un panno di operazione. Posizionare il panno di funzionamento direttamente adiacente alla tabella piccola operazione animale.

2. gli animali, l'anestesia e Analgesia

1. Scegliere il ceppo, età e sesso dei topi secondo la domanda di studio che si rivolge.
   Nota: Per questo studio sono stati utilizzati topi CD-1 maschi di 12 a 14-week-old. Il peso del corpo appropriato utilizzare la vite di intramidollare è tra 25-35 g.
2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 15 mg/kg xylazina e 75 mg/kg ketamina. Confermare l'amputate pizzico di punta. Applicare il lubrificante di occhio per proteggere gli occhi degli animali da essiccazione durante l'anestesia. Dopo induzione dell'anestesia, posizionare il mouse sotto un radiatore di calore per mantenere costante la temperatura corporea. Durante la procedura, gli animali sono stati controllati con pizzico di ripetute punta a garantire un adeguato piano di anestesia.
3. Applicare tramadol-cloridrato nell'acqua potabile (1,0 mg/mL) per analgesia dal 1 ° giorno prima dell'intervento chirurgico fino al 3 ° giorno dopo l'intervento chirurgico.
   Nota: Analgesia e infezione prevenzione dovrebbe essere d'accordo con le rispettive linee guida del paese e istituzione dove gli esperimenti devono essere eseguiti.

3. intervento chirurgico e l'impianto a vite intramidollare

1. Prima dell'intervento chirurgico, radere tutta la gamba destra posteriore e applicare una crema depilatoria. Dopo 5 minuti, rimuovere la crema e pulire l'arto con acqua. Quindi, applicare una soluzione disinfettante con alcool al 96%. Clorexidina o Betadine può aggiungersi all'alcool per garantire completa asepsi.
2. In condizioni asettiche, posizionare il mouse nella posizione supina sul tavolo piccola operazione animale. Piegare il ginocchio destro per consentire un approccio anteriore per i condili del ginocchio. Eseguire un'incisione di 5 mm pararotulea mediale al ginocchio destro utilizzando la lama del bisturi.
3. Mobilitare il legamento patellar attentamente con il bisturi e il tampone. Quindi, spostare lateralmente la rotula con una pinzetta per esporre intercondiloidea del femore.
4. Aprire la tacca intercondylar esattamente nel mezzo del femore tra entrambi i condili. Assicurarsi che non deve superare 1,0 mm di profondità per il foro di trapano.
   1. Avvio manuale di perforazione ad una velocità lenta e un offset 45 ° ventralmente all'asse del femore con 0,5 mm di centraggio trapano e il trapano a mano (Figura 1 e D, Figura 2). Durante la perforazione, continuamente diminuire l'angolo di offset di 0 ° (parallelo all'asse dell'osso del femore). Interrompere quando viene raggiunta una profondità di 1,0 mm di perforazione.
5. Dopo l'apertura dell'osso alla tacca intercondylar, inserire l'ago 27 G nella cavità intramidollare su tutta la lunghezza del femore. Scremare la cavità intramidollare del femore manualmente attraverso movimenti rotativi dell'ago 27 G. Spingere l'ago avanti per perforare l'osso corticale alle grande trocantere prossimalmente.
6. Rimuovere l'ago 27G e applicare il filo guida attraverso la parte distale del femore.
   1. Fare un'incisione della pelle con un bisturi (taglia 15) prossimalmente sopra il filo guida e spingere in avanti il filo guida fino a quando entrambe le estremità del filo guida sono fuori. Assicurarsi di mantenere il filo guida in posizione.
7. Creare una frattura chiusa definita utilizzando la ghigliottina.
   1. Posizionare il mouse in posizione laterale con la gamba destra sotto la ghigliottina. Assicurarsi che la parte della diafisi del femore è posto nel mezzo della ghigliottina.
   2. Eliminare il peso (200 g) dalla distanza definita di 25,5 cm.
8. Controllare la configurazione di frattura e frattura posizione così come la posizione del filo guida (Figura 3) utilizzando il dispositivo a raggi x (Vedi Tabella materiali).
9. Collegare la vite intramidollare con il naso all'estremità distale per il filo di guida di 0.2 mm e inserirla nel femore sotto pressione continua e la rotazione in senso orario.
   1. Taglio dell'albero motore quando viene raggiunta la coppia sufficiente.
   2. Rimuovere il filo guida prossimalmente.
10. Riposizionare la rotula e fissare il tendine della rotula ai muscoli con una sutura singola utilizzando un sintetico 5-0, monofilamento, nonabsorbable sutura in polipropilene. Utilizzare suture singole dello stesso materiale e dimensione per chiudere la ferita. Controllare la riduzione dei frammenti e la posizione della vite radiologicamente utilizzando il dispositivo a raggi x (Vedi Tabella materiali).
11. Tenere gli animali sotto il radiatore di calore fino a quando recuperano dall'anestesia. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito ventrale. Restituire gli animali nelle gabbie singole nella struttura degli animali. Non restituire gli animali per la compagnia di altri animali durante le prime 24 ore, anche se hanno pienamente recuperato dall'anestesia.
12. Monitorare gli animali con cura ogni giorno. Mantenere l'analgesia postoperatoria usando tramadol cloridrato in acqua potabile con un dosaggio di 1,0 mg/mL durante i primi tre giorni. Continuare l'analgesia se, il giorno 4 dopo la chirurgia, gli animali mostrano ancora prova del dolore, come indicato dalla vocalizzazione, irrequietezza, mancanza di mobilità, il mancato sposo, postura anormale e mancanza di normale interesse nei dintorni. Terminare l'analgesia quando gli animali sono senza dolore.
13. Alla fine dell'esperimento eutanasia animale da un'overdose di barbiturici.

Risultati

Il tempo di funzionamento da incisione cutanea alla chiusura della ferita era 20 min. La chirurgia può essere eseguita senza stereo-microscopio. Postoperatorio, gli animali sono stati controllati giornalmente. L'analgesia postoperatoria è stata terminata dopo 2 giorni perché nessuno degli animali ha mostrato la prova del dolore dopo questo periodo di tempo. Gli animali hanno mostrato anche normale peso-cuscinetto entro 2 giorni dopo la chirurgia. Le infezioni della ferita non sono stat...

Discussione

Fasi critiche della procedura chirurgica sono per trovare il punto di ingresso corretto per l'impianto di vite in mezzo i condili del femore a tacca intercondylar, nonché l'orientamento ottima dell'ago parallelo all'asse dell'osso per l'alesatura della cavità intramidollare. Per evitare una posizione di voce non corretta, il chirurgo dovrebbe preparare la tacca fino a quando si ottiene una vista ottimale. Per controllare l'orientamento durante la scrematura, femore dei topi deve essere tenuto con le dita in una posizio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Screw	RISystem AG	221,100
Guide wire	RISystem AG	521,100
Centering bit	RISystem AG	590,205
Hand drill	RISystem AG	390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head)	Fink Walter GmbH	8822428
Suture (5-0 Prolene)	Ethicon	8614H
Forceps	Braun Aesculap AG &CoKG	BD520R
Scissors	Braun Aesculap AG &CoKG	BC100R
Needle holder	Braun Aesculap AG &CoKG	BM024R
27 G needle	Braun Melsungen AG	9186182
Scalpel blade size 15	Braun Aesculap AG &CoKG	16600525
Heat radiator	Sanitas	605.25
Depilatory cream	Asid bonz GmbH	NDXZ10
Eye lubricant	Bayer Vital GmbH	2182442
Xylazine	Bayer Vital GmbH	1320422
Ketamine	Serumwerke Bernburg	7005294
Tramadol	Grünenthal GmbH	2256241
Disinfection solution (SoftaseptN)	Braun Melsungen AG	8505018
CD-1 mice	Charles River	22
X-ray Device	Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation	2321A0988
Fracture device small	RISystem AG	891,100