Un modelo mínimamente invasivo para analizar la fractura endocondral en ratones en condiciones biomecánicas estandarizadas

Resumen

Este protocolo describe una técnica de osteosíntesis mínimamente invasiva utilizando un tornillo intramedular para estandardizado estabilización de fracturas de fémur, que puede utilizarse para analizar el hueso endocondral en ratones.

Resumen

Modelos de curación ósea son necesarios para analizar los complejos mecanismos de fractura cura para mejorar el tratamiento clínico de la fractura. Durante la última década, un mayor uso de modelos murinos en investigación ortopédica observó, probablemente porque los modelos de ratón ofrecen un gran número de cepas genéticamente y anticuerpos especiales para el análisis de los mecanismos moleculares de la curación de la fractura. Para controlar las condiciones biomecánicas, técnicas de osteosíntesis bien caracterizados son obligatorias, también en ratones. Aquí, Divulgamos sobre el diseño y uso de un hueso cerrado modelo de curación para estabilizar las fracturas de fémur en ratones. El tornillo intramedular, de acero inoxidable de grado médico, ofrece a través de la compresión de la fractura una estabilidad axial y rotacional en comparación a los pines intramedulares simple usa principalmente, que demuestran una total falta de estabilidad axial y rotacional. La estabilidad alcanzada por el tornillo intramedular permite el análisis de la curación endocondral. Una gran cantidad de tejido de callo, recibido después de la estabilización con el tornillo ofrece las condiciones ideales para la cosecha de tejido para análisis bioquímicos y moleculares. Otra ventaja del uso del tornillo es el hecho de que el tornillo puede insertarse en el fémur con una técnica mínimamente invasiva, sin provocar daño a los tejidos blandos. En conclusión, el tornillo es un implante único que idealmente puede ser utilizado en fractura cerrada cura modelos ofreciendo condiciones biomecánicas estandarizadas.

Introducción

Hueso curativos estudios en ratones están en gran demanda debido a un amplio espectro de anticuerpos y animales modificados genéticamente. Estos hechos permiten para estudiar los mecanismos moleculares del hueso curativo¹. En los últimos años, diferentes hueso curativo modelos para ratones se han desarrollado². Estos modelos pueden dividirse en modelos abiertos, en que el hueso es osteotomized usando un acercamiento quirúrgico lateral abierto y en modelos cerrados, en el que se fractura el hueso basados en el modelo de fractura introducido por Bonnares y Einhorn³. Usando esta técnica, una fractura transversal estandarizada puede ser producida por un dispositivo de flexión de 3 puntos e implantes intramedulares pueden insertarse a través de una incisión parapatelar medial pequeño en una técnica mínimamente invasiva, evitando un trauma de tejidos blandos importantes.

El tornillo intramedular puede aplicarse para la estabilización de la fractura cerrada en ratones. El tornillo ofrece estabilidad rotacional y axial. Esto se logra por la compresión de la fractura a través de un hilo proximal y una distal de la cabeza⁴. Otras ventajas de los tornillos son la simple técnica quirúrgica, implante del bajo grado de invasivity, el bajo peso y, en particular, una mayor estabilidad de condiciones biomecánicas estandarizados y controlados en comparación con otros intramedular implantes de⁵. De hecho, en los modelos más cerrados de la fractura, los fragmentos se estabilizan por pernos simples, que se asocia con una total falta de estabilidad rotacional y axial y un alto riesgo de pin y también la fractura luxación. Esto puede influir notablemente el proceso de curación, que puede resultar en cicatrización o la formación de la Unión no.

Es bien sabido que la estabilidad de la fijación de la fractura tiene un tremendo impacto en el proceso curativo^6,7. Una alta fijación rígida resulta en curación intramembranosa, mientras que una fijación menos rígida, que puede permitir micromovements en la brecha de la fractura, los resultados en la curación endocondral. Estabilización de la fractura con el tornillo intramedular muestra predominante un endocondral la curación con una gran cantidad de tejido de callo, particularmente después de 2 semanas de la curación de la fractura. La posibilidad de cosechar una gran cantidad de tejido de callo permite el análisis de múltiples parámetros mediante diferentes técnicas.

Aquí, Divulgamos sobre el diseño y la aplicación del tornillo intramedular en ratones, así como sus ventajas y desventajas en los estudios experimentales en curación de hueso endocondral normal.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron realizados según las directrices de institutos nacionales de salud para la utilización de animales de experimentación y siguieron directrices institucionales (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Alemania).

1. preparación de instrumental quirúrgico e implantes

1. Seleccione una hoja de bisturí (tamaño 15), una esponja pequeña, pinzas finas, una aguja de 27 G, una sutura no reabsorbible 5-0, tijeras y un sostenedor de la aguja en el cuadro de instrumentos microquirúrgicos.
2. Desembale el tornillo intramedular, el alambre de guía (0.3/0.2 mm de diámetro, 10 cm de longitud), la broca de centrado (0,5 mm de diámetro) y el taladro de mano (figura 1; véase Tabla de materiales).
   Nota: El tornillo intramedular (0,5 mm de diámetro, longitud de 17,2 mm) se hace del acero inoxidable de grado médico para su implantación retrógrada en el fémur. El tornillo tiene rosca proximal (0,5 mm de diámetro, 4 mm de longitud) con una nariz (0,2 mm de diámetro, 0,4 mm de longitud) en la punta y el distal en forma de cono cabeza (diámetro de 0,8 mm, 0,9 mm de longitud) para lograr la compresión de la fractura así como estabilidad axial y rotacional.
3. Exponer los implantes y los instrumentos quirúrgicos en una solución desinfectante (alcohol de 96%) durante 5 minutos o esterilización (esterilización por vapor, 130 ° C, 25 min.). Después de la desinfección o esterilización, colocar los instrumentos en un paño de operación. Coloque la tela de operación directamente adyacente a la tabla de operación de animales pequeños.

2. los animales, la anestesia y Analgesia

1. Elegir la cepa, edad y sexo de los ratones según la pregunta de estudio que se trata.
   Nota: Para este estudio se emplearon ratones CD-1 machos de 12 a 14 semanas de edad. El peso corporal adecuado para utilizar el tornillo intramedular es entre 25-35 g.
2. Anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de 15 mg/kg xilacina y 75 mg/kg de ketamina. Confirmar la anestesia por presión del dedo del pie. Aplique lubricante ocular para proteger los ojos de los animales de secado durante la anestesia. Después de la inducción de la anestesia, colocar el ratón en un radiador de calor para mantener la temperatura corporal constante. Durante el procedimiento, los animales fueron monitoreados con pizca de repetida del dedo del pie para garantizar un adecuado plano de anestesia.
3. Clorhidrato de tramadol en el agua potable (1.0 mg/mL) se aplican para la analgesia desde 1 día antes de la cirugía hasta 3 después de la cirugía.
   Nota: Prevención infección y Analgesia debe estar de acuerdo con las directrices respectivas del país y de la institución donde los experimentos deben realizarse.

3. intervención e implantación tornillo intramedular

1. Antes de la cirugía, afeitarse la pata trasera derecha toda y aplicar una crema depilatoria. Después de 5 min, retirar la crema y limpie la pierna con agua. Luego, aplicar una solución desinfectante con alcohol de 96%. Betadine o clorhexidina puede añadirse al alcohol para garantizar asepsia completa.
2. Bajo condiciones asépticas, coloque el ratón en la posición supina sobre la mesa de operación de animales pequeños. Doble la rodilla derecha para permitir un abordaje anterior de los cóndilos de la rodilla. Realizar una incisión de 5 mm parapatelar medial en la rodilla derecha con la hoja de bisturí.
3. Movilizar el ligamento patelar con cuidado con la hoja de bisturí y el hisopo. A continuación, cambie la rótula lateralmente con las pinzas finas para exponer la muesca intercondílea del fémur.
4. Abra la muesca intercondílea exactamente en el centro del fémur entre ambos cóndilos. Asegúrese de que no debe exceder de 1,0 mm de profundidad para la perforación.
   1. Inicio manual de perforación a una velocidad lenta y una compensación de 45 ° ventralmente al eje del fémur usando 0,5 mm centrado broca y el taladro de mano (figura 1C y D, figura 2). Durante la perforación, reducir continuamente el ángulo 0 ° de offset (paralela al eje del hueso del fémur). Pare cuando se alcanza una profundidad de 1,0 mm de perforación.
5. Después de abrir el hueso en la muesca intercondílea, inserte la aguja de 27 G en la cavidad intramedular sobre toda la longitud del fémur. Escarie la cavidad intramedular del fémur manualmente mediante movimientos rotatorios de la aguja de 27 G. Empuje la aguja hacia adelante para perforar el hueso cortical en el mayor trocánter proximal.
6. Retire la aguja de 27 G y aplicar la guía a través de la parte distal del fémur.
   1. Hacer una incisión en la piel con una hoja de bisturí (tamaño 15) proximal sobre el alambre guía y avanzar la guía hasta que ambos extremos de la guía están fuera. Asegúrese de que mantenga el alambre guía en su lugar.
7. Crear una fractura cerrada definida mediante la guillotina.
   1. Coloque el ratón en posición lateral con la pierna derecha debajo de la guillotina. Asegúrese de que la parte diafisaria del fémur se coloca en medio de la guillotina.
   2. Soltar el peso (200 g) de la distancia definida de 25,5 cm.
8. Controlar la configuración de la fractura y la posición de la fractura así como la posición del alambre guía (figura 3) utilizando el aparato de rayos x (véase Tabla de materiales).
9. Conecte el tornillo intramedular con la nariz en el extremo distal de la guía de 0,2 mm e inserte en el fémur bajo presión continua y rotación a la derecha.
   1. Corte del eje impulsor cuando se logra el suficiente esfuerzo de torsión.
   2. Retire el alambre guía proximal.
10. Vuelva a colocar la rótula y fijar el tendón de la rótula a los músculos con una sola sutura utilizando un sintético 5-0, monofilamento, sutura no absorbible de polipropileno. Utilizar suturas individuales del mismo material y tamaño para cerrar la herida. La reducción de los fragmentos y la posición del tornillo radiológico utilizando el aparato de rayos x de control (véase Tabla de materiales).
11. Mantener los animales bajo el radiador de calor hasta que se recuperen de la anestesia. No descuide los animales hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency ventral. Devolver los animales a las jaulas individuales en el Animalario. No devolver los animales a la compañía de otros animales durante las primeras 24 h, aunque han recuperado de la anestesia.
12. Controlar los animales con cuidado cada día. Mantener analgesia postoperatoria con tramadol clorhidrato en el agua potable con una dosis de 1.0 mg/mL durante los primeros tres días. Continuar la analgesia si, el día 4 después de la cirugía, los animales aún muestran evidencia de dolor, indicado por vocalización, inquietud, falta de movilidad, falta de novio, postura anormal y la falta de interés normal en un entorno. Terminar la analgesia cuando los animales están libres de dolor.
13. Al final del experimento eutanasia al animal por una sobredosis de barbitúricos.

Resultados

El tiempo de funcionamiento de la incisión cutánea al cierre de la herida era 20 minutos. La cirugía puede realizarse sin un microscopio estéreo. Postoperatoriamente, los animales fueron monitoreados diariamente. Analgesia postoperatoria fue terminada después de 2 días porque ninguno de los animales mostraron evidencia de dolor después de este período de tiempo. Los animales demostraron también carga normal dentro de 2 días después de la cirugía. Infecciones de la herida no se...

Discusión

Pasos críticos de la intervención quirúrgica son encontrar el punto de entrada correcto para la implantación de tornillo en el centro de los cóndilos del fémur en la muesca intercondílea, así como la óptima orientación de la aguja paralela al eje del hueso para el escariado de la cavidad intramedular. Para evitar una posición de entrada incorrecta, el cirujano debe preparar la muesca hasta que se logra una vista óptima. Para controlar la orientación durante el fresado, el fémur de los ratones se debe sosten...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Screw	RISystem AG	221,100
Guide wire	RISystem AG	521,100
Centering bit	RISystem AG	590,205
Hand drill	RISystem AG	390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head)	Fink Walter GmbH	8822428
Suture (5-0 Prolene)	Ethicon	8614H
Forceps	Braun Aesculap AG &CoKG	BD520R
Scissors	Braun Aesculap AG &CoKG	BC100R
Needle holder	Braun Aesculap AG &CoKG	BM024R
27 G needle	Braun Melsungen AG	9186182
Scalpel blade size 15	Braun Aesculap AG &CoKG	16600525
Heat radiator	Sanitas	605.25
Depilatory cream	Asid bonz GmbH	NDXZ10
Eye lubricant	Bayer Vital GmbH	2182442
Xylazine	Bayer Vital GmbH	1320422
Ketamine	Serumwerke Bernburg	7005294
Tramadol	Grünenthal GmbH	2256241
Disinfection solution (SoftaseptN)	Braun Melsungen AG	8505018
CD-1 mice	Charles River	22
X-ray Device	Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation	2321A0988
Fracture device small	RISystem AG	891,100