Un modèle mini-Invasive pour analyser Endochondral Fracture de guérison chez des souris dans des Conditions biomécaniques

Résumé

Ce protocole décrit une technique d’ostéosynthèse mini-invasive utilisant une vis intramédullaire pour stabilisation normalisée des fractures du fémur, qui peut être utilisé pour analyser des os endochondral guérison chez les souris.

Résumé

Modèles de guérison osseuse sont nécessaires pour analyser les mécanismes complexes de guérison pour améliorer le traitement des fractures cliniques de fracture. Au cours de la dernière décennie, une utilisation accrue des modèles de souris dans la recherche orthopédique a été notée, très probablement parce que les modèles murins offrent un grand nombre de souches génétiquement modifiés et des anticorps spéciales pour l’analyse des mécanismes moléculaires de la guérison des fractures. Pour contrôler les conditions biomécaniques, techniques d’ostéosynthèse bien caractérisés sont obligatoires, aussi chez les souris. Nous rapportons ici, sur la conception et l’utilisation d’un OS fermé modèle de guérison pour stabiliser les fractures du fémur chez la souris. La vis intramédullaire, en acier inoxydable de qualité médicale, fournit par le biais de compression fracture une stabilité axiale et de rotation par rapport aux broches intramédullaire simple utilisé pour la plupart, qui montrent un manque de stabilité axiale et de rotation. La stabilité obtenue par la vis intramédullaire permet l’analyse des os endochondral guérison. Une grande quantité de cals, reçu après une stabilisation avec une vis, offre des conditions idéales à la récolte de tissus pour des analyses biochimiques et moléculaires. Un autre avantage de l’utilisation de la vis est le fait que la vis peut être insérée dans le fémur avec une technique mini-invasive sans provoquer de dommages aux tissus mous. En conclusion, la vis est un implant unique qui peut idéalement servir dans fracture fermée modèles offrant des conditions biomécaniques normalisées de guérison.

Introduction

Études de guérison osseuse chez la souris sont en grande demande en raison d’un large spectre des anticorps et des animaux génétiquement modifiés. Ces faits permettent d’étudier les mécanismes moléculaires de l’OS guérison¹. En quelques années, des os différents modèles de guérison pour les souris ont été mis au point². Ces modèles peuvent être divisés en modèles ouverts, dans lequel l’os sont osteotomized à l’aide d’une approche chirurgicale latérale ouverte et dans des modèles fermés, où l’os sont rompue basés sur le modèle de la rupture introduit par Bonnares et Einhorn³. En utilisant cette technique, une rupture transversale normalisée peut être produite par un dispositif de flexion 3 points et les implants intramédullaire peuvent être insérés par une incision de petites parapatellar médiale dans une technique mini-invasive en évitant un traumatisme majeur de tissus mous.

La vis intramédullaire peut être appliquée pour la stabilisation de la fracture fermée chez la souris. La vis offre une stabilité de rotation et axiale. Ceci est réalisé par compression de la fracture par un thread proximal et distale tête⁴. D’autres avantages de la vis sont la simple technique chirurgicale, l’implant le bas grade d’invasivité, le faible poids et, surtout, une plus grande stabilité, fournissant des conditions biomécaniques normalisées et contrôlées par rapport aux autre intramédullaire ⁵les implants. En fait, dans les modèles de fracture plus fermées, les fragments sont stabilisés uniquement par broches simples, qui est associé à un manque de stabilité de rotation et axiale et un risque élevé de goupille et également de fracture luxation. Il peut considérablement influencer le processus de guérison, ce qui peut aboutir à une guérison retardée ou formation non syndiqués.

Il est bien connu que la stabilité de la fixation de la fracture a un impact énorme sur le processus guérison^6,7. Une fixation rigide élevé entraîne guérison intramembranaires, tandis qu’une fixation moins rigide, ce qui autorise les micro-mouvements de l’écart de la fracture, résultats dans la guérison des os endochondral. Stabilisation de la rupture avec la vis intramédullaire montre principalement un endochondrale guérison avec une grande quantité de cals, particulièrement après 2 semaines de guérison des fractures. La possibilité de récolter une grande quantité de cals permet l’analyse de plusieurs paramètres par différentes techniques.

Nous rapportons ici, sur la conception et l’application de la vis intramédullaire chez la souris, ainsi que sur ses avantages et inconvénients dans les études expérimentales sur la guérison des os endochondral normal.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lignes directrices du National Institutes of Health pour l’utilisation des animaux d’expérimentation et suivi les directives institutionnelles (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, (Allemagne).

1. élaboration d’Instruments chirurgicaux et d’Implants

1. Sélectionnez une lame de bistouri Swann-Morton (taille 15), un petit écouvillon, pinces fines, une aiguille de 27 G, une suture non résorbable 5-0, ciseaux et un porte aiguille dans la zone de l’instrument de microchirurgie.
2. Déballez la vis intramédullaire, le fil de guidage (0,3/0,2 mm de diamètre, 10 cm de longueur), la foret de centrage (0,5 mm de diamètre) et la perceuse à main (Figure 1, voir Table des matières).
   Remarque : La vis intramédullaire (0,5 mm de diamètre, 17,2 mm de longueur) est faite d’acier inoxydable de qualité médicale pour une implantation rétrograde dans le fémur. La vis a un filetage proximal (0,5 mm de diamètre, longueur 4 mm) avec un nez (0,2 mm de diamètre, longueur 0,4 mm) à l’extrémité et distale conique tête (0,8 mm de diamètre, longueur 0,9 mm) pour réaliser la compression fracture ainsi que stabilité axiale et de rotation.
3. Exposer les implants et tous les instruments chirurgicaux à une solution désinfectante (96 % d’alcool) pendant 5 min ou stériliser (stérilisation à la vapeur, 130 ° C, 25 min). Après la désinfection ou la stérilisation, placer les instruments sur un tissu de l’opération. Positionner le tissu de l’opération directement adjacent à la table de la petite exploitation animale.

2. les animaux, anesthésie et analgésie

1. Choisissez la souche, âge et sexe des souris selon la question de l’étude dont il est question.
   Remarque : Les souris CD-1 mâles âgés de 12 à 14 semaines ont été utilisées pour cette étude. Le poids du corps approprié d’utiliser la vis intramédullaire est entre 25 et 35 g.
2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine xylazine et 75 mg/kg de 15 mg/kg. Confirmer l’anesthetization de pincement de l’orteil. Appliquer du lubrifiant oculaire pour protéger les yeux des animaux de séchage pendant l’anesthésie. Après l’induction de l’anesthésie, placez votre souris sous un radiateur thermique pour maintenir la température corporelle constante. Au cours de la procédure, animaux ont été suivies avec pincée d’orteil répétées pour assurer un plan approprié de l’anesthésie.
3. Appliquer le chlorhydrate de tramadol dans l’eau potable (1,0 mg/mL) pour l’analgésie de 1 jour avant la chirurgie jusqu’au jour 3 après la chirurgie.
   Remarque : Prévention de l’analgésie et l’infection doit être en accord avec les orientations respectives du pays et l’institution où les essais sont à effectuer.

3. intervention chirurgicale et l’Implantation de vis intramédullaire

1. Avant la chirurgie, raser la jambe postérieure droit et appliquer une crème dépilatoire. Après 5 min, retirez la crème et nettoyer la jambe avec de l’eau. Ensuite, appliquez une solution désinfectante avec 96 % d’alcool. Bétadine ou chlorhexidine peut être ajouté à l’alcool pour assurer une asepsie complète.
2. Dans des conditions aseptiques, placez votre souris en décubitus dorsal sur la table de la petite exploitation animale. Pliez le genou droit afin de permettre une approche antérieure des condyles du genou. Effectuer une incision de 5 mm parapatellar médian au niveau du genou droit à l’aide de la lame de bistouri.
3. Mobiliser le ligament rotulien délicatement avec la lame de bistouri Swann-Morton et l’écouvillon. Ensuite, déplacer la rotule latéralement avec la pince fine pour exposer l’encoche bicondylienne du fémur.
4. Ouvrez l’encoche bicondylienne exactement au milieu du fémur entre les deux condyles. Veillez à ne pas dépasser 1,0 mm d’épaisseur pour le trou de forage.
   1. Démarrage manuel de forage à une vitesse lente et un dévoiement à 45 ° sur le ventre à l’axe du fémur en utilisant la 0,5 mm centrage foret et la perceuse à main (Figure 1 et D, Figure 2). Au cours du forage, continuellement diminuer l’angle de décalage de 0 ° (parallèle à l’axe de l’os du fémur). Arrêter lorsqu’est atteint 1,0 mm de profondeur de forage.
5. Après l’ouverture de l’os à l’encoche bicondylienne, insérer l’aiguille 27 G dans la cavité intra-médullaire sur toute la longueur du fémur. Alésez la cavité intra-médullaire du fémur manuellement par le biais de mouvements de rotation de l’aiguille de 27 G. Pousser l’aiguille vers l’avant pour perforer l’os cortical au grand trochanter proximale.
6. Retirer l’aiguille 27 G et appliquer le guide métallique par l’intermédiaire de la partie distale du fémur.
   1. Faire une incision de la peau avec une lame de bistouri Swann-Morton (taille 15) dans la partie proximale sur le fil-guide et poussez le fil-guide vers l’avant jusqu'à ce que les deux extrémités du fil-guide sont à l’extérieur. Veillez à garder le fil-guide en place.
7. Créer une fracture fermée définie à l’aide de la guillotine.
   1. Placez votre souris en position latérale avec la jambe droite sous la guillotine. Assurez-vous que la pièce diaphysaire du fémur est placée au milieu de la guillotine.
   2. Déplacez le poids (200 g) de la distance définie de 25,5 cm.
8. Contrôler la configuration de la fracture et fracture position ainsi que la position du fil-guide (Figure 3) à l’aide de l’appareil de radiographie (voir Table des matières).
9. Raccorder la vis intramédullaire avec le nez à l’extrémité distale pour le fil de guidage 0,2 mm et insérez-le dans le fémur sous pression continue et la rotation dans le sens horaire.
   1. Cisaillement de l’arbre de transmission lorsque le couple suffisant est atteint.
   2. Enlever le fil de guidage dans la partie proximale.
10. Repositionner la patella et fixer le tendon rotulien aux muscles avec une suture simple utilisant un 5-0 et le synthétique, monofilament, suture de polypropylène. Utiliser des sutures simples de même taille et de matériel pour refermer la plaie. La réduction des fragments et la position de la vis par examen radiologique à l’aide de l’appareil de radiographie de contrôle (voir Table des matières).
11. Garder les animaux sous le radiateur thermique jusqu'à ce qu’ils récupèrent de l’anesthésie. Ne laissez pas les animaux sans surveillance jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus ventral. Rentrer les animaux cages unique dans l’animalerie. Ne pas retourner les animaux à la compagnie d’autres animaux durant les premières 24 heures, même si ils ont pleinement récupéré de l’anesthésie.
12. Surveiller les animaux soigneusement tous les jours. Maintenir à l’aide de chlorhydrate de tramadol dans l’eau potable avec une dose de 1,0 mg/mL pendant les trois premiers jours de l’analgésie postopératoire. Continuer l’analgésie si, au jour 4 après la chirurgie, les animaux montrent toujours des signes de douleur, comme indiqué par la vocalisation, agitation, manque de mobilité, échec de toiletter, posture anormale et manque d’intérêt normal dans un cadre. Mettre fin à l’analgésie lorsque les animaux sont sans douleur.
13. À la fin de l’expérience euthanasier l’animal par une surdose de barbituriques.

Résultats

La durée de fonctionnement de l’incision cutanée de blesser la fermeture a 20 min. La chirurgie peut être effectuée sans un stéréomicroscope. Après l’opération, les animaux ont été surveillés tous les jours. Analgésie post-opératoire a été résilié après 2 jours, parce qu’aucun des animaux présentaient des douleurs après cette période de temps. Les animaux ont aussi supportant le poids normal en 2 jours après la chirurgie. Les infections de plaie n’ont pas ét...

Discussion

Des étapes critiques de l’approche chirurgicale sont à trouver le point d’entrée correct pour l’implantation de vis au milieu des condyles du fémur à l’encoche bicondylienne ainsi que l’orientation optimale de l’aiguille parallèle à l’axe de l’OS pour l’alésage de la cavité intra-médullaire. Pour éviter une position entrée incorrecte, le chirurgien doit préparer l’encoche jusqu'à l’obtention d’une vue optimale. Pour contrôler l’orientation au cours de l’alésage, le fémur des s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Screw	RISystem AG	221,100
Guide wire	RISystem AG	521,100
Centering bit	RISystem AG	590,205
Hand drill	RISystem AG	390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head)	Fink Walter GmbH	8822428
Suture (5-0 Prolene)	Ethicon	8614H
Forceps	Braun Aesculap AG &CoKG	BD520R
Scissors	Braun Aesculap AG &CoKG	BC100R
Needle holder	Braun Aesculap AG &CoKG	BM024R
27 G needle	Braun Melsungen AG	9186182
Scalpel blade size 15	Braun Aesculap AG &CoKG	16600525
Heat radiator	Sanitas	605.25
Depilatory cream	Asid bonz GmbH	NDXZ10
Eye lubricant	Bayer Vital GmbH	2182442
Xylazine	Bayer Vital GmbH	1320422
Ketamine	Serumwerke Bernburg	7005294
Tramadol	Grünenthal GmbH	2256241
Disinfection solution (SoftaseptN)	Braun Melsungen AG	8505018
CD-1 mice	Charles River	22
X-ray Device	Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation	2321A0988
Fracture device small	RISystem AG	891,100