Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica de osteossíntese minimamente invasiva usando um parafuso de haste intramedular padronizada estabilização de fraturas de fêmur, o que pode ser usado para analisar endocondral consolidação óssea em ratos.

Resumo

Modelos de cura óssea são necessários para analisar os mecanismos complexos de fratura cura para melhorar o tratamento clínico da fratura. Durante a última década, um aumento da utilização de modelos de rato em pesquisa ortopédica observou-se, muito provavelmente porque os modelos do rato oferecem um grande número de variedades geneticamente modificadas e anticorpos especiais para a análise dos mecanismos moleculares de consolidação da fratura. Para controlar as condições biomecânicas, técnicas de osteossíntese bem caracterizadas são obrigatórias, também em ratos. Aqui, nós relatamos no design e na utilização de uma modelo de consolidação fechada para estabilizar fraturas de fêmur em ratos. O parafuso da haste intramedular, feito de aço inoxidável de grau médico, fornece através da compressão da fratura uma estabilidade axial e rotacional, em comparação com os pinos intramedular simples mais utilizado, que mostram uma completa falta de estabilidade axial e rotacional. A estabilidade alcançada pelo parafuso intramedular permite a análise de endocondral cura. Uma grande quantidade de tecido de calo, recebido após a estabilização com o parafuso, oferece as condições ideais para a colheita de tecidos para análises bioquímicas e moleculares. Uma vantagem adicional do uso do parafuso é o fato de que o parafuso pode ser inserido em fêmur com uma técnica minimamente invasiva sem induzir danos no tecido macio. Em conclusão, o parafuso é um implante exclusivo que pode ser usado idealmente na fratura fechada modelos oferecendo condições biomecânicas padronizadas de cura.

Introdução

Estudos de cura óssea em ratos estão em grande demanda por causa de um amplo espectro de anticorpos e animais geneticamente modificados. Estes factos permitem estudar os mecanismos moleculares do osso cura¹. Nos últimos anos, osso de diferente modelos de cura para os ratos foram desenvolvidos². Estes modelos podem ser divididos em modelos abertos, em que o osso é osteotomizado usando uma abordagem cirúrgica lateral aberta e em modelos fechados, baseados no modelo apresentado por Bonnares e Einhorn³fratura em que o osso está fraturado. Usando esta técnica, uma fractura transversal padronizada pode ser produzida por um dispositivo de dobrando de 3 pontos e implantes intramedulares podem ser inseridos através de uma incisão parapatelar medial pequeno em uma técnica minimamente invasiva, evitando um trauma de tecido mole principais.

O parafuso de haste intramedular pode ser aplicado para a estabilização da fratura fechada em camundongos. O parafuso oferece estabilidade rotacional e axial. Isto é conseguido por compressão de fratura através de um segmento proximal e uma distal cabeça⁴. Outras vantagens do parafuso são a técnica cirúrgica simples, o baixo grau de invasivity, o baixo peso e, principalmente, uma maior estabilidade, proporcionando condições biomecânicas padronizadas e controladas, em comparação com outro intramedular do implante implantes de⁵. Na verdade, nos modelos mais fechados da fratura, os fragmentos são estabilizados somente por pinos simples, que está associado uma completa falta de estabilidade rotacional e axial e um risco elevado de pin em também fratura luxação. Isto marcadamente pode influenciar o processo de cicatrização, que pode resultar em cicatrização ou formação não-sindicalizados.

É sabido que a estabilidade da fixação da fratura tem um impacto tremendo no processo cura^6,7. Uma fixação rígida alta resulta em cura intramembranosa, enquanto uma fixação menos rígida, que pode permitir micromovimentos a lacuna de fratura, resultados na cura de endocondral. Estabilização da fratura com o parafuso de haste intramedular mostra predominantemente um endocondral cura com uma grande quantidade de calo de tecido, particularmente após duas semanas de consolidação da fratura. A possibilidade de colher uma grande quantidade de calo de tecido permite a análise de vários parâmetros por diferentes técnicas.

Aqui, nós relatamos sobre a concepção e a aplicação do parafuso intramedular em ratos, bem como sobre suas vantagens e desvantagens em estudos experimentais sobre a cura de osso endocondral normal.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health para o uso de animais experimentais e seguiram as orientações institucionais (turismo für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken Alemanha).

1. preparação de instrumentos cirúrgicos e implantes

1. Selecione uma lâmina de bisturi (tamanho 15), um pequeno cotonete, pinça fina, agulha 27G, uma sutura não absorvível de 5-0, tesoura e um porta-agulha da caixa instrumento microcirúrgico.
2. Descompacte o parafuso da haste intramedular, o fio-guia (0,2/0,3 mm de diâmetro, 10 cm de comprimento), o bocado de broca de centragem (0,5 mm de diâmetro) e a broca de mão (Figura 1; consulte Tabela de materiais).
   Nota: O parafuso de haste intramedular (0,5 mm de diâmetro, comprimento de 17,2 milímetros) é feito de aço inoxidável de grau médico para implantação retrógrada em fêmur. O parafuso tem um segmento proximal (0,5 mm de diâmetro, comprimento de 4 mm) com um nariz (0,2 mm de diâmetro, 0,4 mm de comprimento) na ponta e distal em forma de cone de cabeça (0,8 mm de diâmetro, comprimento de 0,9 mm) para alcançar a fratura de compressão, bem como a estabilidade axial e rotacional.
3. Expor os implantes e todos os instrumentos cirúrgicos para uma solução desinfectante (96% de álcool) por 5 min ou esterilizá-los (esterilização a vapor, 130 ° C, 25 min). Após a desinfecção ou esterilização, coloque os instrumentos sobre um pano de operação. O pano de operação diretamente adjacente à tabela pequena operação animais de posição.

2. animais, anestesia e Analgesia

1. Escolha a tensão, idade e sexo dos ratos de acordo com a questão de estudo, que é dirigida.
   Nota: Para este estudo foram utilizados camundongos CD-1 sexo masculino de 12 a 14 semanas de idade. O peso de corpo adequado para usar o parafuso intramedular é entre 25-35 g.
2. Anestesia os ratos com uma injeção intraperitoneal de 15 mg/kg de xilazina e 75 mg/kg de ketamina. Confirme o anesthetization pitada de dedo do pé. Aplique o lubrificante do olho para proteger os olhos dos animais de secagem durante a anestesia. Após a indução da anestesia, posicione o mouse sob um radiador de calor para manter a temperatura corporal constante. Durante o procedimento, os animais foram monitorados com pitada de repetidas do dedo do pé para garantir um plano adequado de anestesia.
3. Aplica o cloridrato de tramadol em água potável (1,0 mg/mL) para analgesia dia 1, antes da cirurgia, até dia 3, após a cirurgia.
   Nota: Prevenção de infecção e Analgesia deve ser de acordo com as respectivas orientações do país e a instituição onde os experimentos devem ser executadas.

3. ato cirúrgico e implantação do parafuso de haste intramedular

1. Antes da cirurgia, raspar toda a perna direita traseira e aplique um creme depilatório. Após 5 min, retire o creme e limpe a perna com água. Em seguida, aplica uma solução desinfectante com 96% de álcool. Betadine ou clorexidina pode ser adicionada para o álcool para garantir total assepsia.
2. Sob condições assépticas, posicione o mouse na posição supina na mesa de operação de animais pequenos. Dobre o joelho direito para permitir uma abordagem anterior para os côndilos do joelho. Realize uma incisão parapatelar medial 5 mm no joelho direito usando a lâmina de bisturi.
3. Mobilize o ligamento patelar cuidadosamente com a lâmina de bisturi e a amostra. Em seguida, deslocar a patela lateralmente com a pinça fina para expor o entalhe intercondilar do fêmur.
4. Abra o entalhe intercondilar exatamente no meio do fêmur entre ambos os côndilos. Certifique-se de não deve exceder 1,0 mm de profundidade para o furo.
   1. Inicie-manual de perfuração em uma velocidade lenta e um deslocamento de 45 ° ventralmente ao eixo do fêmur com a 0,5 mm, centrando a broca e a broca de mão (Figura 1 e D, Figura 2). Durante a perfuração, continuamente diminua o ângulo de deslocamento de 0 ° (em paralelo com o eixo do osso do fêmur). Pare quando é alcançada uma profundidade de 1,0 mm de perfuração.
5. Depois de abrir o osso que o entalhe intercondilar, introduza a agulha 27G na cavidade intramedular a todo o comprimento do fêmur. Resma de cavidade intramedular do fêmur manualmente através de movimentos giratórios da agulha 27G. Empurre a agulha para a frente para perfurar o osso cortical no grande trocanter proximalmente.
6. Retire a agulha 27G e aplicar o fio-guia através da parte distal do fêmur.
   1. Fazer uma incisão na pele com uma lâmina de bisturi (tamanho 15) proximalmente sobre o fio guia e avance o fio-guia até que ambas as extremidades do fio-guia estão fora. Certifique-se de manter o fio-guia no lugar.
7. Crie uma fratura fechada definida usando a guilhotina.
   1. Coloque o mouse em posição lateral com a perna direita na guilhotina. Certifique-se de que a parte de diáfise do fêmur é colocada no meio da guilhotina.
   2. Larga o peso (200 g) da distância definida de 25,5 cm.
8. Controlar a configuração de fratura e fratura posição, bem como a posição do fio-guia (Figura 3), usando o aparelho de raio x (ver Tabela de materiais).
9. Conecte o parafuso de haste intramedular com o nariz na extremidade distal para o fio-guia de 0.2 mm e inseri-lo no fêmur sob pressão contínua e a rotação no sentido horário.
   1. Cisalhamento do eixo rígido quando é alcançado o torque suficiente.
   2. Retire o fio-guia proximalmente.
10. Reposicionar a patela e corrigir o tendão da patela aos músculos com uma sutura simples usando um sintético 5-0, monofilamento, sutura não absorvível de polipropileno. Use o única suturas do mesmo material e tamanho para fechar o ferimento. A redução dos fragmentos e a posição do parafuso radiologicamente usando o aparelho de raio-x de controle (veja a Tabela de materiais).
11. Manter os animais sob o radiador de calor, até se recuperarem da anestesia. Não deixe os animais sem vigilância até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração ventral. Devolver os animais para gaiolas simples na instalação de animais. Não devolva os animais para a companhia de outros animais durante as primeiras 24 horas, mesmo que eles se recuperaram totalmente da anestesia.
12. Monitore os animais com cuidado todos os dias. Manter a analgesia pós-operatória usando cloridrato de tramadol em água potável com uma dose de 1,0 mg/mL durante os três primeiros dias. Continue a analgesia se, no dia 4, após a cirurgia, os animais ainda mostram evidências de dor, conforme indicado pela vocalização, inquietude, falta de mobilidade, falha ao noivo, postura anormal e falta de interesse normal no ambiente. Finalizar a analgesia, quando os animais estão sem dor.
13. No final do experimento abater o animal por uma overdose de barbitúricos.

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Resultados

O tempo de funcionamento da incisão de pele para fechamento de ferida foi de 20 min. A cirurgia pode ser realizada sem um estereoscópio. No pós-operatório, os animais foram monitorados diariamente. Analgesia pós-operatória foi finalizado depois de 2 dias, porque nenhum dos animais apresentou evidência de dor após este período de tempo. Os animais também mostraram peso-rolamento normal dentro de 2 dias após a cirurgia. Infecção da ferida não foram observadas durante o períod...

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Discussão

Passos críticos do procedimento cirúrgico são para encontrar o ponto de entrada correta para implantação do parafuso no meio os côndilos do fêmur no entalhe intercondilar, bem como a orientação ideal da agulha paralela ao eixo do osso para fresagem do cavidade intramedular. Para evitar uma posição de entrada incorreta, o cirurgião deve preparar o entalhe até que seja alcançada uma visão ideal. Para controlar a orientação durante a fresagem, o fêmur dos ratos deve ser realizado com os dedos em uma posiç...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Screw	RISystem AG	221,100
Guide wire	RISystem AG	521,100
Centering bit	RISystem AG	590,205
Hand drill	RISystem AG	390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head)	Fink Walter GmbH	8822428
Suture (5-0 Prolene)	Ethicon	8614H
Forceps	Braun Aesculap AG &CoKG	BD520R
Scissors	Braun Aesculap AG &CoKG	BC100R
Needle holder	Braun Aesculap AG &CoKG	BM024R
27 G needle	Braun Melsungen AG	9186182
Scalpel blade size 15	Braun Aesculap AG &CoKG	16600525
Heat radiator	Sanitas	605.25
Depilatory cream	Asid bonz GmbH	NDXZ10
Eye lubricant	Bayer Vital GmbH	2182442
Xylazine	Bayer Vital GmbH	1320422
Ketamine	Serumwerke Bernburg	7005294
Tramadol	Grünenthal GmbH	2256241
Disinfection solution (SoftaseptN)	Braun Melsungen AG	8505018
CD-1 mice	Charles River	22
X-ray Device	Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation	2321A0988
Fracture device small	RISystem AG	891,100