新生小鼠脑巴细胞基因调控的立体定向手术

摘要

我们描述了一个立体定向手术的协议, 一个自制的头固定装置 microinjecting 试剂进入新生鼠脑纹状体。这种技术允许在新生小鼠大脑特定区域的神经细胞中进行基因操作。

摘要

许多基因是在胚胎大脑中表达的, 其中有些是在出生后大脑中不断表达的。对于这种持续表达的基因, 它们可以调节新生儿大脑的发育过程和/或生理功能。为了研究大脑中特定基因的神经生物学功能, 在脑中灭活基因是必不可少的。在这里, 我们描述了一个简单的立体定向的方法, 以灭活基因表达在转基因小鼠在新生儿时间窗口。AAV eGFP 病毒通过立体定向脑外科术, 杏仁于产后 (P) 2 Ai14 报告基因小鼠纹状体。在 P14 纹状体中检测到 tdTomato 报告基因表达, 提示 AAV 转基因细胞中成功的 loxP 介导的 DNA 重组。我们进一步验证了这一技术, 通过 microinjecting AAV eGFP 病毒的 P2Foxp2^{佛罗里达州/佛罗里达州}小鼠。荧光蛋白和 Foxp2 的双重标记表明, gfp 阳性细胞在 P9 纹状体中缺乏 Foxp2 免疫反应, 提示 AAV eGFP 细胞 Foxp2 蛋白质的丢失。这些结果表明, 在 floxed 转基因小鼠的新生儿脑中, stereotaxically 杏仁 AAV eGFP 病毒对特定神经元群有有效的遗传缺失。总之, 我们的立体定向技术为新生小鼠大脑中的基因操作提供了一个简单的平台。该技术不仅可以用于删除新生儿大脑特定区域的基因, 而且还可用于注射药理药物、神经元示踪剂、基因修饰光遗传学和 chemogenetics 蛋白、神经元活动指标和其他试剂进入新生鼠脑纹状体。

引言

现代对大脑结构和功能的研究通常需要神经元细胞中特定基因的基因调控。为了探讨不同基因的功能, 转基因小鼠携带突变等位基因, 包括敲除和敲入的基因, 已被常规生成。成人啮齿动物立体定向脑外科是一种标准的方法, 当地提供药物, 病毒, 示踪剂和其他试剂到特定区域的啮齿动物大脑^1,2。将立体定向脑外科应用于转基因小鼠, 允许基因调控小鼠大脑特定神经元群中的基因功能和神经元活动。细胞类型特定的操作提供了一个强大的方法来破译神经元功能的复杂神经回路的大脑^3,4,5。

神经系统的神经发育始于早期胚胎阶段, 发育过程在出生后持续到幼年期。神经系统的产后成熟包括神经回路的精确突触布线, 这对于大脑⁶的生理和认知功能是必不可少的。因此, 研究新生儿时间窗发生的发育事件, 不仅对了解正常的神经发育有重要意义, 而且还可以为神经发育和精神疾病的发病机制提供深入的认识^{7 ,8}。虽然成人啮齿目动物的立体定向脑外科手术方法²⁹, 但在互联网上有少量的协议可供新生小鼠^10,11的立体定向脑外科手术使用。事实上, 在新生小鼠幼崽的大脑中对试剂进行立体定向 microinjections 是困难的, 因为新生儿幼犬的头部太脆弱, 无法固定在标准的立体定向设备中。然而, 在转基因小鼠中应用立体定向脑手术是可行的¹²。在这里, 我们描述了一个简单的方法, 自制的设置, 进行立体定向脑外科手术的新生鼠幼崽。我们证明, 这种技术允许一个有条件地删除 floxed 基因 microinjecting AAV 表达的 DNA recombinase 到报告基因小鼠纹状体和有条件 floxed 转基因小鼠。该技术也适用于向野生型小鼠的新生纹状体提供试剂。

研究方案

这里所描述的动物协议已经得到国立阳明大学动物保育委员会的批准。

1. 在立体定向装置中制备新生儿幼崽的支架

1. 制作头托盘: 将1.5 毫升离心管 (15 毫米长) 的底部切割成适合新生儿幼崽头部的形状, 并除去1/5 的管壁。
2. 取一个合适大小的吸管尖盒, 适合于立体定向设备的底座, 并取下顶盖。将步骤1.1 中的头托盘和组织嵌入盒贴在热熔胶粘剂的刀尖托盘底座上。组织嵌入盒的高度为7毫米, 用于支撑幼犬的颈部和身体在头部固定位置。
3. 将整个设置放置在标准的立体定向设备中。

2. 30G 注射用不锈钢针的制备

1. 用氯仿浸泡3天前清洁30G 注射器针。
2. 使用镊子小心, 慢慢地从它的聚丙烯轮毂在一个化学罩拔出针。
3. 用绝对乙醇清洗针头20分钟后, 70% 乙醇漂洗 3 x 10 分钟在一个振动筛在 50 rpm。让针头风干, 并将清洗过的针头储存在室温 (RT) 的清洁箱中, 直到使用。

3. 准备用于微注射油管的适配器

1. 用 PE10 聚乙烯管 (PE10 管) 将微升注射器连接到30G 注射针。准备一 PE20 聚乙烯油管 (PE20 管) 适配器, 用于连接注射针和微升注射器。使用适配器是必要的, 因为 PE10 管的直径比26G 微升注射器的针头小得多。
2. 准备微升注射器的油管: 用5厘米的 PE20 管连接预清洗的30G 注射针, 并用即时胶水密封接头。这种油管适配器是可重用的。
   注: 如果注射注射器的针头为 30G, 则不需要此适配器的准备 (步骤 3.1) 和使用 (步骤 3.3)。
3. 用微升注射器 (10 µL) 将油管适配器 (在步骤3.1 中制备) 连接起来。
4. 将 PE10 管的一端连接在 PE20 油管适配器的30G 针上 (不超过60厘米)。将新的30G 注射针安装到 PE10 管的另一端。

4. 用蒸压蒸馏水、染料和病毒装载微注射管

1. 取出微升注射器的柱塞。使用25G 注射器加载微升注射器及其连接的 PE 管与蒸压蒸馏水, 以消除空气从油管。
2. 将柱塞放回微升注射器, 并推入柱塞直到2µL 的蒸馏水留在桶中。不要让蒸馏水的体积低于2µL。
3. 小心地将微升注射器安装在微流速注射器泵上。
4. 吸管少量0.1% 快速绿色染料 (准备在0.9% 盐水和过滤与0.22 µm 过滤器) 和病毒液体到一块 parafilm。
5. 提取少量空气, 使气泡在30G 注射针和 PE10 管之间的连接处可见, 然后将0.7 µL 过滤后的快速绿色装入管内, 以测试微注射油管中的流体流动。
6. 取出另一小部分空气, 使第二个气泡接着将病毒液体装入微注射油管。
7. 将30G 显微注射针固定在立体定向装置的手臂上。

5. 低温对新生小鼠的麻醉作用

1. 把小狗放在乳胶手套袖子里, 把它浸泡在被粉碎的冰上, 脖子上5分钟。
2. 用镊子捏住幼崽的脚, 以确保它的脚没有退缩反应。
3. 将小狗与乳胶手套套放在头托盘, 并在乳胶套周围放置一些粉碎冰, 以保持它冷低温麻醉。
4. 在小狗眼中应用兽医软膏, 以防麻醉时的干燥, 如果可能的话。

6. 显微注射

1. 用70% 乙醇彻底擦拭立体定向仪, 制备无菌手术。将手术器械浸泡在70% 乙醇中消毒。
2. 用70% 乙醇擦洗幼崽的头部。找到头骨上的地标 lambda 并用标记笔标记 lambda。将针尖对准 lambda, 将前后 (AP) 和内侧侧 (ML) 坐标设置为零。
3. 根据目标站点的 X 和 Y 坐标将注射臂移动到目标站点。对于产后日 (P) 2 只幼崽的纹状体, 其座标为: AP, +2.4 毫米前的 lambda;ML, ±1.0 毫米侧向中线;背腹 (DV), −1.7 毫米从头骨。用钢笔标记 PE10 管内快速绿色染料的位置。
4. 把30G 注射针慢慢地穿透皮肤和头骨, 然后把针尖拉起来, 直到它在头骨的表面停止。将 DV 坐标设置为零。
5. 慢慢降低30G 注射针, 直到到达目标站点的 DV 坐标。等待1分钟, 让实质恢复其正常形状。运行微注射程序 (100 nL/分钟)。
6. 确保快速绿色染料的标记在 PE 管中移动, 以确保病毒液体注入大脑。
7. 在微注射结束后等待1分钟, 然后慢慢地将针从1/2 高的 DV 深度上升到三十年代以内。三十年代以后, 慢慢地从幼崽的头上取出针头。
8. 重复步骤6.2 至 6.7, 直到所有目标站点的 microinjections 完成。

7. 幼犬术后恢复

1. 在33摄氏度孵化器中热身20分钟的幼崽。检查幼犬从低温麻醉中恢复每5分钟, 直到幼犬恢复足够的意识, 以维持胸骨卧床。
2. 幼崽完全恢复后, 把幼崽送回大坝。

结果

在第一组实验中, 我们杏仁了 200 AAV9 的 hSynapsin. eGFP WPRE SV40 病毒 (AAV eGFP, 1/10 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水稀释), 表达了与 GFP 的 DNA recombinase 与绿色荧光蛋白融合为 P2 小鼠的 Ai14 纹状体。Ai14 小鼠在 tdTomato 的 loxP 侧 (floxed) 停止盒 (图 2F) 的基础上, 表达了对该基因的报道。大脑是在 P14 染色的 GFP 和 tdTomato 中收获的。许多 AAV 转基因 GFP 阳性细胞存在于整个?...

讨论

在本研究中, 我们展示了一种简单可靠的立体定向方法, 将 AAV 病毒注入新生小鼠脑纹状体。在 P2, 我们将 AAV eGFP 病毒杏仁 Ai14 小鼠纹状体中, 然后分析了 P14 的报告基因表达。我们发现 AAV 转基因 GFP 阳性细胞在整个纹状体 rostrocaudal 水平。此外, 几乎所有的 GFP 阳性细胞都在巴细胞中共同表达了 tdTomato 报告基因, 这表明 loxP DNA 重组是由 AAV 介导的。我们进一步证实了这种方法的有效性, 通过 microinject...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson	REF 305106
Chloroform	JT Baker	9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe	Hamilton	80300	30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20	Becton Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton Dickinson	427401
Micro Flow Rate Syringe Pump	Longer Precision Pump Co.	TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe	Becton Dickinson	REF 302105
Fast green	Sigma-Aldrich	F-7252	0.1%
Standard Stereotaxic Instruments	RWD Life Science	68037	Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody	Abcam	ab16046	Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody	Abcam	ab65856	Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope	Olympus	BX63
LSM 880 confocal microscope	Zeiss	LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594	Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.	111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-9-PV1848	Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP	AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan	N/A	1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Labtorary	007914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ	The Jackson Labtorary	026259	Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Corning cellgro	21-030-CVR