Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Riepilogo

Descriviamo un protocollo di chirurgia stereotassica con un dispositivo fisso testa fatti in casa per microinjecting reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse. Questa tecnica permette la manipolazione genetica in cellule neuronali di specifiche regioni del cervello di topo neonatale.

Abstract

Molti geni sono espressi nel cervello embrionale, e alcuni di loro sono continuamente espresso nel cervello dopo la nascita. Per tali geni espressi in modo persistente, possono funzionare per regolare il processo di sviluppo e/o funzione fisiologica nel cervello neonatale. Per indagare le funzioni neurobiologiche di specifici geni nel cervello, è essenziale che inattivano geni nel cervello. Qui, descriviamo un semplice metodo stereotassica per inattivare l'espressione genica nel corpo striato di topi transgenici alle finestre temporali neonatale. AAV-eGFP-Cre virus erano microiniettati nello striato di topi Ai14 reporter gene al giorno postnatale (P) 2 di chirurgia stereotassica cerebrale. L'espressione di gene reporter tdTomato è stata rilevata nello striatum P14, suggerendo che un successo Cre-loxP mediato ricombinazione del DNA in cellule trasdotte AAV striatali. Abbiamo validato ulteriormente questa tecnica da microinjecting virus AAV-eGFP-Cre nei topi P2Foxp2^fl/fl . Doppia etichettatura di GFP e Foxp2 ha mostrato che le cellule GFP-positive mancavano immunoreactivity Foxp2 nello striatum P9, suggerendo la perdita della proteina Foxp2 in cellule striatali AAV-eGFP-Cre trasformata. Presi insieme, questi risultati dimostrano un'efficace eliminazione genetica da stereotassicamente iniettati virus AAV-eGFP-Cre in specifiche popolazioni neuronali nel cervello neonatale di topi transgenici floxed. In conclusione, la nostra tecnica stereotassica fornisce una piattaforma facile e semplice per manipolazione genetica in cervelli di topo neonatale. La tecnica non può essere utilizzata solo per eliminare geni in regioni specifiche del cervello neonatale, ma può essere utilizzato anche per iniettare droghe farmacologiche, traccianti neuronali, geneticamente optogenetica e proteine chemogenetics, indicatori di attività neuronale e altri reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse.

Introduzione

Moderni studi sulla struttura e funzione del cervello di solito richiedono manipolazione genetica di specifici geni nelle cellule neuronali. Per sondare le funzioni dei geni differenti, topi transgenici portatori di alleli mutanti, tra cui knockout e knock-in alleli sono stati generati regolarmente. Chirurgia stereotassica cerebrale per roditori adulti è un metodo standard per fornire localmente farmaci, virus, traccianti e altri reagenti a specifiche regioni del cervello del roditore^1,2. Applicando la chirurgia stereotassica cervello di topi transgenici permette di manipolare geneticamente la funzione del gene e l'attività neuronale in specifiche popolazioni neuronali del cervello del mouse. La manipolazione di specifici del tipo di cella fornisce un approccio potente per decifrare funzioni neuronali nei complessi circuiti neurali del cervello^3,4,5.

Sviluppo neurale del sistema nervoso comincia alle prime fasi embrionali, e continuano i processi di sviluppo dopo la nascita fino al periodo giovanile. Postnatale maturazione del sistema nervoso include il cablaggio sinaptico preciso dei circuiti neurali, che è essenziale per le funzioni fisiologiche e cognitive del cervello⁶. Pertanto, è importante non solo per comprendere lo sviluppo neurale normale studiare eventi inerenti allo sviluppo che si verificano in finestre temporali neonatale, ma può anche fornire comprensioni nella patogenesi di neurodevelopmental ed i disordini neuropsichiatrici^{7 ,8}. Sebbene i metodi di chirurgia stereotassica cerebrale per roditori adulti sono prontamente disponibili^2,9, alcuni protocolli sono disponibili su internet per chirurgia stereotassica cerebrale in topi neonatali^10,11. Infatti, microiniezioni stereotassiche dei reagenti nei cervelli dei cuccioli del mouse neonatale sono difficili, perché la testa di pup neonatale è troppo fragile per essere fissato nell'apparato stereotassica standard. Tuttavia, l'applicazione della chirurgia stereotassica cerebrale di topi transgenici è fattibile per topi neonatali¹². Qui, descriviamo un metodo semplice con un setup fatti in casa per eseguire chirurgia stereotassica cerebrale nei cuccioli di neonato mouse. Dimostriamo che questa tecnica permette di eliminare condizionalmente floxed geni di microinjecting ricombinasi AAV-esprimendo Cre DNA nello striato di topi gene reporter e condizionalmente floxed topi transgenici. Questa tecnica è anche applicabile per fornire reagenti nello striato neonatale di topi wild-type.

Protocollo

I protocolli degli animali descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso comitati della National Yang-Ming University.

1. preparazione del supporto per cuccioli neonatali nell'apparato stereotassica

1. Rendere il vassoio testa: tagliare il fondo di una provetta da centrifuga da 1,5 mL (15 mm di lunghezza) nella forma che si adatta alla testa dei cuccioli neonatale rimuovendo 1/5 della parete del tubo.
2. Una casella di punta della pipetta con la giusta dimensione che si adatta con il piedistallo dell'apparato stereotassiche e rimuovere il coperchio superiore. Apporre il vassoio testa preparato nel passaggio 1.1 e una cassetta di incorporamento di tessuto sulla base del vassoio di punta con adesivo hot-fusione. L'altezza della cassetta incorporamento del tessuto è di 7 mm, che viene utilizzato per supportare il pup collo e corpo in posizione di testa-fisso.
3. Posto l'intero setup apparecchiature stereotassiche.

2. preparazione di 30g iniezione aghi in acciaio inox

1. Aghi di siringhe 30g prepulizia immergendo in cloroformio per 3 giorni.
2. Utilizzare pinze per lentamente e con cautela estrarre l'ago dal suo hub in polipropilene in una cappa chimica.
3. Lavare gli aghi con etanolo assoluto per 20 min seguita da risciacqui di etanolo 70% per 3 × 10 minuti su un agitatore a 50 giri/min. Lasciare che l'aria di aghi asciugare e conservare gli aghi puliti in una scatola pulita a temperatura ambiente (TA) fino all'utilizzo.

3. preparare un adattatore per tubo rame Microinjection

1. Collegare la siringa microliter di un ago per iniezione 30G con un tubo di polietilene PE10 (PE10 tubo). Preparare un adattatore per tubo (tubo PE20) polietilene PE20 per colmare l'inserimento dell'ago e la siringa di microliter. L'uso dell'adattatore è necessario, perché il diametro del tubo PE10 è molto più piccolo di quello dell'ago della siringa microliter 26G.
2. Preparare la tubatura per microliter siringa: collegare l'ago per iniezione pre-pulito 30 G con 5 cm di tubo PE20 e sigillare la giunzione con colla istantanea. Questo adattatore della tubazione è riutilizzabile.
   Nota: Se l'ago della siringa di microiniezione è 30G, la preparazione (fase 3.1) e l'utilizzo (punto 3.3) di questo adattatore non è necessario.
3. Collegare l'adattatore del tubo (preparata al punto 3.1) con una siringa di microlitro (10 µ l).
4. Collegare un'estremità del tubo PE10 (non più di 60 cm) sull'ago 30g dell'adattatore tubo PE20. Montare un nuovo ago per iniezione 30G sull'altra estremità del tubo PE10.

4. caricare il tubo di microiniezione con acqua distillata in autoclave, tintura e virus

1. Togliere lo stantuffo della siringa microliter. Utilizzare una siringa di 25G per caricare la siringa microliter e il suo tubo di PE connesso con acqua distillata in autoclave per eliminare l'aria dal tubo.
2. Posizionare il pistone torna alla siringa microliter e spingere lo stantuffo fino a 2 µ l di acqua distillata rimane in canna. Non lasciare che il volume di acqua distillata diventano inferiore a 2 µ l.
3. Montare con cura siringa microliter la pompa a siringa micro portata.
4. Pipettare piccole quantità di colorante 0,1% veloce verde (preparato in soluzione fisiologica allo 0,9% e filtrato con filtro di 0,22 µm) e i liquidi di virus a un pezzo di parafilm.
5. Prelevare una piccola quantità di aria per rendere visibile una bolla d'aria all'incrocio tra l'ago per iniezione 30g e PE10 tubo seguita da 0,7 µ l di filtrato verde veloce di carico nel tubo per verificare il flusso dei liquidi nelle tubazioni microiniezione.
6. Ritirare un'altra piccola quantità di aria per rendere una bolla d'aria seconda seguita caricando i liquidi di virus nella tubazione microiniezione.
7. Collegare e fissare l'ago per microiniezione 30g al braccio dell'apparecchiatura stereotassica.

5. anestesia di topi neonatali di ipotermia

1. Collocare il cucciolo in un manicotto di guanto di lattice e immergerlo nel ghiaccio tritato fino al collo per 5 min.
2. Un pizzico di piedi di pup con pinze per non assicurarsi che nessuna risposta di ritiro dei suoi piedi.
3. Collocare il cucciolo con manica guanto di lattice nel vassoio di testa e metti del ghiaccio schiacciato attorno al manicotto in lattice per mantenere il freddo per anestesia di ipotermia.
4. Applicare unguento veterinario sugli occhi del cucciolo per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia se possibile.

6. microiniezione

1. Preparare chirurgia sterile pulendo lo strumento stereotassica accuratamente con etanolo al 70%. Sterilizzare lo strumento chirurgico immergendole in etanolo al 70%.
2. Strofinare la testa di pup con etanolo al 70%. Individuare la lambda pietra miliare sul cranio e contrassegnare la lambda con un pennarello. Dirigere la punta dell'ago per la lambda e impostare l'antero-posteriore (AP) e mediale-laterale (ML) Coordinate come zero.
3. Spostare il braccio di iniezione al sito di destinazione, secondo le coordinate X e Y del sito di destinazione. Per il corpo striato di giorno postnatale (P) 2 cuccioli, le coordinate sono: AP, +2,4 mm in avanti facendo la lambda; ML, ± 1,0 mm laterale dalla linea mediana; dorso-ventrale (DV), −1.7 mm dal cranio. Segnare la posizione della tintura veloce verde in PE10 tubo con una penna.
4. Portare giù l'ago per iniezione 30g lentamente a penetrare attraverso la pelle e il cranio e quindi portare la punta dell'ago finché non si ferma alla superficie del cranio. Impostare la coordinata DV come zero.
5. Far cadere l'ago per iniezione 30g lentamente fino a raggiungere la coordinata DV del sito di destinazione. Attendere 1 minuto consentire il parenchima riprendendo la sua forma normale. Eseguire il programma di Microiniezione (100 nL/min).
6. Assicurarsi che il marchio della tintura veloce verde si muove nel tubo PE affinché che il liquido di virus è iniettato nel cervello.
7. Attendere 1 minuto dopo la cessazione della microiniezione e poi lentamente e progressivamente portare l'ago all'altezza di 1/2 di profondità DV entro 30 s. Dopo 30 s, estrarre lentamente l'ago dalla testa di pup.
8. Ripetere il passaggio 6.2 a 6.7 finché non vengono completate le microiniezioni di tutti i siti mirati.

7. post-chirurgica di recupero del cucciolo

1. Scaldare il pup per 20 min in un incubatore a 33 ° C. Controllare il recupero del cucciolo dall'ipotermia anestesia ogni 5 min fino a quando il cucciolo ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
2. Riportare il cucciolo alla diga dopo il cucciolo è completamente recuperato.

Risultati

Per il primo set di esperimento, abbiamo microiniettati 200 nL di AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, diluizione 1: 10 in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) che esprimono la ricombinasi Cre DNA fusi con GFP in P2 striato di topi Ai14. I topi Ai14 rapidi tdTomato gene reporter all'omissione Cre-mediata di loxP-fiancheggiato (floxed) fermata cassetta (Figura 2F). I cervelli sono stati raccolti presso P14 per immunostaining...

Discussione

Nello studio presente, dimostriamo un metodo semplice e affidabile stereotassica per iniettare il virus AAV nello striato del cervello di topo neonatale. Abbiamo microiniettati virus AAV-eGFP-Cre nello striato di topi reporter Ai14 a P2 e poi analizzata l'espressione del gene reporter presso P14. Abbiamo trovato che AAV trasdotte cellule GFP-positive in tutto il corpo striato a rostrocaudal livelli. Inoltre, quasi tutte le cellule GFP-positive co-espressi il gene reporter di tdTomato in cellule striatali, suggerendo una ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson	REF 305106
Chloroform	JT Baker	9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe	Hamilton	80300	30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20	Becton Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton Dickinson	427401
Micro Flow Rate Syringe Pump	Longer Precision Pump Co.	TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe	Becton Dickinson	REF 302105
Fast green	Sigma-Aldrich	F-7252	0.1%
Standard Stereotaxic Instruments	RWD Life Science	68037	Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody	Abcam	ab16046	Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody	Abcam	ab65856	Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope	Olympus	BX63
LSM 880 confocal microscope	Zeiss	LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594	Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.	111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-9-PV1848	Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP	AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan	N/A	1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Labtorary	007914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ	The Jackson Labtorary	026259	Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Corning cellgro	21-030-CVR