신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

요약

우리는 신생아 마우스 두뇌의가에 microinjecting 시 약에 대 한 수 제 머리 고정 장치 stereotaxic 수술의 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 신생아 마우스 두뇌의 특정 영역의 신경 세포에서 유전자 조작 가능

초록

많은 유전자는 미 발달 머리에 표현 하 고 그들 중 일부는 지속적으로 출생 후 뇌에 표현. 이러한 지속적으로 표현한 유전자에 대 한 그들은 발달 과정 및 신생아 두뇌의 생리 기능을 조절 하 작동 수 있습니다. 두뇌에 있는 특정 유전자의 neurobiological 기능 조사, 두뇌에서 유전자를 비활성화 필수적 이다. 여기, 우리 신생아 시간 창에서 유전자 변형 생쥐의 고가에 유전자 발현을 비활성화 하는 간단한 stereotaxic 방법을 설명 합니다. AAV eGFP Cre 바이러스는 출생 후 하루 (P) stereotaxic 뇌 수술에 의해 2에서 Ai14 기자 유전자 쥐가 microinjected 했다. TdTomato 기자 유전자 발현 P14가, 성공적인 Cre loxP 중재 DNA 재조합 AAV 불리고 striatal 셀에 제안에 발견 되었다. 우리는 더 AAV eGFP Cre 바이러스 P2Foxp2^{fl/플로리다} 쥐로 microinjecting에 의해이 기술을 검증. GFP의 Foxp2 더블 라벨 GFP-긍정적인 세포 Foxp2 immunoreactivity P9가, AAV-eGFP-Cre 불리고 striatal 셀에서 Foxp2 단백질의 손실을 제안에 부족을 보여주었다. 함께 찍은, 이러한 결과 floxed 유전자 변형 생쥐의 신생아 두뇌에 있는 특정 신경 인구에 있는 stereotaxically microinjected AAV eGFP Cre 바이러스에 의해 효과적인 유전자 삭제를 보여 줍니다. 결론적으로, 우리의 stereotaxic 기술 신생아 마우스 두뇌에서 유전자 조작에 대 한는 쉽고 간단한 플랫폼을 제공합니다. 기술만 사용할 수 없는 신생아 두뇌의 특정 지구에 있는 유전자를 삭제 하 하지만 또한 사용할 수 있습니다 약물 약물, 신경 추적기, 유전자 변형된 optogenetics 및 chemogenetics 단백질, 신경 활동 지표를 삽입 하 고 신생아 마우스 두뇌의가에 다른 시 약.

서문

현대 연구의 구조와 뇌의 기능 일반적으로 신경 세포에 특정 유전자의 유전자 조작이 필요합니다. 다른 유전자, 돌연변이 체 대립 유전자를 포함 하 여 운반 하는 유전자 변형 마우스의 기능을 녹아웃와 대립 노크에서 정기적으로 생성. Stereotaxic 뇌 수술 성인 설치류에 대 한 로컬 설치류 두뇌^1,2의 특정 지역에 약물, 바이러스, 추적기 및 다른 시 약을 제공 하는 표준 방법입니다. 유전자 변형 마우스 stereotaxic 뇌 수술을 적용 한 유전자 조작 유전자 기능과 마우스 뇌의 특정 신경 인구에 신경 활동을 허용 합니다. 셀 형식 관련 조작 두뇌^3,,45의 복잡 한 신경 회로에 신경 기능을 해독 하는 강력한 접근 방식을 제공 합니다.

신 경계의 신경 개발 초기 배아 단계에서 시작 하 고 개발 프로세스 청소년 기간까지 출산 후 계속. 신경 시스템의 출생 후 성숙 뇌⁶의 생리 및 인지 기능을 위한 필수적인 신경 회로의 정확한 시 냅 스 배선 포함 되어 있습니다. 따라서, 신생아 시간 윈도우에서 발생 하는 개발 이벤트를 공부 뿐만 아니라 정상적인 신경 발달을 이해 하는 데 중요 하지만 neurodevelopmental과^{7 정신병 무질서의 병 인에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. ,8}. 성인 설치류 stereotaxic 뇌 수술의 방법으로는 쉽게 사용할 수 있는^2,9, 비록 몇 가지 프로토콜 신생아 쥐^10,11stereotaxic 뇌 수술에 대 한 인터넷에서 사용할 수 있습니다. 사실, 신생아 마우스 새끼의 두뇌에 약의 stereotaxic microinjections는 어렵다, 신생아 강아지의 머리는 너무 연약한 표준 stereotaxic 장치에 고정 하기 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 유전자 변형 마우스 stereotaxic 뇌 수술의 응용 프로그램은 신생아 쥐¹²가능 합니다. 여기, 우리가 만든 설치 신생아 마우스 새끼 stereotaxic 뇌 수술을 수행 하는 간단한 방법 설명. 이 기술은 허용 하나 조건부로 AAV 표현 Cre DNA recombinase 기자 진 마우스와 조건에 따라 floxed 유전자 변형 쥐가 microinjecting floxed 유전자 삭제를 보여 줍니다. 이 기술은 또한 야생-타입 마우스의 신생아가에 시 약을 제공에 적용 됩니다.

프로토콜

여기에 설명 된 동물 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회의 국립 양 밍 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 신생아 강아지 Stereotaxic 장치에 대 한 소유자의 준비

1. 머리 트레이 만들기: 1.5 mL 원심 분리기 튜브 (길이 15 m m)의 하단 튜브의 벽의 1/5를 제거 하 여 신생아 강아지의 머리에 맞는 모양으로 잘라.
2. 피 펫 팁 상자 stereotaxic 기구의 받침대와 맞는 적당 한 크기와 고 상단 덮개를 제거. 머리 트레이 단계 1.1 및 뜨거운 용 해 접착제로 팁 쟁반의 기지에 조직 포함 카세트에 부착 조직 포함 카세트의 높이 7 m m, 머리 고정 위치에서 강아지의 목과 시체를 지 원하는 데 사용 되는입니다.
3. 표준 stereotaxic 장치에 전체 설치를 넣습니다.

2. 30 G 주입 스테인리스 바늘의 준비

1. 전 3 일 동안 클로 프롬에서 그들을 몸을 담글 하 여 30 G 주사기 바늘을 청소.
2. 집게를 사용 하 여 신중 하 고 천천히 당겨 바늘 화학 후드에서 폴 리 프로필 렌 그것의 허브에서.
3. 20 분 50 rpm에서 통에 70% 에탄올 린스 3 × 10 분 뒤 절대 에탄올과 바늘을 씻어. 사용까지 바늘 공기 건조, 그리고 청소 바늘 실 온 (RT)에서 깨끗 한 상자에서 저장을 하자.

3. Microinjection 튜브 어댑터 준비

1. PE10 폴 리 에틸렌 튜브 (PE10 튜브) 30g 주사 바늘에 microliter 주사기를 연결 합니다. 브리징 microliter 주사기와 주사 바늘에 대 한 PE20 폴 리 에틸렌 튜브 (PE20 튜브) 어댑터를 준비 합니다. 어댑터의 사용 때문에 필요, PE10 튜브의 직경 26 G microliter 주사기의 바늘의 그것 보다 훨씬 작습니다.
2. Microliter 주사기에 대 한 튜브를 준비: PE20 튜브 5 cm와 미리 청소 30g 주사 바늘을 연결 하 고 인스턴트 접착제로 접합 인감. 이 튜브 어댑터는 재사용 가능한.
   참고: microinjection 주사기의 바늘 30 G 이면 준비 (3.1 단계) 및이 어댑터의 사용 (단계 3.3) 필요 하지 않습니다.
3. Microliter 주사기 (10 µ L) (3.1 단계에서 준비) 튜브 어댑터를 연결 합니다.
4. PE20 튜브 어댑터의 30 G 바늘에 (더 이상 60 cm) PE10 튜브의 한쪽 끝을 연결 합니다. PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 새로운 30 G의 주사 바늘을 탑재 합니다.

4. 부하 압력가 증류수, 염료와 바이러스 Microinjection 튜브

1. Microliter 주사기의 플런저를 제거 합니다. 25 G 주사기를 사용 하 여 로드 microliter 주사기 및 압력가 증류수는 배관에서 공기를 제거 하는 연결 된 PE 튜브.
2. 플런저 microliter 주사기를 다시 놓고 배럴에 증류수 남아 2 µ L까지 플런저를 밀어. 양의 증류수 2 µ L 보다 낮은 되 게 하지 마십시오.
3. 신중 하 게 마이크로 흐름 속도 주사기 펌프에 microliter 주사기를 탑재 합니다.
4. 적은 양의 0.1% 빠른 녹색 염료 (0.9% 식 염 수에 준비와 0.22 μ m 필터 필터링)와 parafilm 조각에 바이러스 액체 플라스틱
5. Microinjection 튜브에 체액의 흐름을 테스트 하려면 30 G 주입 바늘과 튜브에 필터링 된 빠른 그린의 0.7 µ L을 로드 하 여 다음 PE10 튜브 사이 공기 방울이 볼 수 있도록 공기의 작은 금액을 철회 한다.
6. 또 다른 작은 양의 바이러스 액체 microinjection 튜브에 로드 하 여 다음 두 번째 공기 거품을 만들기 위해 공기를 철회 한다.
7. 연결 하 고 30 G microinjection 바늘 stereotaxic 기구의 팔을 확보.

5입니다. 저체온증에 의해 신생아 쥐의 마 취

1. 라텍스 장갑 소매에 강아지를 놓고 5 분 목까지 얼음에 몰두 합니다.
2. 되도록 그의 철수 응답 집게로 강아지의 발을 꼬집어.
3. 라텍스 장갑 소매와 강아지를 머리 트레이에 놓고 저 체온 마 취에 대 한 차가운 유지에 라텍스 슬리브 주위 일부 얼음을 넣어.
4. 가능 하면 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 강아지의 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.

6입니다. microinjection

1. 70% 에탄올으로 깨끗이 stereotaxic 악기를 닦아 하 여 불 임 수술을 준비 합니다. 70% 에탄올에 그들을 immersing 하 여 외과 기구를 소독.
2. 70% 에탄올과 강아지의 머리를 제거 하십시오. 두개골에 랜드마크 람다를 찾아서 람다 마커 펜으로 표시 합니다. 람다에 바늘 끝을 조 준 하 고 0으로 이전 후부 (AP) 및 중간 옆 (ML) 좌표를 설정 합니다.
3. 대상 사이트의 대상 사이트의 X 및 Y 좌표에 따라 주입 팔을 이동 합니다. 출생 후 하루 (P) 2의가 대 한 강아지, 좌표는: AP, 람다; 앞쪽 +2.4 m m ML, ± 1.0 mm; 중간에서 측면 등-복 부 (DV), 두개골에서 −1.7 m m. 펜으로 PE10 관에서 빠른 녹색 염료의 위치를 표시 합니다.
4. 30g 주사 바늘 아래로 천천히 두개골, 피부를 통해 침투 하 가져오고 두개골의 표면에서 멈출 때까지 다음 바늘 팁을가지고. 0으로 DV 좌표를 설정 합니다.
5. 내릴 30 G 주입 바늘 천천히 대상 사이트의 DV 좌표에 도달할 때까지. 실질 정상적인 모양을 다시 시작 수 있도록 1 분 기다립니다. Microinjection 프로그램 (100 nL/min)를 실행 합니다.
6. 빠른 녹색 염료의 마크는 바이러스 액체 두뇌에 주입 되도록 PE 튜브에 움직이는 다는 것을 확인 하십시오.
7. Microinjection, 종료 후 1 분 동안 대기 그리고 다음 천천히 그리고 점진적으로 30 DV 깊이의 1/2 높이에 바늘을가지고 s. 30 후 s, 천천히 강아지의 머리에서 바늘을 철회.
8. 모든 타겟된 사이트의 microinjections는 완료 될 때까지 단계 6.2 6.7를 반복 합니다.

7. 강아지의 포스트 외과 복구

1. 33 ° C 배양 기에 20 분 동안 강아지를 따뜻한. 강아지 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 저 체온 마 취 매 5 분에서에서 강아지의 복구를 확인 하십시오.
2. 강아지는 완 치 후에을 다시 강아지를 반환 합니다.

결과

실험의 첫 번째 집합에 대 한 우리 200 microinjected AAV9.hSynapsin.HI.eGFP Cre.WPRE.SV40 바이러스 (AAV-eGFP-Cre, Dulbecco의 버퍼링 인산 염 분에 1/10 희석) Cre DNA recombinase 표현의 nL Ai14 쥐의 P2가 GFP 융합. Ai14 마우스 loxP 형벌 (floxed) 정지 카세트 (그림 2F)의 Cre 중재 삭제 시 tdTomato 취재 원 유전자를 표현 한다. 두뇌는 GFP와 tdTomato의 immunostaining에 대 한 P14에서 수확 했다. ...

토론

현재 연구에서 신생아 마우스 두뇌가 AAV 바이러스 주입에 대 한 간단 하 고 안정적인 stereotaxic 방법을 보여 줍니다. 우리는 p 2에서 Ai14 기자 쥐가 AAV eGFP Cre 바이러스 microinjected 하 고 P14에서 리포터 유전자 발현 분석. 우리는 AAV 불리고 GFP-긍정적인 세포가 rostrocaudal 수준에 걸쳐 발견. 또한, 거의 모든 GFP-긍정적인 세포 공동 tdTomato 기자 유전자 striatal 셀에 제안 하는 성공적인 Cre loxP DNA 재조합 AAV 중...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson	REF 305106
Chloroform	JT Baker	9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe	Hamilton	80300	30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20	Becton Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton Dickinson	427401
Micro Flow Rate Syringe Pump	Longer Precision Pump Co.	TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe	Becton Dickinson	REF 302105
Fast green	Sigma-Aldrich	F-7252	0.1%
Standard Stereotaxic Instruments	RWD Life Science	68037	Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody	Abcam	ab16046	Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody	Abcam	ab65856	Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope	Olympus	BX63
LSM 880 confocal microscope	Zeiss	LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594	Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.	111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-9-PV1848	Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP	AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan	N/A	1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Labtorary	007914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ	The Jackson Labtorary	026259	Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Corning cellgro	21-030-CVR