Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole de chirurgie stéréotaxique avec un dispositif de tête-correction faite maison pour microinjecting réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Cette technique permet des manipulations génétiques dans les cellules neuronales de régions précises du cerveau de souris néonatales.

Résumé

Plusieurs gènes sont exprimés dans le cerveau embryonnaire, et certains d'entre eux s’expriment en permanence dans le cerveau après la naissance. Pour ces gènes avec persistance, ils peuvent fonctionner pour réglementer le processus de développement et/ou de la fonction physiologique dans le cerveau néonatal. Pour étudier les fonctions neurobiologiques de gènes spécifiques dans le cerveau, il est essentiel pour inactiver les gènes dans le cerveau. Nous décrivons ici une simple méthode stéréotaxique pour inactiver l’expression des gènes dans le striatum des souris transgéniques à des fenêtres temporelles néonatale. Les virus AAV-eGFP-Cre ont été micro dans le striatum de souris de gène pour le journaliste Ai14 jours après la naissance (P) 2 par chirurgie stéréotaxique cérébrale. L’expression du gène rapporteur tdTomato a été détectée dans le striatum P14, suggérant une Cre-loxP réussie médiée par recombinaison de l’ADN dans les cellules transduites AAV striatal. Plus loin, nous avons validé cette technique par microinjecting virus AAV-eGFP-Cre en souris P2Foxp2^fl/fl . Double marquage de GFP et Foxp2, a montré que les cellules positives GFP manquaient immunoréactivité Foxp2 dans le striatum P9, suggérant la perte de Foxp2 protéine dans les cellules striatal AAV-eGFP-Cre transduite. Globalement, ces résultats démontrent une délétion génétique efficace par les virus AAV-eGFP-Cre stereotaxically micro-injection dans certaines populations neuronales dans le cerveau néonatal de souris transgéniques floxed. En conclusion, notre technique stéréotaxique fournit une plate-forme facile et simple pour des manipulations génétiques dans les cerveaux de souris néonatales. La technique peut non seulement être utilisée pour supprimer les gènes dans des régions précises du cerveau néonatal, mais il peut également être utilisé pour s’injectent des drogues pharmacologiques, traceurs neuronales, optogenetics génétiquement modifiés et chemogenetics des protéines, des indicateurs de l’activité neuronale et les autres réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales.

Introduction

Les études modernes sur la structure et la fonction du cerveau exigent habituellement une manipulation génétique de gènes spécifiques dans les cellules neuronales. Pour sonder les fonctions des différents gènes, les souris transgéniques porteuses d’allèles mutants, y compris la knockout et knock-in allèles ont été systématiquement générés. Chirurgie du cerveau stéréotaxique pour rongeurs adultes est une méthode standard pour offrir localement des médicaments, des virus, des traceurs et des autres réactifs à des régions spécifiques du cerveau rongeurs^1,2. Appliquant la chirurgie stéréotaxique de cerveau de souris transgéniques permet de manipuler génétiquement la fonction et l’activité neuronale dans certaines populations neuronales du cerveau de souris. La manipulation spécifique au type de cellule fournit une approche puissante pour déchiffrer les fonctions neuronales dans les circuits neurones complexes du cerveau^3,4,5.

Développement neurologique du système nerveux débute aux premiers stades embryonnaires, et les processus de développement continuent après la naissance jusqu'à la période juvénile. La maturation postnatale du système nerveux incluant le câblage synaptique précis des circuits neuraux, qui est essentiel pour les fonctions physiologiques et cognitives du cerveau⁶. Par conséquent, étudier des événements développementaux qui se produisent dans des fenêtres temporelles néonatale est important non seulement pour comprendre le développement neural normal, mais il peut aussi donner un aperçu de la pathogenèse du développement neurologique et maladies neuropsychiatriques^{7 ,},⁸. Bien que les méthodes de chirurgie stéréotaxique cérébrale pour rongeurs adultes sont facilement disponibles^2,9, quelques protocoles sont disponibles sur l’internet pour la chirurgie stéréotaxique cerveau souris néonatales^10,11. En fait, des microinjections stéréotaxiques de réactifs dans le cerveau des souriceaux nouveau-nés sont difficiles, car la tête du chiot nouveau-né est trop fragile pour être fixé à l’appareil stéréotaxique standard. Néanmoins, l’application de la chirurgie stéréotaxique cerveau de souris transgéniques est faisable pour souris néonatales¹². Nous décrivons ici une méthode simple avec l’installation de maison à effectuer une chirurgie stéréotaxique cerveau dans des souriceaux nouveau-nés. Nous démontrons que cette technique permet de supprimer sous condition floxed gènes par microinjecting recombinase exprimant l’AAV Cre ADN dans le striatum de souris de gène de journaliste et conditionnellement floxed souris transgéniques. Cette technique est également applicable pour livrer des réactifs dans le striatum neonatal de souris de type sauvage.

Protocole

Les protocoles animaux décrits ici ont été approuvés par l’utilisation comités d’Université nationale de Yang-Ming et animalier.

1. préparation du titulaire pour les chiots nouveau-nés dans l’appareil stéréotaxique

1. Faire le plateau de tête : couper le fond d’un tube de centrifugation de 1,5 mL (15 mm de long) dans la forme qui correspond à la tête des ratons nouveau-nés en enlevant 1/5 de la paroi du tube.
2. Prendre une boîte de pointe de pipette avec la bonne taille qui s’inscrit dans le socle de l’appareil stéréotaxique et retirer le couvercle supérieur. Fixer le plateau tête préparé à l’étape 1.1 et une cassette d’incorporation de tissu sur la base du plateau de pointe avec de la colle à chaud-fonte. La hauteur de la cassette d’encastrement tissu est de 7 mm, qui sert à soutenir le cou et le corps du chiot en position fixe à la tête.
3. Mettre l’installation entière dans un appareil stéréotaxique standard.

2. préparation des aiguilles en acier inoxydable à Injection 30G

1. Nettoyage préalable des aiguilles de seringue 30 G en les trempant dans du chloroforme pendant 3 jours.
2. Utiliser forceps prudemment et lentement sortir l’aiguille de son hub de polypropylène sous une hotte chimique.
3. Laver les aiguilles avec de l’éthanol absolu pendant 20 min, suivie de rinçages éthanol 70 % pour 3 x 10 min sur un agitateur à 50 tr/min. Laisser l’air aiguilles sécher et mettre les aiguilles nettoyés dans une boîte propre à température ambiante (RT) jusqu'à utilisation.

3. Préparez un adaptateur pour les tuyaux de Microinjection

1. Connecter la seringue microlitre d’une aiguille d’injection de 30G avec un tube de polyéthylène PE10 (PE10 tube). Préparer un adaptateur de tube (tube PE20) de polyéthylène PE20 pour combler l’aiguille d’injection et la seringue de microlitre. L’utilisation de l’adaptateur est nécessaire, car le diamètre du tube PE10 est beaucoup plus petit que celle de l’aiguille de la seringue de microlitre de 26G.
2. Préparer le tube de la seringue de microlitre : connecter l’aiguille d’injection de 30 G préalablement nettoyé avec 5 cm de tube PE20 et sceller la jonction avec la colle instantanée. Cet adaptateur de tube est réutilisable.
   Remarque : Si l’aiguille de la seringue de microinjection est 30G, la préparation (étape 3.1) et l’utilisation (étape 3.3) de cet adaptateur n’est pas nécessaire.
3. Branchez l’adaptateur de tuyau (préparé à l’étape 3.1) avec une seringue de microlitre (10 µL).
4. Branchez une extrémité du tube PE10 (pas plu de 60 cm) sur l’aiguille de 30G de l’adaptateur de tuyau PE20. Monter une nouvelle aiguille d’injection de 30G à l’autre extrémité du tube PE10.

4. Chargez le Tube de Microinjection avec eau distillée autoclavé, colorant et virus

1. Retirer le piston de la seringue de microlitre. Utiliser une seringue de 25G pour charger la seringue microlitre et son tube PE connecté avec de l’eau distillée autoclavé pour chasser l’air du circuit respiratoire.
2. Placer le piston vers la seringue microlitre et pousser le piston jusqu'à 2 µL de résidus d’eau distillée dans le Canon. Ne laissez pas le volume d’eau distillée devenir inférieure à 2 µL.
3. Monter soigneusement la seringue de microlitre sur le pousse-seringue flux micro taux.
4. Distribuer de petites quantités de colorant vert rapide de 0,1 % (préparé en solution saline à 0,9 % et filtrée avec 0,22 µm filtre) et les liquides de virus à un morceau de parafilm.
5. Retirer une petite quantité d’air pour faire une bulle d’air visible à la jonction entre l’aiguille d’injection de 30G et tube PE10 suivie de chargement 0.7 µL de vert rapide filtré dans le tube pour tester l’écoulement des fluides dans les tubes de microinjection.
6. Retirer une autre petite quantité d’air pour faire une deuxième bulle d’air puis en chargeant les liquides de virus dans le tube de microinjection.
7. Fixez et fixez l’aiguille 30G de microinjection au bras de l’appareil stéréotaxique.

5. anesthésie de souris néonatales par hypothermie

1. Placez le chiot dans un manchon de gant en latex et l’immerger dans de la glace pilée jusqu’au cou pendant 5 min.
2. Pincer les pieds le chiot avec une pince pour ne s’assurer aucune réponse de retrait de ses pieds.
3. Placez le chiot avec manchon de gant en latex dans le bac principal et mettre la glace concassée dans le manchon de latex pour le maintenir froid pour l’anesthésiologie en hypothermie.
4. Pommade de vétérinaire sur les yeux du pup pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie si possible.

6. microinjection

1. Préparer une chirurgie stérile en essuyant l’instrument stéréotaxique soigneusement avec l’éthanol à 70 %. Stériliser l’instrument chirurgical en l’immergeant dans l’éthanol à 70 %.
2. Frotter la tête du chiot avec l’éthanol à 70 %. Localiser le lambda de point de repère sur le crâne et marquez le lambda avec un marqueur. Viser la pointe de l’aiguille pour le lambda et l’antéro-postérieur (AP) et les coordonnées de medial-latérale (ML) comme zéro.
3. Déplacez le bras d’injection vers le site cible selon les coordonnées X et Y de l’emplacement de la cible. Pour le striatum de jour après la naissance (P) 2 chiots, les coordonnées sont : AP, +2,4 mm devant le lambda ; ML, ± 1,0 mm latéral de la ligne médiane ; dorsale-ventral (DV), −1, 7 mm sur le crâne. Marquez la position en PE10 tube de colorant vert rapide avec un stylo.
4. Faire baisser l’aiguille d’injection de 30G lentement à traverser la peau et le crâne et ensuite mettre en place la pointe de l’aiguille jusqu'à ce qu’il s’arrête à la surface du crâne. Définir la coordonnée DV comme zéro.
5. Faire baisser l’aiguille d’injection de 30G lentement jusqu'à ce qu’il atteigne la coordonnée DV du site cible. Attendre 1 min permettre le parenchyme reprendre sa forme normale. Exécutez le programme de microinjection (100 nL/min).
6. Assurez-vous que la marque de colorant vert rapide se déplace dans le tube PE afin de s’assurer que le liquide de virus est injecté dans le cerveau.
7. Attendre 1 min après la cessation de la microinjection et ensuite lentement et progressivement mettre en place l’aiguille à hauteur de 1/2 de profondeur DV dans les 30 s. Après 30 s, retirer doucement l’aiguille de la tête du chiot.
8. Répétez l’étape 6.2 à 6.7 jusqu'à ce que les microinjections de tous les sites visés sont terminées.

7. après une chirurgie récupération du chiot

1. Réchauffer le chiot pendant 20 min dans un incubateur à 33 ° C. Vérifier la récupération du chiot de l’anesthésie de l’hypothermie toutes les 5 min jusqu'à ce que le chiot a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
2. Retourner le chiot vers le barrage après que le chiot est complètement rétabli.

Résultats

Pour la première série d’expérience, nous micro 200 nL des AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, dilution au 1/10 dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) qui expriment la recombinase Cre ADN fusionnées avec GFP P2 striatum de souris Ai14. Les souris Ai14 expriment le gène rapporteur tdTomato à Cre-mediated suppression des flancs loxP (floxed) STOP cassette (Figure 2F). Les cerveaux ont été récoltés à P14 ...

Discussion

Dans la présente étude, nous démontrons une méthode stéréotaxique simple et fiable permettant d’injecter les virus AAV dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Nous micro virus AAV-eGFP-Cre dans le striatum de souris journaliste Ai14 à P2 et ensuite analysé l’expression du gène rapporteur à P14. Nous avons trouvé QU'AAV transduites cellules GFP-positives dans le striatum Rostro niveaux. En outre, presque toutes les cellules de GFP-positives expriment conjointement le gène rapporteur de tdTomato...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson	REF 305106
Chloroform	JT Baker	9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe	Hamilton	80300	30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20	Becton Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton Dickinson	427401
Micro Flow Rate Syringe Pump	Longer Precision Pump Co.	TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe	Becton Dickinson	REF 302105
Fast green	Sigma-Aldrich	F-7252	0.1%
Standard Stereotaxic Instruments	RWD Life Science	68037	Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody	Abcam	ab16046	Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody	Abcam	ab65856	Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope	Olympus	BX63
LSM 880 confocal microscope	Zeiss	LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594	Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.	111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-9-PV1848	Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP	AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan	N/A	1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Labtorary	007914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ	The Jackson Labtorary	026259	Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Corning cellgro	21-030-CVR