Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal

Resumen

Se describe un protocolo de cirugía estereotáctica con un dispositivo casero hecho de cabeza fija de reactivos microinjecting en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Esta técnica permite la manipulación genética en las células neuronales de regiones específicas del cerebro de ratón neonatal.

Resumen

Muchos genes se expresan en el cerebro embrionario y algunos de ellos se expresan continuamente en el cerebro después del nacimiento. Para tales genes persistentemente expresadas, pueden funcionan para regular el proceso de desarrollo o función fisiológica en el cerebro neonatal. Para investigar las funciones neurobiológicas de genes específicos en el cerebro, es esencial para desactivar genes en el cerebro. Aquí, describimos un método simple de estereotáctica para inactivar genes en el cuerpo estriado de los ratones transgénicos en ventanas de tiempo neonatal. AAV-eGFP-Cre virus fueron microinyectados en el estriado de los ratones de gen reportero Ai14 en día postnatal (P) 2 de cirugía estereotáctica cerebral. La expresión del gen reportero tdTomato fue detectada en P14 estriado, sugiriendo un éxito Cre-loxP mediada por recombinación de ADN en las células AAV-transduced estriada. Más validamos esta técnica por microinjecting virus AAV-eGFP-Cre en ratones P2Foxp2^fl/fl . Etiquetado doble de GFP y Foxp2 demostró que las células GFP-positivas carecían de Foxp2 immunoreactivity en P9 estriado, lo que sugiere la pérdida de la proteína Foxp2 en AAV-eGFP-Cre transduced estriado células. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran una canceladura genética efectiva por los virus de AAV-eGFP-Cre stereotaxically microinyectados en poblaciones neuronales específicas en el cerebro neonatal de ratones transgénicos floxed. En conclusión, nuestra técnica estereotáctica proporciona una plataforma fácil y simple para la manipulación genética en el cerebro de ratón neonatal. La técnica no sólo permite eliminar genes en regiones específicas del cerebro neonatal, pero también puede ser utilizado para inyectar drogas farmacológicas, trazadores neuronales, optogenetics genéticamente modificados y chemogenetics proteínas, indicadores de la actividad neuronal y otros reactivos en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal.

Introducción

Los estudios modernos de la estructura y función del cerebro requieren manipulación genética de genes específicos en células neuronales. Para probar las funciones de diferentes genes, ratones transgénicos con alelos del mutante, incluyendo nocaut y knock-in alelos se han generado habitualmente. Neurocirugía estereotáctica para roedores adultos es un método estándar para entregar localmente los medicamentos, virus, marcadores y otros reactivos a regiones específicas del cerebro de roedores^1,2. Aplicación de la cirugía estereotáctica cerebral en ratones transgénicos permite manipular genéticamente las funciones de los genes y la actividad neuronal en poblaciones neuronales específicas del cerebro del ratón. La manipulación de tipo específico de célula proporciona un enfoque poderoso para descifrar las funciones neuronales en complejos circuitos neuronales del cerebro^3,4,5.

Desarrollo neuronal del sistema nervioso comienza en las primeras etapas embrionarias, y continúan con los procesos de desarrollo después del nacimiento hasta el periodo juvenil. Maduración postnatal del sistema nervioso incluye el cableado sináptico precisa de circuitos neurales, que es esencial para las funciones fisiológicas y cognitivas del cerebro⁶. Por lo tanto, estudiar eventos del desarrollo que ocurren en tiempo neonatal es importante no sólo para comprender el desarrollo neural normal, pero también puede proporcionar penetraciones en la patogenesia de Neurodesarrollo y trastornos neuropsiquiátricos^{7 ,8}. Aunque los métodos de cirugía estereotáctica cerebral de roedores adultos son fácilmente disponibles^2,9, algunos protocolos están disponibles en internet para cirugía estereotáctica cerebral en ratones neonatales^10,11. De hecho, microinyecciones estereotáxicas de reactivos en el cerebro de crías de ratón neonatal son difíciles, porque la cabeza del cachorro neonatal es demasiado frágil para ser fijado en el aparato estándar estereotáxicas. Sin embargo, la aplicación de cirugía estereotáctica cerebral en ratones transgénicos es factible para ratones neonatales¹². Aquí, describimos un método simple con una instalación casera para realizar cirugía estereotáctica cerebral en crías de ratón recién nacido. Nos demuestran que esta técnica permite eliminar condicional floxed genes microinjecting recombinase de AAV-expresión Cre ADN en el cuerpo estriado de reportero gene ratones y condicional de ratones transgénicos floxed. Esta técnica también es aplicable para entregar los reactivos en el neonatal estriado de los ratones de tipo salvaje.

Protocolo

Los protocolos animal aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso comités Universidad Nacional de Yang Ming.

1. preparación del titular de los cachorros neonatales en el aparato estereotáctica

1. Hacer la bandeja principal: cortar la parte inferior de un tubo de centrífuga de 1.5 mL (15 mm de largo) en la forma que se adapta a la cabeza de los cachorros neonatales quitando 1/5 de la pared del tubo.
2. Tomar una caja de punta de pipeta con el tamaño correcto que encaja con el pedestal del aparato estereotáxicas y quite la cubierta superior. Pegue la cabeza bandeja preparada en el paso 1.1 y un cassette inclusión de tejido sobre la base de punta de bandeja con el pegamento de fusión en caliente. La altura del cassette inclusión de tejido es 7 m m, que se utiliza para apoyar el cuello y el cuerpo del cachorro en la posición fija de la cabeza.
3. Lugar la configuración todo en un aparato estándar estereotáxicas.

2. preparación de agujas de acero inoxidable de inyección de 30G

1. Limpieza previa de agujas de jeringa de 30 G por sumergiéndolas en cloroformo durante 3 días.
2. Utilice pinzas para lenta y cuidadosamente saque la aguja desde el hub de polipropileno en una campana química.
3. Lavar las agujas con etanol absoluto por 20 min seguido por enjuagues de etanol 70% por 3 × 10 min en un agitador a 50 rpm. Airee el agujas secas y almacenar las agujas limpias en una caja limpia a temperatura ambiente (RT) hasta su uso.

3. prepare un adaptador para tubos de microinyección

1. Conecte la jeringa microliter una aguja 30G con un PE10 polietileno tubo (PE10). Preparar un adaptador de tubo (tubo PE20) PE20 polietileno para tender un puente sobre la aguja y la jeringa microliter. El uso del adaptador es necesario, porque el diámetro del tubo PE10 es mucho más pequeño que el de la aguja de la jeringa microliter de 26G.
2. Preparar el tubo de la jeringa microliter: Conecte la aguja 30 G previamente limpiado con 5 cm de tubo PE20 y sellar la Unión con pegamento instantáneo. Este adaptador de tubería es reutilizable.
   Nota: Si la aguja de la jeringa de microinyección es 30G, la preparación (paso 3.1) y (paso 3.3) el uso de este adaptador no es necesario.
3. Conecte el adaptador de tubo (preparado en el paso 3.1) con una jeringa microliter (10 μl).
4. Conecte un extremo del PE10 el tubo (no más de 60 cm) en la aguja de 30G del adaptador de tubo PE20. Monte una nueva aguja 30G en el otro extremo del tubo PE10.

4. Cargue el tubo de la microinyección con virus, colorante y agua destilada esterilizada

1. Retire el émbolo de la jeringa microliter. Utilizar una jeringa de 25G para cargar la jeringa microliter y su tubo de PE conectado con agua destilada esterilizada para remover el aire de la tubería.
2. Coloque el émbolo de la jeringa microliter y empuje el émbolo hasta 2 μl de agua destilada se queda en el barril. No deje que el volumen de ser inferior a 2 μl de agua destilada.
3. Montar con cuidado la jeringa microliter en la bomba de jeringa de tasa de flujo micro.
4. Pipeta de pequeñas cantidades de tinte de 0,1% de verde rápido (preparado en solución salina 0.9% y filtrar con filtro de 0.22 μm) y los líquidos de virus a un trozo de parafilm.
5. Retirar una pequeña cantidad de aire para hacer una burbuja de aire visible en el cruce entre la aguja 30G y tubo PE10 seguido de carga 0,7 μl del filtrado verde rápido en el tubo para probar el flujo de fluidos en la tubería de microinyección.
6. Retirar otra pequeña cantidad de aire para hacer una segunda burbuja de aire seguida por la carga de los líquidos de virus en el tubo de microinyección.
7. Coloque y fije la aguja de 30G microinyección en el brazo del aparato estereotáxicas.

5. anestesia de ratones neonatales por hipotermia

1. Colocar el cachorro en una manga de guante de látex y sumergirlo en hielo hasta el cuello durante 5 minutos.
2. El sujetador de pies de cría con pinzas para asegurarse de que no hay respuesta de retirada de sus pies.
3. Pon el cachorro con la manga del guante de látex en la bandeja principal y algunos hielo picado alrededor de la manga de látex para mantener fría para la anestesia de la hipotermia.
4. Aplique ungüento veterinario en los ojos del cachorro para prevenir sequedad mientras que bajo anestesia si es posible.

6. microinyección

1. Preparan cirugía estéril frotando el instrumento estereotáxicas con etanol al 70%. Esterilizar el instrumental quirúrgico por inmersión en etanol al 70%.
2. Frote la cabeza del cachorro con etanol al 70%. Ubicar el lambda de la señal en el cráneo y la lambda de la marca con un rotulador. Apunte la punta de la aguja a la lambda y fijar el antero-posterior (AP) y medial-lateral (ML) coordenadas como cero.
3. Mueva el brazo de inyección al sitio de destino según las coordenadas X e Y del sitio de destino. Para el estriado de día postnatal (P) 2 crías, las coordenadas son: AP, +2,4 mm anterior a la lambda; ML, ±1. 0 mm lateral de la línea media; dorsal-ventral (DV), mm −1.7 del cráneo. Marque la posición de tinte verde rápido en PE10 tubo con una pluma.
4. Bajar la aguja 30G lentamente a penetrar a través de la piel y el cráneo y luego traer hasta la punta de la aguja hasta que se detenga en la superficie del cráneo. Establecer la coordenada DV como cero.
5. Haga descender la aguja 30G lentamente hasta llegar a la coordenada de la DV del sitio de destino. Espere 1 minuto permitir que el parénquima reasumir su forma normal. Ejecute el programa de la microinyección (100 nL/min).
6. Asegúrese de que la marca de tinte verde rápido se está moviendo en el tubo de PE para que el líquido del virus es inyectado en el cerebro.
7. Esperar 1 minuto después de la terminación de la microinyección y luego lenta y progresivamente lleve la aguja a la altura del 1/2 de profundidad DV dentro de los 30 s. Después de 30 s, retirar lentamente la aguja de la cabeza del cachorro.
8. Repita el paso 6.2 a 6.7 hasta que se completen las microinyecciones de todos los sitios específicos.

7. post quirúrgico recuperación del cachorro

1. El cachorro por 20 min en una incubadora de 33 ° C de calentamiento. Comprobar la recuperación de la cría de la hipotermia anestesia cada 5 min hasta que el cachorro ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
2. Regresar el cachorro a la presa después de que el cachorro se recupera completamente.

Resultados

Para el primer conjunto del experimento, nos microinyectados 200 nL de AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, dilución 1/10 en tampón fosfato salino de Dulbecco) que expresan el recombinase de Cre DNA fundido con GFP en P2 estriado de los ratones Ai14. Los ratones Ai14 expresan el gen reportero de tdTomato sobre eliminación Cre-mediada del loxP flanqueado (floxed) cassette STOP (figura 2F). Los cerebros fueron cosechados en P14 de immuno...

Discusión

En el presente estudio, se demuestra un método simple y confiable estereotáctica para inyectar virus AAV en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Microinyectados virus AAV-eGFP-Cre en el estriado de los ratones de reportero Ai14 en P2 y luego analiza la expresión del gen reportero en P14. Encontramos que AAV transduced células GFP-positivas en el cuerpo estriado a nivel rostrocaudal. Por otra parte, casi todas las células GFP-positivas Co expresan el gen reportero tdTomato en células estriatales, lo qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G PrecisionGlide Needle	Becton Dickinson	REF 305106
Chloroform	JT Baker	9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe	Hamilton	80300	30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20	Becton Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton Dickinson	427401
Micro Flow Rate Syringe Pump	Longer Precision Pump Co.	TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe	Becton Dickinson	REF 302105
Fast green	Sigma-Aldrich	F-7252	0.1%
Standard Stereotaxic Instruments	RWD Life Science	68037	Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody	Abcam	ab16046	Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody	Abcam	ab65856	Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope	Olympus	BX63
LSM 880 confocal microscope	Zeiss	LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594	Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.	111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-9-PV1848	Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP	AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan	N/A	1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Labtorary	007914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ	The Jackson Labtorary	026259	Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Corning cellgro	21-030-CVR