JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz yenidoğan fare beyni striatum microinjecting reaktifler için ev yapımı bir baş-sabit aygıt ile bir protokol stereotaksik cerrahi açıklamak. Bu teknik, yenidoğan fare beyni, özel bölgelerin nöronal hücrelerin genetik manipülasyon sağlar.

Özet

Birçok genler embriyonik beyinlerinde ifade edilir ve bazıları sürekli doğumdan sonra beyinde ifade edilir. Israrla ifade böyle genler için gelişimsel süreci ve/veya neonatal beynindeki fizyolojik fonksiyon düzenlemek için çalışmayabilir. Beyindeki belirli genlerin nörobiyolojik işlevleri araştırmak için beyindeki genleri devre dışı bırakabilirsiniz esastır. Burada, striatum gen ifadesinde transgenik fareler yenidoğan zaman Windows devre dışı bırakabilirsiniz için basit bir stereotaksik yöntem açıklanmaktadır. AAV-eGFP-Cre virüs Ai14 muhabir gen fareler striatum Doğum sonrası gün (P) 2 stereotaksik beyin ameliyatı tarafından microinjected. TdTomato muhabir gen ekspresyonu P14 striatum, başarılı bir Cre-loxP DNA rekombinasyon AAV transduced striatal hücrelerdeki aracılı düşündüren tespit edildi. Daha fazla bu teknik AAV-eGFP-Cre virüs P2Foxp2fl/fl fareler microinjecting tarafından doğrulanmış. Çift etiketleme GFP ve Foxp2 GFP pozitif hücreler P9 striatum, AAV-eGFP-Cre transduced striatal hücrelerdeki Foxp2 protein kaybı düşündüren Foxp2 immunoreactivity yoksun gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar yenidoğan beynindeki belirli nöron popülasyonları floxed transgenik fareler Stereotaxic microinjected AAV-eGFP-Cre virüsler tarafından etkili bir genetik silme işlemini göstermektedir. Sonuç olarak, bizim stereotaksik tekniği yenidoğan fare beynindeki genetik manipülasyon için kolay ve basit bir platform sağlar. Bu teknik sadece genler, yenidoğan beyinlerinin belirli bölgelerde silmek için kullanılamaz, ancak farmakolojik ilaçlar, nöronal izleyiciler, genetiği değiştirilmiş optogenetics ve chemogenetics proteinler, nöronal aktivite göstergelerini enjekte etmek için de kullanılabilir ve diğer reaktifler striatum, yenidoğan fare beyinlerinin içine.

Giriş

Modern çalışmalar yapısı ve beyin fonksiyonu genellikle belirli genler nöronal hücrelerdeki genetik manipülasyon gerektirir. Farklı genler, transgenik fareler de dahil olmak üzere mutant gen taşıyan fonksiyonlar soruşturma için nakavt ve çakma allelleri düzenli olarak yeniden üretilmedi. Stereotaksik beyin ameliyatı yetişkin kemirgen için yerel olarak uyuşturucu, virüsler, izleyiciler ve diğer kimyasalları kemirgen beyin1,2özel bölgeler için teslim etmek için standart bir yöntemdir. Stereotaksik beyin ameliyatı transgenik fareler için uygulama bir genetik olarak gen fonksiyon ve fare beynin belirli nöron popülasyonları nöronal aktivite işlemek için izin verir. Hücre türüne özgü işleme karmaşık sinir devreleri beyin3,4,5nöronal işlevlerinde deşifre etmek için güçlü bir yaklaşım sağlar.

Sinir sisteminin sinirsel gelişme aşamalarında erken embriyonik başlar ve gelişim süreçleri Juvenil dönemine kadar doğumdan sonra devam edin. Postnatal olgunlaşma sinir sistemi beyin6fizyolojik ve bilişsel işlevler için temel sinir devreleri, hassas sinaptik kablolama içerir. Bu nedenle, yenidoğan zaman pencerelerde oluşan gelişimsel olaylarını eğitim sadece normal sinirsel gelişim anlamak için önemlidir, ancak de nörogelişimsel ve Nöropsikiyatrik bozukluklar7 patogenezinde anlayışlar sağlayabilir ,8. Stereotaksik beyin ameliyatı yöntemleri yetişkin kemirgen için hazır2,9, olmasına rağmen birkaç protokolleri stereotaksik beyin ameliyatı yenidoğan fareler10,11' deki yönergeleri için Internet üzerinde kullanılabilir. Yenidoğan yavru Başkanı standart stereotaksik aparatı düzeltilmesi için çok kırılgan olduğu için aslında, reaktifler stereotaksik microinjections yenidoğan fare pups beyinlerinin içine, zordur. Yine de, stereotaksik beyin ameliyatı uygulamaya transgenik farelerde neonatal fareler12için mümkün olabilir. Burada, yeni doğmuş fare pups içinde stereotaksik beyin ameliyatı gerçekleştirmek için ev yapımı bir kurulum ile basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik bir muhabir gen fareler ve koşullu olarak floxed transgenik fareler striatum AAV ifade Cre DNA recombinase microinjecting tarafından floxed genler koşullu olarak silmek izin verdiğini göstermektedir. Bu teknik aynı zamanda reaktifler vahşi tipi farelerin striatum yenidoğan sunmak için geçerlidir.

Protokol

Burada anlatılan hayvan iletişim kuralları hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Ulusal Yang Ming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. hazırlanması sahibi için yenidoğan Pups içinde stereotaksik aparatı

  1. Baş tepsi olun: 1/5 Tüp duvarı kaldırarak yenidoğan pups Başkanı uygun şekil 1.5 mL santrifüj tüpü (15 mm uzun) alt kesti.
  2. Stereotaksik aparatı Kaide ile uygun doğru boyutta bir pipet ucu kutusu ve üst kapağı sökün. Adım 1.1 ve doku gömme kaset ipucu tepsi sıcak-erime yapıştırıcı ile temeli üzerine hazırlanan baş tepsi yapıştırmayın. 7 mm, PUPs boyun ve gövde baş-sabit konumda desteklemek için kullanılan doku gömme kaset yüksekliğidir.
  3. Tüm kurulum bir standart stereotaksik aparatı yerleştirin.

2. 30G Enjeksiyon paslanmaz çelik iğneler hazırlanması

  1. 30 G şırınga iğneleri için 3 gün içinde kloroform ıslatarak önceden temiz.
  2. Forseps dikkatli ve yavaş bir kimyasal başlıklı Polipropilen hub üzerinden iğneyi çıkar için kullanın.
  3. Mutlak etanol iğnelerle bir shaker 50 RPM üzerinde % 70 etanol durular 3 × 10 dk ardından 20 dakika yıkayın. Kuru ve temiz bir kutu, oda sıcaklığında (RT) temizlenmiş iğneler depolamak iğneler hava kadar kullanmak izin.

3. bir bağdaştırıcı mikroenjeksiyon boruları hazırlayın

  1. Microliter şırınga 30 G Enjeksiyon iğne PE10 Polietilen boru (PE10 tüp) ile bağlayın. PE20 Polietilen boru (PE20 tüp) adaptör enjeksiyon iğne ve microliter şırınga köprülemesini için hazırlayın. PE10 tüp çapı 26 G microliter şırınga iğne daha küçük olduğu için adaptör kullanımı gereklidir.
  2. Microliter enjektör boruları hazırlayın: önceden temizlenmiş 30G Enjeksiyon iğne PE20 tüp ile 5 cm bağlanmak ve anlık tutkal ile birleşme mühür. Bu boru adaptörü yeniden kullanılabilir.
    Not: iğne mikroenjeksiyon şırınga 30 G ise, hazırlık (adım 3.1) ve bu adaptörü (adım 3.3) kullanımını gerekli değildir.
  3. (3.1 adımda hazırlanan) boru adaptörü microliter şırınga (10 µL) takın.
  4. PE10 (60 cm uzun) tüp PE20 boru adaptörü 30 G iğne üzerine bir ucunu bağlayın. Yeni 30 G Enjeksiyon iğne üzerine PE10 tüp diğer ucunu bağlayın.

4. yük Autoclaved distile su, boya ve virüsler ile mikroenjeksiyon tüp

  1. Microliter şırınga pistonu çıkarın. 25 G şırınga microliter şırınga ve onun bağlı PE boru boru gelen havayı çıkarmak için autoclaved distile su ile yüklemek için kullanın.
  2. Geri microliter şırınga fırlatıcıya yerleştirin ve pistonu 2 µL distile su kalır varil kadar itin. 2 µL düşük hale distile su hacmi izin vermeyin.
  3. Dikkatle microliter şırınga mikro akış hızı şırınga pompa üzerine monte.
  4. Küçük miktarlarda (% 0,9 serum içinde hazırlanan ve 0,22 µm filtre ile filtre) %0.1 hızlı yeşil boya ve bir parça parafilm virüs sıvı pipet.
  5. Az miktarda hava bir hava kabarcığı mikroenjeksiyon tüp sıvı akışını sınamak için 30 G Enjeksiyon iğne ve tüpün içine süzülmüş hızlı yeşil 0.7 µL yükleyerek takip PE10 tüp arasındaki kavşakta görünür yapmak için geri alıyorum.
  6. Mikroenjeksiyon boru içine virüs sıvılar yükleyerek ardından ikinci bir hava kabarcığı yapmak hava küçük bir miktar geri alıyorum.
  7. Takın ve 30 G mikroenjeksiyon iğne kolu stereotaksik aygıtının güvenli.

5. anestezi hipotermi tarafından yenidoğan farelerin

  1. Yavru bir lateks eldiven kol koyun ve 5 min için boyun kadar ezilmiş buz bırakın.
  2. Pups ayak forseps ile para çekme yanıt onun ayak emin olmak için çimdik.
  3. Lateks eldiven kol ile yavru baş tepsisine yerleştirin ve hipotermi anestezi için soğuk tutmak için lateks kol çevresinde bazı ezilmiş buz koyun.
  4. Veteriner merhem pups gözünü anestezi altında iken kuruluk mümkünse önlemek için geçerlidir.

6. mikroenjeksiyon

  1. Steril Cerrahi stereotaksik araç % 70 etanol ile iyice silerek hazırlayın. Cerrahi alet % 70 etanol çeker tarafından sterilize.
  2. Pups kafa % 70 etanol ile fırçalayın. Kafatasında Simgesel Yapı lambda bulun ve lambda marker kalemle işaretlemek. Lambda için iğne ucu amaç ve ön-arka (AP) ve medial-lateral (ML) koordinatları sıfır ayarlayın.
  3. Enjeksiyon kol hedef site X ve Y koordinatlarını göre hedef siteye taşımak. Doğum sonrası gün (P) 2 striatum için pups, Koordinatlar: AP, 2,4 mm anterior lambda; ML, ±1.0 mm orta hat yanal; dorsal-ventral (DV), kafatası mm'den −1.7. PE10 tüp hızlı yeşil boya bulunduğu bir kalemle işaretlemek.
  4. 30 G Enjeksiyon iğne yavaş yavaş deri ve kafatası nüfuz ve kafatası yüzeyde durana kadar iğne ucu kadar alın. DV konumu sıfır ayarlayın.
  5. Hedef site DV koordinatı ulaşıncaya kadar 30 G Enjeksiyon iğne yavaşça. Sürdürme normal şeklini parankimi izin vermek 1 dakika bekleyin. Mikroenjeksiyon çalıştırın (100 nL/dk).
  6. Hızlı yeşil boya işareti virüs sıvı beyne enjekte edilir emin olmak için PE tüp hareketli olduğundan emin olun.
  7. Mikroenjeksiyon fesih sonra 1 dakika bekleyin ve sonra yavaş yavaş ve aşamalı olarak iğneyi DV derinliği 30 içinde 1/2 yüksekliğine getirmek s. Sonra 30 s, yavaş yavaş iğne pups başından çekilme.
  8. Microinjections tüm hedeflenen sitelerin tamamlanıncaya kadar 6.2-6,7 adımları yineleyin.

7. ameliyat sonrası kurtarma yavru

  1. Yavru için 33 ° C kuluçka 20 dk kadar sıcak. Yavru fok sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine geldi kadar yavru fok kurtarma hipotermi anestezi her 5 dk dan kontrol edin.
  2. Yavru fok tamamen iyileşti sonra yavru fok baraja geri dönün.

Sonuçlar

Deney ilk kümesi için biz 200 microinjected nL Cre DNA recombinase hızlı AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virüs (AAV-eGFP-Cre, Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz 1/10 seyreltme) erimiş GFP ile Ai14 farelerin P2 striatum. Ai14 fareler tdTomato muhabir gen Cre-aracılı silme (floxed) loxP çevrili STOP kaset (2F rakam) üzerine hızlı. Beyin P14 GFP ve tdTomato immunostaining için hasat edildi. Birçok AAV GFP pozitif hücreler transduced hediye (

Tartışmalar

Bu da çalışmanın, yenidoğan fare beyni striatum AAV virüs enjekte için basit ve güvenilir stereotaksik yöntem gösterilmektedir. Biz P2, Ai14 muhabir farelerin striatum içine AAV-eGFP-Cre virüs microinjected ve muhabir gen ekspresyonu P14, analiz ettik. AAV GFP pozitif hücreler boyunca striatum, rostrocaudal düzeyde transduced bulduk. Ayrıca, neredeyse tüm GFP pozitif hücreler AAV aracılı ifade Cre faaliyet tarafından indüklenen başarılı bir Cre-loxP DNA rekombinasyon düşündüren tdTomato muhabi...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Bilim Bakanlığı tarafından desteklenen ve teknoloji MOST104-2311-B-010-010-MY3, verir MOST106-2321-B-010-012, Ulusal Sağlık araştırma enstitüleri NHRI-EX106-10429NI ve seçme alanlarda araştırma merkezi programı hibe verin Eğitim Bakanlığı aracılığıyla beyin Araştırma Merkezi, Ulusal Yang Ming Üniversitesi Tayvan, ve doktora sonrası bursu MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 ve MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.) verir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
30G PrecisionGlide NeedleBecton DickinsonREF 305106
ChloroformJT Baker9180-03
Hamilton MICROLITER SyringeHamilton 8030030G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20Becton Dickinson427406
Polyethylene tubing PE10Becton Dickinson427401
Micro Flow Rate Syringe PumpLonger Precision Pump Co.TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringeBecton DickinsonREF 302105
Fast greenSigma-AldrichF-72520.1%
Standard Stereotaxic InstrumentsRWD Life Science68037Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibodyAbcamab16046Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibodyAbcamab65856Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscopeOlympusBX63
LSM 880 confocal microscopeZeissLSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40Penn Vector CoreAV-9-PV1848Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFPAAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, TaiwanN/A1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JThe Jackson Labtorary 007914Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJThe Jackson Labtorary 026259Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered salineCorning cellgro21-030-CVR

Referanslar

  1. Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
  2. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
  4. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  5. Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
  6. Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
  7. Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
  8. Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
  9. Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
  10. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
  11. Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
  12. Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
  13. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  15. Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 137stereotaksik cerrahistriatumyenido an farelermikroenjeksiyonAAVCreloxPgen manip lasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır