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  • 摘要
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  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

本协议描述 caspase 分子荧光互补 (BiFC);一种基于图像的方法, 可用于可视化引发器半胱氨酸蛋白酶的诱导接近度, 这是它们激活的第一步。

摘要

蛋白酶 caspase 家族在细胞凋亡和先天免疫中起着至关重要的作用。其中, 一个称为发起方半胱氨酸蛋白酶的子群是第一个在这些路径中激活的分组。该组包括 caspase-2,-8, 和-9, 以及炎症半胱氨酸蛋白酶, caspase-1,-4, 和-5。发起人半胱氨酸蛋白酶都是由二聚化激活后, 招募到特定的复合复合体称为活化平台。Caspase 分子荧光互补 (BiFC) 是一种以成像为基础的方法, 将分离的荧光蛋白融合到引发剂半胱氨酸蛋白酶用于可视化引发剂半胱氨酸蛋白酶到它们的活化平台, 由此产生的诱导接近。此荧光提供了启动器 caspase 激活所需的最早步骤之一的读数。利用多种不同的显微手术方法, 该技术可以提供定量的数据, caspase 活化的效率, 人口水平以及 caspase 活化的动力学和大小和数量的 caspase 活化在每个细胞基础上的配合物。

引言

caspase 蛋白酶家族以其在细胞凋亡和先天免疫中的重要作用而闻名1。由于它们的重要性, 确定何时、在何处以及如何有效地激活特定的半胱氨酸蛋白酶, 可以为 caspase 激活通路的机制提供重要的洞察力。此处描述的基于映像的协议启用了 caspase 激活级联中最早步骤的可视化。这种技术利用动态蛋白质: 推动 caspase 活化的蛋白质相互作用。

半胱氨酸蛋白酶可分为两组: 启动器半胱氨酸蛋白酶 (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9, 10, 和-12) 和刽子手半胱氨酸蛋白酶 (caspase-3,-6, 和-7)。刽子手半胱氨酸蛋白酶是存在于细胞作为预制的脂肪酸并且由分裂激活在大和小亚基2 之间。当激活时, 它们会切割许多结构和调节蛋白, 导致细胞凋亡3。启动器半胱氨酸蛋白酶是第一个在通路中激活的半胱氨酸蛋白酶, 通常触发刽子手半胱氨酸蛋白酶的活化。与刽子手半胱氨酸蛋白酶相反, 启动器半胱氨酸蛋白酶由二聚化4、5激活。这种二聚化是通过招募不活跃的单体到特定的大型分子量复合物称为活化平台来促进的。活化平台的组装受一系列特定蛋白质的控制: 蛋白质相互作用。这些都是由在启动器 caspase 的 proform 中存在的保守蛋白交互图案介导的, 包括死亡域 (DD)、死亡效应域 () 和 caspase 招聘域 (卡) 6 (图 1A)。激活平台通常包括受体蛋白和适配器蛋白。受体通常被激活后, 结合的配体, 诱导构象变化, 使许多分子齐聚。然后, 受体要么直接招募 caspase 或适配器分子, 然后将 caspase 带到复合体。因此, 许多 caspase 分子进入接近的接近度允许二聚化。这称为诱导接近模型7。一旦二聚, caspase 经历 autoprocessing, 这有助于稳定活性酶 4, 8. 例如, Apaf1 apoptosome 的组装是由细胞色素 c 在线粒体外膜通透 (MOMP) 的过程中释放出来后触发的。Apaf1 反过来通过一个由两种蛋白质9中存在的卡介导的交互来招募 caspase-9。相似的蛋白质相互作用导致 CD95 死亡诱导信号复合体 (椎间盘) 的组装导致 caspase-8 活化;PIDDosome, 可以激活 caspase-2;和各种 inflammasome 复合体, 启动 caspase-1 激活10,11,12。因此, 启动器半胱氨酸蛋白酶通过一个共同的机制被招募到特定的激活平台上, 导致了诱导接近和二聚化, 没有它的激活就不会发生。

Caspase 分子荧光互补 (BiFC) 是一种基于成像的检测方法, 用于测量启动器半胱氨酸蛋白酶激活的第一步, 允许在激活平台后直接可视化 Caspase 诱导的接近度。大会.该方法利用了分裂荧光蛋白金星的性质。金星是一个更明亮和更 photostable 的黄色荧光蛋白 (YFP) 的版本, 可分为两个非荧光和略微重叠的片段: 金星 n 终点 (金星 n 或钒氮) 和金星的 c 终点 (金星 c 或 VC)。这些片段保留在接近接近13时再折叠餐巾和变为荧光的能力。每个金星碎片被融合到 caspase 的 prodomain, 这是绑定到激活平台的 caspase 的最小部分。这确保了半胱氨酸蛋白酶不保留酶活性, 因此可以同时分析与内源事件相关的下游事件。当 caspase prodomains 被招募到活化平台并经过诱导接近时, 金星碎片再折叠餐巾。(图 1B)。由此产生的金星荧光可用于准确和具体地监测 caspase 激活平台在单细胞中的亚细胞定位、动力学和组装效率。成像数据可以通过共聚焦显微镜或标准荧光显微镜获得, 并可适应多种不同的显微方法, 包括: 时间推移成像实时跟踪 caspase 激活;高分辨率成像对亚细胞定位的精确测定和末端点量化的活化效率。

首先开发了此技术来调查 caspase-214的激活。虽然 caspase-2 的活化平台被认为是 PIDDosome, 包括受体 PIDD (p53-induced 蛋白与死亡域) 和适配器 RAIDD (RIP 相关 ICH-1/CAD-3 同源蛋白与死亡域),PIDDosome 独立的 caspase-2 激活已被报道。这表明 caspase-2 的其他激活平台存在15,16。尽管不知道 caspase-2 激活平台的全部组件, caspase BiFC 技术还是允许在分子级14、17上成功地审问 caspase-2 信号通路。我们还成功地修改了该协议的炎症半胱氨酸蛋白酶 (caspase-1,-4,-5 和-12 ) 18, 原则上, 同样的方法应该足以同样分析每一个其余的发起人半胱氨酸蛋白酶。该协议也可以类似地被修改, 以调查其他途径是二聚化是一个主要的激活信号。例如, 通过二聚化激酶 (JAK )19 磷酸化后, 统计蛋白被激活。因此, BiFC 系统可以用于可视化的统计活化以及许多其他途径调控的动态蛋白质相互作用。下面的协议提供分步说明, 介绍如何将记者引入细胞, 以及图像获取和分析方法。

研究方案

1. 细胞和培养皿的制备

注意: 在组织培养层流罩中执行步骤1-3。戴上手套。

  1. 如果使用玻璃底菜, 涂玻璃纤维连接器。如果使用塑料盘子, 请跳到步骤1.2。
    1. 用0.1 毫克/毫升的纤维连接蛋白溶液: 稀释1毫升1毫克/毫升纤维连接蛋白溶液在9毫升 1 X PBS。
    2. 用 0.5-1 毫升的纤连蛋白覆盖每个井的玻璃底部, 室温下孵育1-5 分钟。
    3. 使用吸管, 收集纤维连接蛋白溶液和存储在4摄氏度。
      注: 纤维连接蛋白溶液可多次重复使用。
    4. 用1-2 毫升 1 X pbs 清洗玻璃, 然后从 pbs 中抽出。
  2. 板 1 x 105单元每井的6井板在2毫升适当的细胞培养媒介 (参见表 1为用于不同大小的井的细胞数字)。如果使用稳定表达 caspase BiFC 组件的单元格线 (参见讨论), 则板 2 x 105单元格, 然后继续处理步骤 (步骤 3)。
  3. 允许细胞在37摄氏度的组织培养孵化器中一夜之间坚持盘子。

2. 转染细胞以引入 caspase BiFC 成分

  1. 染细胞与适当的转染试剂。
    注意: 本协议概述了脂质体2000的说明, 该指令已被优化为最小毒性。该协议已成功地用于 Hela 细胞、MCF7 细胞和 LN18 细胞。如果使用其他转染试剂遵循制造商的指示, 并根据需要进行优化。
    1. 在无菌管中添加12µL 的转染试剂到750µL 的减少血清培养基中。
    2. 室温孵育5分钟。
    3. 添加 10 ng 的报告质粒 (一种荧光蛋白编码的质粒,例如红色荧光蛋白 [RFP], 它将标记被转染的细胞) 到不育的1.5 毫升管为每个井被转染。
    4. 将每个 caspase BiFC 质粒 (例如, 20 吴 caspase-2 prodomain [C2 pro] VC 和 20 ng C2 亲氮) 添加到每个管 (表 2) 中20。
    5. 通过添加减少的血清培养基, 使每根管子的总容积达到100µL。
    6. 使用 p200 吸管, 添加100µL 转染试剂溶液从步骤2.1.2 到质粒混合物滴状方式。
    7. 室温下孵育质粒转染试剂混合物20分钟。
    8. 用吸管或吸力从细胞中吸出培养基, 然后用 p1000 吸管将800µL 的血清游离培养基轻轻地放在井侧。
    9. 使用 p200 吸管, 添加200µL 的 DNA 脂复合体滴向每个井。
    10. 在37摄氏度的组织培养孵化器中孵化出3小时的细胞。
    11. 注意不要破坏单层, 取出含有 DNA 脂复合物的血清游离培养基, 吸入或用吸管抽吸。
    12. 吸管2毫升预热 (37 °c) 完全生长介质轻轻地向下的每一个井的一侧。
  2. 在组织培养孵化器中孵育37摄氏度的细胞, 以达到最佳蛋白质表达的24-48 小时。

3. 诱导 caspase 活化

  1. 治疗的药物或刺激, 诱导 caspase 激活约24小时后转染。
    1. 添加所需的药物浓度的预热 (37 °c) 成像介质 (完全生长介质补充与 Hepes [20 毫米, pH 值 7.2-7.5] 和 2-巯基乙醇 [55 µM]), 并轻轻混合(表 3)。
    2. 用吸管或吸力从细胞中吸出培养基, 然后用吸管将溶液中的2毫升吸管从3.1.1 的一侧轻轻地移到井边。
    3. 将没有药物的成像介质添加到一个井中作为未经处理的控制。
  2. 在37摄氏度的组织培养孵化器中孵化细胞, 或进行4.3 步的时间推移实验。

4.Caspase BiFC 数据采集

  1. Caspase BiFC 单时间点采集
    1. 按照制造商的说明打开显微镜和荧光灯光源。
    2. 在 RFP 过滤器下找到细胞, 聚焦于报告基因荧光。
    3. 使用手动计数计数器, 计算可视字段中所有的 RFP 阳性单元格。记录数字。
    4. 在保持相同的视觉场的同时, 切换到 GFP 过滤器 (或 YFP 过滤器 (如果可用), 并使用手计数计数器, 计算红细胞的数量也是绿色 (金星阳性)。在两个过滤器之间来回切换, 以确保只有红细胞被评估为金星阳性。记录数字 (图 3)。
    5. 从板块的三个单独区域中计算出至少100个 RFP 阳性细胞。
    6. 在每个区域, 计算金星阳性转染细胞的百分比 (即红细胞也是绿色的)。平均产生的百分比以获得标准偏差。
  2. caspase BiFC 的三维成像
    1. 根据制造商的指示打开显微镜并启动采集软件。
    2. 选择60x 或63x 油目标, 并在目标上放置一滴油
    3. 使用正确的板架将培养皿放在显微镜台上。
    4. 使用荧光光源和显微镜眼片或共焦激光器和计算机屏幕, 导航到感兴趣的领域。
    5. 关注记者荧光使用 RFP 激光或过滤器。
    6. 如果荧光已经用到这一点, 将光源切换到共焦激光器, 并可视化相机获取的单元格的实时图像, 并在计算机屏幕上显示采集软件。
    7. 使用操纵杆控制和焦点轮, 微调单元格的焦点和位置, 使单元格位于视图查找器的中心。选择彼此分离且不重叠的单元格。
    8. 输入的百分比激光功率为50% 和曝光时间在100毫秒的金星和 RFP 作为一个出发点, 以确定最佳设置, 用于实验。
    9. 打开实时捕获并检查生成的图像以及两个通道的随附显示直方图。
    10. 如果信号很低, 图像很难制作出来, 增加激光功率和/或曝光时间的增量, 直到图像中的信号看起来很好。
    11. 确保信号不达到饱和。检查显示直方图, 确保每个流体都能看到明显的峰值。如果峰值包含整个直方图显示, 则输入较低的激光功率和曝光设置 (图 2)。
    12. 在相同的条件下可视化控制 (未经处理或未转染) 细胞, 以确保信号是特定的。
      注意: 单色 transfectants 也可以用来控制交叉, 但如果信号在空间上是不同的 (例如线粒体与胞浆), 这是不必要的。
    13. 在显微镜软件中选择或打开 Z 堆栈模块。
    14. 使用焦点旋钮, 近似与单元格中心相对应的焦点位置。
    15. 将焦点调整为一个方向, 直到单元格不再可见时, 选择此项作为顶部位置。
    16. 将焦点调整到相反方向, 直到单元格不再可见, 然后选择此作为底部位置。
    17. 选择最佳步长 (通常约为20µm), 并开始获取, 以指示相机自动在每个通道中的20个µm 步骤之间的顶部和底部位置的单个图像。
    18. 使用3D 渲染软件重建3D 映像 (图 4, 电影 1)。
  3. caspase BiFC 的时间推移成像
    1. 实验前至少1小时, 打开显微镜, 将温度设置为37摄氏度。
    2. 选择40x、60x 或63x 油目标, 并在目标上放置一滴油。
    3. 使用正确的板架将培养皿放在显微镜台上。
    4. 如果 co2源可用, 请将 co2传递设备 (通常是连接到提供 co2的管道的有机玻璃盖子) 放在板架上。将 co2级别设置为 5%, 并从软件内部打开 co2控制器。如果 CO2源不可用, 则包括 20 mM Hepes 以缓冲介质。
    5. 导航到转染细胞的领域, 并可视化相机获取的单元格的实时图像, 并使用 RFP 激光器在计算机屏幕上显示采集软件。
    6. 按照步骤 4.2. 8-4. 2.12, 输入对 RFP 激光器的激光功率和曝光时间百分比的设置。保持这些值尽可能低, 同时仍然能够检测到荧光信号。
    7. 使用正则控件示例 (请参见表 3中的示例), 按照步骤 4.2. 8-4. 2.12 输入 YFP 激光光功率和曝光时间百分比的设置。保持这些值尽可能低, 同时仍能探测到金星信号。
    8. 对于每个板块的井, 选择多个不同的位置, 其中包含一个或多个表达记者的单元格。
    9. 输入时间间隔的每个帧和要采取的帧总数之间的时间段。确保有时间获得所有选定的职位之前, 将采取的下一个框架。
    10. 重新访问每个位置, 并根据需要更正和更新焦点。
    11. 为了纠正可能因温度或外部振动变化而引起的焦漂移, 请打开焦点漂移校正系统 (如果可用)。
    12. 开始时间推移并保存数据。
    13. 使用可用的成像软件分析数据 (图 5, 电影 2)。

结果

在图 3中显示了 DNA 损伤引起的 caspase-2 BiFC 的例子。喜树碱, 一种拓扑异构酶抑制剂, 被用来诱导 DNA 损伤和 caspase-2 活化。红色荧光蛋白 mCherry 作为一个记者, 以表明细胞表达的 BiFC 探针和帮助可视化的总数量的细胞。金星荧光显示在绿色和大 puncta 代表 caspase-2 诱导接近度。这些细胞可以计数, 以确定金星阳性细胞的百分比。结论也可以从这些图像中?...

讨论

该协议讨论了使用分裂荧光蛋白测量 caspase 诱导接近度。因为它非常明亮, 高度 photostable, 而且复用速度快13, 所以选择了分离金星。因此, 对 caspase 诱导接近度的金星复性分析可以提供接近 caspase 蛋白相互作用动力学的实时估计。金星被分成两个稍微重叠的片段, 金星的 n 终点 (金星 n 或钒氮), 包括氨基酸1-173 和 C 末端片段 (金星 c 或 VC), 包括残留物155-239。其他分裂荧光蛋白存在, ...

披露声明

作者声明他们没有竞争的财政利益。

致谢

我们想感谢 Bouchier-海斯实验室的所有成员, 他们为这一技术的发展做出了贡献。这项工作部分是由德州儿童医院儿科试验奖给 LBH 提供的。我们感谢 Joya 钱德拉 (马里兰州休斯顿, 得克萨斯州) 允许包括与她的团队合作发布的数据。所描述的试剂的开发得到了贝勒医学院的细胞分选核心和 NIH (NIAID P30AI036211, P30CA125123 和 NCRR S10RR024574) 的资助, 以及乔尔 m. Sederstrom 的帮助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishesMattekP06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified ProteinMilliporeFC010-10MG
DPBSSigmaD8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagentInvitrogen11668019
OPTI MEM IInvitrogen31985088
C2-Pro VC plasmidAddgene49261
C2-Pro VN plasmidAddgene49262
Inflammatory caspase BiFC plasmidsavailable by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC componentsavailable by request from LBH
DsRed mito plasmidClontech632421similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPESInvitrogen15630106
2 Mercaptoethanol 1000XInvitrogen21985023
q-VD-OPHApex BioA1901

参考文献

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