מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

Summary

פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.

Abstract

משפחת קספאז של פרוטאזות ממלאים תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות. בין אלה, קבוצת משנה המכונה יוזם caspases הם הראשונים להיות מופעל בתוך המסלולים הללו. קבוצה זו כוללת קספאז-2-8, ו-9, וכן את caspases דלקתיות, קספאז-1, ארבע, ו-5. Caspases המאתחל כולם מופעלים על ידי dimerization בעקבות גיוס קומפלקסים multiprotein ספציפי שנקרא הפעלת פלטפורמות. קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) היא גישה מבוססת הדמיה איפה לפצל חלבונים פלורסנט דבוקה יוזם caspases משמשים כדי להמחיש את גיוס יוזם caspases פלטפורמות הפעלה שלהם, וכתוצאה מכך הקרבה המושרה. קרינה פלואורסצנטית הזה מספק את הבדיקה של אחד השלבים המוקדמים הנדרשים להפעלת קספאז יוזם. שימוש במספר גישות שונות מבוסס מיקרוסקופיה, טכניקה זו יכולה לספק נתונים כמותיים על היעילות של קספאז הפעלה ברמת האוכלוסייה, כמו גם את קינטיקה של קספאז ההפעלה ואת גודל מספר קספאז מפעיל מתחמי על בסיס לכל תא.

Introduction

משפחת פרוטאז קספאז ידועים שלהם תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות ¹. בשל חשיבותם, קביעה מתי, היכן, באיזו מידת יעילות caspases ספציפי מופעלים יכול לספק תובנות מנגנוני קספאז מכריע הפעלה מסלולים. פרוטוקול מבוסס הדמיה המתוארים כאן מאפשר את החזיית בשלבים המוקדמים קספאז הפעלת המפל. טכניקה זו לוקח את היתרונות של אינטראקציות חלבון דינמי: הפעלת קספאז באותו כונן.

Caspases ניתן לחלק לשתי קבוצות: caspases המאתחל (קספאז-1,-2,-4,-5, -8,-9,-10 ו-12), את caspases התליין (קספאז-3,-6 ו-7). Caspases התליין נמצאים בתא כמו הדימרים preformed, מופעלים על-ידי פצילות בין יחידת משנה קטנים וגדולים ². כשהוא מופעל, הם קליב חלבונים מבניים ותקינה רבים וכתוצאה מכך אפופטוזיס ³. Caspases המאתחל הן caspases הראשונה תופעל ב מסלול, בדרך כלל להפעיל את ההפעלה של caspases התליין. בניגוד caspases התליין, יוזם caspases מופעלים על ידי ^4,dimerization⁵. Dimerization הזה הוא הקל על ידי גיוס של מונומרים לא פעיל כדי מתחמי משקל מולקולרי גדול ספציפי ידוע as פלטפורמות הפעלה. הרכבה של פלטפורמות הפעלה נשלטת על ידי סדרה של אינטראקציות חלבון: חלבון ספציפי. אלה מתווכת על ידי מוטיבים אינטראקציית חלבון שנשמרת נוכח proform של קספאז המאתחל, כוללים את תחום המוות (DD), תחום אפקטור מוות (DED) קספאז גיוס לתחום (כרטיס) ⁶ (איור 1 א'). פלטפורמות הפעלה כוללים בדרך כלל חלבון קולטן וחלבון של מתאם. הקולטן מופעל בדרך כלל בעת איגוד של ליגנד, וגורם לשינוי הסתגלותי המאפשר oligomerization של מולקולות רבות. הקולטן ואז גם מגייס את קספאז ישירות או מולקולות מתאם בתורו להביא את קספאז המתחם. לפיכך, מולקולות קספאז רבים להיכנס בסמיכות המתיר dimerization. זה נקרא את המודל של קרבה המושרה ⁷. ברגע dimerized, קספאז עובר עיבוד אוטומטי, אשר משמש כדי לייצב את האנזים פעיל ^4,8. לדוגמה, הרכבה של apoptosome Apaf1 המופעלת על-ידי ציטוכרום c בעקבות השקתו של המיטוכונדריה בתהליך הקרוי הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי permeabilization (MOMP). Apaf1 מגייס בתורו קספאז-9 על-ידי אינטראקציה זה מתווך על ידי כרטיס נוכחות שני חלבונים ⁹. אינטראקציות חלבון דומה לגרום ההרכבה של CD95 המוות גרימת איתות מורכבים (דיסק) שמוביל הפעלה קספאז-8; PIDDosome, אשר ניתן להפעיל קספאז-2; מתחמי inflammasome שונים כי ליזום הפעלה קספאז-1 ^10,11,12. לפיכך, יוזם caspases מגויסים כדי פלטפורמות הפעלה ספציפית ע י מנגנון משותף וכתוצאה מכך מושרה הקרבה, dimerization, אשר בלעדיו לא יתרחש הפעלה.

קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) הוא assay מבוססת הדמיה שפותחה כדי למדוד את זה הצעד הראשון בהפעלת caspases היוזם, ומאפשר פריט חזותי ישיר של הגיינה קספאז הנגרמת בעקבות הפעלת פלטפורמה הרכבה. שיטה זו מנצלת המאפיינים של החלבון הניאון פיצול ונוס. ונוס היא של יותר ויותר בהיר יותר photostable גירסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כי ניתן להפריד לשני מקטעים שאינם-פלורסנט, מעט חופפים: N-הסופית של נוגה (ונוס N או VN) ו- C-הסופית של נוגה (ונוס C או VC). קטעים אלה שומרים על היכולת לקפל ולהפוך פלורסנט כאשר אתה נמצא בסמיכות ¹³. כל שבר ונוס היא דבוקה prodomain של קספאז, המהווה החלק מינימלי של קספאז המאגד פלטפורמת הפעלה. פעולה זו מבטיחה כי caspases אינם שומרים על פעילות אנזימטיות, לכן ניתוח בו-זמניות של הזרם באירועים המשויכים אירועים אנדוגני הוא אפשרי. . ונוס קטעים לקפל כאשר prodomains קספאז גייסו פלטפורמת הפעלה ומבצעת קרבה המושרה. (איור 1B). קרינה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך ונוס ניתן לעקוב במדויק, במיוחד ההתאמה subcellular, קינטיקה של, ואת היעילות של הרכבה של יוזם קספאז פלטפורמות הפעלה של תאים בודדים. הדמיה נתונים ניתן לרכוש על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית או על-ידי קרינה פלואורסצנטית רגילה במיקרוסקופ, ניתן להתאים מספר גישות מיקרוסקופיה שונים כולל: הדמיה בצילום מואץ כדי לעקוב אחר קספאז הפעלה בזמן אמת; הדמיה ברזולוציה גבוהה עבור מדויק ועיונם לוקליזציה subcellular; נקודת הקצה כימות של היעילות של ההפעלה.

שיטה זו פותחה לראשונה כדי לחקור את ההפעלה של קספאז-2¹⁴. בעוד הפלטפורמה הפעלה קספאז-2 נחשב להיות PIDDosome, המורכב של הקולטן PIDD (חלבון p53-induced עם תחום המוות), את מתאם RAIDD (RIP-הקשורים ICH-1/CAD-3 הומולוגי חלבון עם תחום המוות), דווח PIDDosome תלויית הפעלה קספאז-2. הדבר מצביע על כי פלטפורמות הפעלה נוספים קספאז-2 קיימים ^15,16. למרות הידיעה הרכיבים המלאה של פלטפורמת הפעלה קספאז-2, אפשרה קספאז טכניקה BiFC לחקירה מוצלחת של המסלולים איתות קספאז-2 של ה ברמה המולקולרית ^14,17. אנחנו גם בהצלחה הסתגלו פרוטוקול זה עבור caspases דלקתיות (קספאז-1, ארבע,-5 ו-12) ¹⁸ , בעקרון, אותה גישה צריך להספיק באופן דומה לנתח את כל caspases יוזם הנותרים. פרוטוקול זה דומה יכול להיות מותאם כדי לחקור את המסלולים אחרות היו dimerization הוא אות הפעלת מרכזי. לדוגמה, חלבונים STAT מופעלים על ידי dimerization בעקבות זרחון יאנוס קינאז (JAK) ¹⁹. לפיכך, מערכת BiFC יכול לשמש כדי להמחיש הפעלת STAT, כמו גם משעולים רבים אחרים מוסדר על ידי אינטראקציות חלבון דינמי. פרוטוקול הבאים מספק הוראות מפורטות על כניסתה של הכתבים לתוך תאים, כמו גם שיטות עבור ייבוא תמונות וניתוח.

Protocol

1. הכנת התאים ומנות תרבות

הערה: בצע את שלבים 1-3 בשכונה זרימה שכבתית תרביות רקמה. ללבוש כפפות.

1. אם באמצעות כלי הזכוכית התחתונה, מעיל הזכוכית עם fibronectin. לדלג על שלב 1.2 אם משתמש מנות פלסטיק.
   1. להפוך את פתרון 0.1 מ"ג/מ"ל של fibronectin: למהול 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל fibronectin פתרון 9 מ ל 1 X PBS.
   2. מכסים קרקעית זכוכית בכל טוב עם 0.5-1 מ ל fibronectin דגירה למשך 1-5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. באמצעות פיפטה של, לאסוף את הפתרון fibronectin ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: הפתרון fibronectin חוזר מספר פעמים.
   4. לשטוף את הכוס פעם אחת עם 1-2 מ ל 1 X PBS, וארוקן את PBS.
2. צלחת עונה 1 פרק 10⁵ תאים לכל טוב של צלחת 6-ובכן ב- 2 מ של התא המתאים תרבות המדיה (ראה טבלה 1 עבור מספרי הטלפון הנייד לשימוש עבור בארות בגדלים שונים). אם משתמש קו תא stably שיבטא את הרכיבים BiFC קספאז (ראה דיון), צלחת 2 x 10⁵ תאים והמשך לשלב טיפול (שלב 3).
3. אפשר לדבוק המנה בין לילה ב 37 ° C בחממה תרביות רקמה תאים.

2. תקנים של תאים כדי להציג את הרכיבים BiFC קספאז

1. Transfect תאים עם תרביות תאים המתאימים הכימית.
   הערה: פרוטוקול זה מתווה את ההוראות עבור Lipofectamine 2000, אשר הותאם מבחינת רעילות מינימלית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה הלה תאים, התאים MCF7, תאים LN18. אם משתמשים נוספים תרביות תאים ריאגנטים בצע הוראות היצרן ולמטב כנדרש.
   1. להוסיף µL 12 מהתרכובת תרביות תאים µL 750 של התקשורת מופחת סרום צינור סטרילי.
   2. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   3. להוסיף 10 ng של פלסמיד כתב (פלסמיד קידוד חלבון פלואורסצנטי, למשל אדום חלבון פלואורסצנטי [RFP], זה יהיה תווית התאים transfected) לרכבת התחתית mL 1.5 סטרילי עבור כל טוב להיות transfected.
   4. הוסף 20 ng של כל פלסמיד BiFC קספאז (למשל, 20 ng של קספאז-2 prodomain [C2 Pro]-VC ו- 20 ng של C2 Pro-VN) כדי כל שפופרת (טבלה 2).
   5. להביא כל שפופרת עד הנפח הכולל של 100 µL על-ידי הוספת מדיה מופחת סרום.
   6. בעזרת פיפטה p200, להוסיף 100 µL של תרביות תאים ריאגנט פתרון משלב 2.1.2 לתערובת פלסמיד באופן dropwise.
   7. דגירה המיקס ריאגנט פלסמיד-תקנים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   8. תשאף התקשורת מן התאים באמצעות פיפטה או עם יניקה, לאחר מכן, באמצעות פיפטה p1000, פיפטה 800 µL מדיה פנויה סרום בעדינות במורד הצד של הבאר.
   9. באמצעות פיפטה p200, להוסיף 200 µL של המתחם הדי-השומנים dropwise כל טוב.
   10. דגירה התאים חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
   11. מטפל לא לשבש את טפט, להסיר את התקשורת החופשית סרום המכיל את מתחמי ה-DNA-השומנים על ידי השאיפה באמצעות שאיבה או עם פיפטה.
   12. פיפטה 2 מיליליטר ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) מדיה צמיחה מלאה בעדינות במורד הצד של כל טוב.
2. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה במשך 24-48 שעות עבור ביטוי חלבון אופטימלי.

3. אינדוקציה של קספאז הפעלת

1. לטפל עם תרופות או גירוי שגורם קספאז הפעלה כ 24 פוסט-תקנים h.
   1. הוסף הריכוז הרצויה של הסם מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) הדמיה מדיה (מדיה צמיחה מלאה בתוספת Hepes [20 מ מ, pH 7.2-7.5] ומרקפטואתנול [מיקרומטר 55]), לערבב בעדינות (טבלה 3).
   2. תשאף התקשורת מן התאים באמצעות פיפטה או עם יניקה, לאחר מכן, באמצעות פיפטה של, פיפטה 2 מ"ל של הפתרון של 3.1.1 בעדינות במורד הצד של הבאר.
   3. הוסף מדיה הדמיה ללא התרופה באר אחת כפקד של לא מטופל.
2. דגירה התאים חממה תרביות רקמה ב 37 ° C או להמשיך 4.3 שלב עבור ניסוי זמן לשגות.

4. BiFC קספאז קירור והקפאה

1. BiFC קספאז עבור רכישת נקודת זמן יחיד
   1. הפעל את המיקרוסקופ ואת מקור אור פלורסנט ההוראות של היצרן.
   2. למצוא את התאים תחת מסנן RFP ו להתמקד פלורסצנטיות ג'ין הכתב.
   3. באמצעות מונה יד-טלי, לספור את כל התאים RFP-חיוביות בשדה הראייה. להקליט את המספר.
   4. תוך שמירה על visual באותו השדה, להחליף מסנן GFP (או מסנן YFP אם הוא זמין), באמצעות מונה יד-טלי, לספור את מספר כדוריות אדומות שהם גם ירוק (ונוס-חיוביים). מעבר הלוך ושוב בין שני מסננים כדי לוודא כי רק כדוריות אדומות מחושבת עבור ונוס-חיוביות. להקליט את המספר (איור 3).
   5. ספירת לפחות 100 תאים RFP-חיוביות מכל שלושה תחומים נפרדים של הצלחת.
   6. בכל אזור, לחשב את אחוז ונוס-חיוביות transfected תאים (קרי אדום תאים שהם גם ירוק). ממוצע האחוזים המתקבלת כדי לקבל את סטיית התקן.
2. הדמיה תלת-ממדית של קספאז BiFC
   1. הפעל המיקרוסקופ ההוראות של היצרן ולאחר ההשקה רכישת התוכנה.
   2. בחר את x 60 או המטרה שמן x 63 ומניחים טיפת שמן על המטרה
   3. המקום המנה תרבות על הבמה מיקרוסקופ באמצעות בעל לוחית הנכון.
   4. באמצעות מקור אור epifluorescence ואת היצירה עין המיקרוסקופ או לייזרים קונאפוקלית או מסך המחשב, נווט אל שדה עניין.
   5. מתמקדים קרינה פלואורסצנטית הכתב באמצעות לייזר RFP או המסנן.
   6. אם epifluorescence שימש עד לנקודה זו, מקור האור לעבור לייזרים קונאפוקלית והמחש תמונה חיה של התאים שנרכשו על ידי המצלמה, המוצג על ידי רכישת תוכנת על מסך המחשב.
   7. באמצעות הפקד ג'ויסטיק ואת הגלגל המוקד, לכוונן את המוקד והמיקום התאים כך התאים נמצאים במרכז התצוגה מהבורר. בחר תאים מופרדים אחד מהשני, לא חופפות.
   8. קלט את עוצמת הלייזר אחוז כדי 50% וזמן החשיפה ב-100 מילישניות עבור ונוס ו- RFP כנקודת התחלה כדי לקבוע את ההגדרות האופטימליות לשימוש עבור הניסוי.
   9. להפעיל את לכידת חיות ולבדוק את התמונה המתקבלת, היסטוגרמות התצוגה המלווה את שני הערוצים.
   10. אם האות הוא נמוך, התמונה היא קשה להתמזמז להגדיל אחוזי לייזר הזמן כוח ו/או חשיפה בתוספות עד האות בתמונה נראה טוב.
   11. ודא כי האות לא מגיעים לרוויה. לבדוק את ההיסטוגרמה התצוגה כדי לוודא לשיא ברורים לעין כל עבור חיל הים. אם הפסגה מקיפה את הצגת היסטוגרמה כולו, קלט נמוך לייזר כוח החשיפה והגדרות (איור 2).
   12. דמיינו תאים שליטה (ללא טיפול או שאינם transfected) תחת באותם תנאים כדי להבטיח האות ספציפיים.
       הערה: transfectants צבע אחד יכול לשמש גם כדי לשלוט מוצלב, אך אם הסימנים במרחב נפרדות (למשל מיטוכונדריאלי לעומת cytosolic) זה לא נחוץ.
   13. בחר או לפתוח את המודול מחסנית Z בתוכנה מיקרוסקופ.
   14. באמצעות הידית המוקד, להעריך את מיקום מוקד התואם למרכז של התא.
   15. התאם את המוקד בכיוון אחד עד התא אינה גלויה, בחר באפשרות זו כמו המיקום העליון.
   16. התאם את המוקד בכיוון ההפוך עד התא הוא שוב אינו גלוי, בחר באפשרות זו גם מיקום התחתון.
   17. לבחור את גודל הצעד אופטימלית (בדרך כלל כ- 20 מיקרומטר) ולהתחיל הרכישה על מנת להנחות את המצלמה לקחת באופן אוטומטי תמונה אחת בכל אחד מהערוצים בכל אחד מהשלבים מיקרומטר 20 בין המיקומים העליונים והתחתונים.
   18. השתמש בתוכנת עיבוד תלת-ממד כדי לשחזר את התמונה תלת-ממד (איור 4סרט 1).
3. הדמיה בצילום מואץ של קספאז BiFC
   1. לפחות שעה לפני הניסוי, הפעלת המיקרוסקופ והגדר את הטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס.
   2. בחר 40 x, 60 x או המטרה שמן x 63 ומניחים טיפת שמן על המטרה.
   3. המקום המנה תרבות על הבמה מיקרוסקופ באמצעות בעל לוחית הנכון.
   4. אם מקור₂ CO זמין, למקם התקן משלוח של₂ CO (בדרך כלל פלקסיגלס מכסה מחובר הצינור המעביר את CO₂) על גבי לוחית. הגדר CO₂ רמת 5% והפעל את בקר₂ CO מ בתוך התוכנה. אם מקור₂ CO אינה זמינה, לכלול 20 מ מ Hepes להעברה למאגר המדיה.
   5. נווט אל שדה של תאים transfected והמחש תמונה חיה של התאים על ידי המצלמה, המוצג על-ידי רכישת התוכנה על גבי מסך המחשב באמצעות הלייזר RFP.
   6. בעקבות צעדים 4.2.8-4.2.12, קלט את ההגדרות עבור אחוז לייזר זמן כוח וחשיפה הלייזר RFP. לשמור ערכים אלה נמוך ככל האפשר תוך עדיין היכולת לזהות את האות פלורסנט.
   7. באמצעות פקד חיובי לטעום (ראו טבלה 3 לקבלת דוגמאות), עקוב אחר השלבים 4.2.8-4.2.12 קלט את ההגדרות בפעם אחוז לייזר כוח וחשיפה אור הלייזר YFP. לשמור ערכים אלה נמוך ככל האפשר תוך שהם עדיין יוכלו לזהות אות ונוס.
   8. כל טוב של הצלחת, בחר במספר תפקידים שונים המכילים תא אחד או יותר לבטא את הכתב.
   9. קלט את מרווח הזמן בין כל מסגרת של זמן לשגות, הכולל מספר מסגרות שיש לנקוט. ודא זמן לרכוש כל המיקומים שנבחרו לפני המסגרת הבאה היא שיש לנקוט.
   10. ביקור חוזר לכל תפקיד, לתקן ולעדכן את המוקד לפי הצורך.
   11. לתיקון להיסחף מוקד יכול לנבוע שינויי טמפרטורה או ויברציות חיצוני, להפעיל את המוקד להיסחף תיקון מערכת (אם זמין).
   12. להתחיל מואץ ולשמור את הנתונים.
   13. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנות הדמיה זמינים (איור 52 סרט).

תוצאות

דוגמה של קספאז-2 BiFC הנגרם על ידי נזק לדנ א מוצג באיור3. Camptothecin, טופואיזומראז אני מעכב, שימש לזירוז ההפעלה נזק וקספאז-2 ה-DNA. MCherry חלבון פלואורסצנטי אדום שימש ככתב להראות כי התאים להביע את המכשיר BiFC שיעזרו להמחיש את המספר הכולל של תאים. קרינה פלואורסצנטית וונוס...

Discussion

פרוטוקול זה דן השימוש של חלבונים פלורסנט מפוצל כדי למדוד את קספאז המושרה קרבה. פיצול ונוס נבחרה עבור טכניקה זו כי הוא בהיר מאוד, מאוד photostable, את refolding הוא מהיר ¹³. לפיכך, הניתוח של ונוס refolding על קרבה קספאז המושרה יכול לספק קרוב אומדנים בזמן אמת של קספאז חלבון אינטראקציה דינמיקה. ונ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes	Mattek	P06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified Protein	Millipore	FC010-10MG
DPBS	Sigma	D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668019
OPTI MEM I	Invitrogen	31985088
C2-Pro VC plasmid	Addgene	49261
C2-Pro VN plasmid	Addgene	49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids			available by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components			available by request from LBH
DsRed mito plasmid	Clontech	632421	similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPES	Invitrogen	15630106
2 Mercaptoethanol 1000X	Invitrogen	21985023
q-VD-OPH	Apex Bio	A1901