Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

요약

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

초록

프로 테아 제 caspase 제품군 apoptosis와 타고 난 면제에 필수적인 역할을 한다. 이 중, 초기자 caspases로 알려진 네가이 경로에서 활성화 될 먼저 있습니다. 이 그룹 포함 caspase-2,-8, 및-9, 뿐만 아니라 염증 caspases, caspase-1,-4, 그리고-5. 초기자 caspases 모두 다음 모집 활성화 플랫폼 이라고 하는 특정 multiprotein 복합물을 이합체 화에 의해 활성화 됩니다. Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)은 어디 caspases 초기자 caspases 그들의 활성화 플랫폼 및 그 결과의 채용을 시각화 하는 데 사용 되는 시작자를 융합 하는 형광 단백질을 분할 영상 기반 접근 유도 근접입니다. 이 형광 판독을의 초기자 caspase 활성화에 필요한 초기 단계 중 하나를 제공 합니다. 다양 한 다른 현미경-기반 접근을 사용 하 여,이 기술은 caspase 활성화 크기 및 caspase 활성화의 활동 인구 수준에 caspase 활성화의 효율성에 양적 데이터를 제공할 수 있습니다. 셀 당 기초에 있는 복합물

서문

Caspase 프로 테아 제 가족은 apoptosis와 타고 난 면제 ¹에 그들의 중요 한 역할에 대 한 알려져 있다. 그들의 중요성 때문에 결정 언제, 어디서, 그리고 어떻게 효율적으로 특정 caspases 활성화 활성화 경로 caspase의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 이미징 기반된 프로토콜 caspase 활성화 폭포의 가장 이른 단계 시각화 수 있습니다. 이 기술은 활용 동적 단백질: 단백질 상호 작용의 그 드라이브 caspase 활성화.

Caspases는 두 그룹으로 분할 될 수 있다: 초기자 caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, 및-12)와 사형 집행 caspases (caspase 3-6과-7). 사형 집행 caspases 미리 형성한 이합체로 셀에 존재 하 고 크고 작은 소 단위 ²사이 분열에 의해 활성화 됩니다. 활성화 되 면, 그들은 apoptosis ³의 결과로 수많은 구조 및 규제 단백질을 쪼개 다. 초기자 caspases는 통로에서 활성화 될 및 일반적으로 사형 집행 caspases의 활성화를 방 아 쇠를 첫 번째 caspases. 사형 집행 caspases, 달리 초기자 caspases 이합체 화 ^4,5에 의해 활성화 됩니다. 이 이합체 화 활성화 플랫폼으로 알려진 특정 큰 분자량 단지를 비활성 단위체의 채용에 의해 촉진 된다. 정품 인증 플랫폼의 특정 단백질: 단백질 상호 작용의 일련에 의해 규율 됩니다. 이러한 보존된 단백질 상호 작용 주제 시작자 caspase의 proform에 의해 중재 되 고 죽음 도메인 (DD), 죽음 이펙터 도메인 (DED) 및 caspase 신규 모집 도메인 (카드) ⁶ (그림 1A)를 포함 합니다. 정품 인증 플랫폼은 일반적으로 수용 체 단백질과 접합 기 단백질을 포함. 수용 체는 일반적으로 수많은 분자의 oligomerization 수 있도록 구조적 변화를 유도 한 ligand의 바인딩 시 활성화 됩니다. 수용 체 다음 중 채용 caspase 직접 또는 어댑터 분자는 차례로 caspase는 복잡 합니다. 따라서, 수많은 caspase 분자 이합체 화를 허용 하는 가까이에 서. 이 유도 근접 모델 ⁷이라고 합니다. 일단, dimerized는 caspase autoprocessing 활성 효소 ^4,8을 안정화 하는 역할을 겪 습. 예를 들어 Apaf1 apoptosome의 시 토 크롬 c 미토 콘 드리 아 외 막 permeabilization (MOMP) 라는 프로세스에서 미토 콘 드리 아에서 출시를 다음에 의해 트리거됩니다. Apaf1는 차례로 caspase-9 카드 두 단백질 ⁹에 의해 중재 되는 상호 작용을 통해 보충 한다. CD95 죽음의 복잡 한 신호 유도 (디스크) caspase-8 활성화; 리드 어셈블리에 비슷한 단백질 상호 작용 결과 caspase-2;를 활성화할 수 있습니다 PIDDosome 그리고 다양 한 inflammasome 단지 caspase-1 정품 인증 ^10,,1112을 시작 하는. 따라서, 초기자 caspases는 유도 근접 고 이합체 화 없이 활성화를 발생 하지 것입니다 일반적인 메커니즘에 의해 특정 활성화 플랫폼을 채용.

Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)는 초기자 caspases의 활성화에서이 첫 번째 단계를 측정 하기 위해 개발 된 영상 기반 분석 결과 caspase 유도 근접 다음 활성화 플랫폼의 직접 시각화 어셈블리입니다. 이 방법은 분할 형광 단백질 비너스의 속성 활용합니다. 금성은 더 밝고 비 형광과 약간 겹치는 두 조각으로 분리 될 수 있다 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 더 photostable 버전: 금성 금성 N (VN), 비너스 (금성 C 또는 VC)의 C-말단의 N terminus. 이 파편 refold 될 때 근접 ¹³에 형광을 유지 합니다. 각 비너스 조각 활성화 플랫폼을 caspase의 최소 부분입니다 caspase의 prodomain에 융합 이다. 그러면 그는 caspases 효소 활동을 유지 하지 않습니다 및 따라서 생 이벤트와 관련 된 다운스트림 이벤트의 동시 분석 가능 하다. 금성 파편 refold caspase prodomains 활성화 플랫폼을 채용 하 고 유도 근접을 받 다. (그림 1B)입니다. 결과 금성 형광 정확 하 고 구체적으로 subcellular 지 방화, 활동, 그리고 단일 셀에서 초기자 caspase 활성화 플랫폼의 조립의 효율성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 또는 표준 형광 현미경 검사 법에 의해 취득 될 수 있다 데이터 이미징 및 다른 현미경 방법 등의 숫자에 적응 시킬 수 있다: 실시간으로; caspase 활성화 추적 시간 경과 영상 subcellular 지 방화;의 정확한 결정을 위한 고해상도 이미징 그리고 활성화의 효율성의 끝점 정량화입니다.

이 기술은 caspase-2¹⁴의 활성화를 조사 하기 위해 처음 개발 되었다. Caspase-2에 대 한 정품 인증 플랫폼은 PIDDosome 생각 된다, 하는 동안 구성 된 수용 체 PIDD (죽음 도메인으로 유도 하는 p53 단백질)와 RAIDD (죽음 도메인 RIP 관련 ICH-1/CAD-3 동종 단백질), 어댑터 PIDDosome-독립적인 caspase-2 정품 인증 보고 되었습니다. 이 caspase-2에 대 한 추가 활성화 플랫폼 존재 ^15,16나왔다. 모르고 caspase-2 활성화 플랫폼의 전체 구성 요소, 불구 caspase BiFC 기술은 분자 수준 ^14,17caspase-2 신호 통로의 성공적인 심문을 위해 허용 했다. 우리 또한 성공적으로이 프로토콜 염증 caspases (caspase-1,-4,-5-12)에 대 한 적응 ¹⁸ , 원칙적으로, 동일한 접근 마찬가지로 나머지 초기자 caspases의 각각을 분석 하는 것을 충분 해야 한다. 이 프로토콜 마찬가지로 적응 될 수 있는 다른 경로 조사 이합체 화는 주요 활성화 신호 했다. 예를 들어, STAT 단백질 이합체 화 Janus 키 니 아 제 (JAK) ¹⁹에 따라 인 산화에 의해 활성화 됩니다. 따라서, BiFC 시스템 합계 활성화 뿐만 아니라 많은 다른 경로 동적 단백질 상호 작용에 의해 규제에 대 한 시각화 사용 될 수 있습니다. 다음 프로토콜 이미지 수집 및 분석을 위한 방법론 뿐만 아니라 세포로 기자 들의 도입에 대 한 단계별 지침을 제공합니다.

프로토콜

1입니다. 셀 및 문화 요리 준비

참고: 조직 문화 층 류 두건에 1-3 단계를 수행 합니다. 장갑을 착용 한다.

1. 경우 유리 하단 요리에 사용 하 여, fibronectin 함께 유리 코트. 플라스틱 접시를 사용 하 여 경우 1.2 단계를 건너뜁니다.
   1. Fibronectin의 0.1 mg/mL 해결책 확인: 1 X PBS의 9 mL에 1 mg/mL fibronectin 솔루션의 1 mL를 희석.
   2. 0.5-1 각의 유리 하단 커버 fibronectin mL 및 실 온에서 1-5 분 동안 품 어.
   3. Fibronectin 솔루션을 수집 하 고 4 ° c.에서 저장 한 피 펫을 사용 하 여,
      참고: fibronectin 솔루션 여러 번 다시 사용할 수 있습니다.
   4. 일단 1-2 mL 1 X PBS 가진 유리를 세척 하 고 PBS에서 발음.
2. 플레이트 1 x 10⁵ 셀 해당 셀의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 당 문화 미디어 (다른 크기의 웰 스에 대 한 사용 하 여 셀 번호 표 1 참조). 셀 라인을 안정적으로 표현 하는 caspase BiFC 구성 요소 (내용 참조)를 사용 하 여 2 x 10⁵ 셀 접시 하 고 치료 단계 (3 단계)를 진행 합니다.
3. 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 접시에 셀 수 있습니다.

2. 세포의 transfection caspase BiFC 구성 요소를 소개 하

1. 적절 한 transfection 시 셀 transfect
   참고:이 프로토콜은 최소한의 독성에 대 한 최적화 된 Lipofectamine 2000에 대 한 지침을 설명 합니다. 이 프로토콜은 Hela 세포 MCF7 세포, LN18 세포에 성공적으로 사용 되었습니다. 추가 사용 하는 경우 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 하 고 필요에 따라 최적화.
   1. 무 균 튜브에 감소 된 혈 청 미디어의 750 µ L를 transfection 시 약의 12 µ L를 추가 합니다.
   2. 5 분 동안 실 온에서 품 어.
   3. 10 추가 기자 플라스 미드 (형광 단백질, 예를 들어 빨간색 형광 단백질 [RFP], transfected 세포 레이블을 것입니다 인코딩 플라스)의 ng 페 수를 각 잘 살 균 1.5 mL 튜브에.
   4. 20 추가 각 caspase BiFC 플라스 미드의 ng (예를 들어, 20 caspase-2 prodomain [C2 프로]의 ng-VC 및 20 ng C2 프로-VN의) 각 관 (표 2).
   5. 감소 된 혈 청 미디어를 추가 하 여 100 µ L의 총 볼륨까지 각 튜브를가지고.
   6. P200 피 펫을 사용 하 여 추가 transfection 시 약 해결책의 100 µ L 단계 2.1.2에서에서 플라스 미드 혼합물에 dropwise 방식.
   7. 실 온에서 20 분에 대 한 플라스 미드 transfection 시 믹스를 품 어.
   8. 미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 혈 청 자유로운 미디어의 800 µ L 플라스틱 p1000 피 펫을 사용 하 여.
   9. P200 피 펫을 사용 하 여, 각 잘에 dropwise DNA-지질 복합체의 200 µ L를 추가 합니다.
   10. 셀 3 h에 대 한 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 품 어.
   11. 단층을 방해 하지 않도록 주의 복용는 피 펫 또는 포부 흡입을 사용 하 여 DNA 지질 복합물을 포함 하는 혈 청 무료 미디어를 제거.
   12. 각의 측면 아래로 부드럽게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 완전 한 성장 매체의 2 mL 플라스틱
2. 최적의 단백질 표정을 위한 24-48 h에 대 한 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.

3입니다. caspase 활성화 유도

1. 약물 또는 caspase 활성화 약 24 h 후 transfection 유도 자극으로 치료.
   1. 원하는 농도의 약물을 미리 예 열 (37 ° C) 이미징 미디어 (완전 한 성장 매체 보충 Hepes [20 m m, pH 7.2-7.5]와 2-mercaptoethanol [55 μ M])와 섞어 부드럽게 추가 (표 3).
   2. 미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 3.1.1에서 솔루션의 2 mL 플라스틱을 피 펫을 사용 하 여.
   3. 치료 컨트롤 한 잘에 약물 없이 영상 미디어를 추가 합니다.
2. 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 셀을 품 어 또는 단계 4.3 시간 경과 실험에 대 한 진행.

4입니다. Caspase BiFC 데이터 수집

1. 한 번 포인트 획득을 위한 Caspase BiFC
   1. 현미경 및 형광 광원 제조업체의 지침에 따라 설정.
   2. RFP 필터 및 리포터 유전자 형광에 초점에서 세포를 찾아.
   3. 손을-집계 카운터를 사용 하 여 시야에 RFP 긍정적인 세포의 모든 계산. 수를 기록 합니다.
   4. 같은 시야를 유지 하면서는 GFP (YFP 필터 또는 사용 가능한 경우)로 전환 하 고, 녹색은 또한 적혈구의 수를 세 손을 집계 카운터를 사용 하 여 (금성 양성). 레드 셀만 금성 양성에 대 한 평가 되도록 두 필터 간에 앞뒤로 전환 합니다. (그림 3) 번호를 기록 합니다.
   5. 각 접시의 세 가지 개별 영역에서 적어도 100 RFP 긍정적인 세포를 계산 합니다.
   6. 각 지역에서 금성-긍정적인 transfected 세포 (즉, 레드 셀 또한 녹색)의 비율을 계산 합니다. 평균 표준 편차를 결과 백분율.
2. Caspase BiFC의 3-차원 영상
   1. 제조업체의 지침에 따라 현미경 켜고 수집 소프트웨어 시작.
   2. 60 x 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치
   3. 올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.
   4. Using epifluorescence 광원 및 현미경 눈 조각 또는 confocal 레이저와 컴퓨터 화면, 관심 분야를 탐색 합니다.
   5. RFP 레이저 또는 필터를 사용 하 여 기자 형광에 초점.
   6. 이 시점까지 epifluorescence를 사용 하는 경우 confocal 레이저 광원 전환 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.
   7. 조이스틱 제어 및 초점 휠 using, 미세 조정 초점 및 셀의 위치는 셀 뷰 파인더의 중앙에. 서로에서 분리 되어 하 고 중복 되지 셀을 선택 합니다.
   8. 실험에 사용할 최적의 설정을 결정 하는 출발점으로 비너스와 RFP에 대 한 입력 100 ms에 노출 시간을 50% 비율 레이저 파워.
   9. 결과 이미지와 함께 디스플레이 히스토그램 두 채널에 대 한 검사 및 라이브 캡처를 켭니다.
   10. 신호는 낮은 경우 이미지 만들 어렵다 증가 이미지에서 신호까지 증가 백분율 레이저 파워 및 노출 시간 좋아 보인다.
   11. 신호 포화를 도달 하지 않는 확인 하십시오. 뚜렷한 피크는 각 형 석에 대 한 표시 되도록 디스플레이 히스토그램을 검사 합니다. 피크 포함 전체 히스토그램 표시, 경우 낮은 레이저 전원 및 노출 설정 (그림 2)를 입력 합니다.
   12. 신호가 특정 되도록 동일한 조건 하에서 제어 (치료 비 페) 세포를 시각화 합니다.
       참고: 단일 색상 transfectants 사용할 수 있습니다 또한 제어 크로스 오버, 그러나 신호는 고유 공간 (예: cytosolic 대 미토 콘 드리 아) 하는 경우이 필요 하지 않습니다.
   13. 선택 하거나 현미경 소프트웨어에서 Z 스택 모듈을 엽니다.
   14. 초점 손잡이 사용 하 여 대략적인 해당 하는 셀의 중심 초점 위치.
   15. 셀이 더 이상 표시 될 때까지 한 방향으로 초점을 조정, 최고 위치이 옵션을 선택 합니다.
   16. 셀이 더 이상 다시 표시 될 때까지 반대 방향으로 초점을 조정 하 고 선택이 하단에 위치 합니다.
   17. 최적의 스텝 크기 (일반적으로 약 20 µ m)을 선택 하 고 자동으로 각 위쪽 및 아래쪽 위치 사이 20 µ m 단계에서 각 채널에 단일 이미지를 데리고 카메라에 수집을 시작 합니다.
   18. 3D 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 3D 이미지 (그림 4영화 1) 재구성.
3. Caspase BiFC의 시간 경과 영상
   1. 실험 전에 적어도 1 시간 현미경 켜고 설정 온도 37 ° c
   2. 40 x 60 x, 또는 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치.
   3. 올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.
   4. CO₂ 소스를 사용할 수 있는 접시 홀더 위에 CO₂ 배달 장치 (일반적으로 CO₂를 제공 하는 튜브에 부착 된 플 렉 시 유리 뚜껑)를 배치 합니다. 5% CO₂ 수준을 설정 하 고 소프트웨어에서 CO₂ 컨트롤러를 켭니다. CO₂ 소스를 사용할 수 없는 경우 20 mM Hepes 미디어 버퍼를 포함 합니다.
   5. 이동 transfected 세포 분야 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 RFP 레이저를 사용 하 여 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.
   6. 다음 단계 4.2.8-4.2.12, RFP 레이저에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 합니다. 가능한 한 낮은 형광 신호를 감지할 수 이러한 값을 유지.
   7. 긍정적인 통제를 사용 하 여 샘플 (예제 표 3 참조 하십시오), 따라 YFP 레이저 빛에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 하려면 단계 4.2.8-4.2.12. 가능한 한 낮은 아직도 금성 신호를 감지할 수 있는 동안 이러한 값을 유지.
   8. 접시의 각 음에 대 한 다양 한 기자를 표현 하는 하나 이상의 셀을 포함 하는 다른 위치를 선택 합니다.
   9. 촬영 프레임의 시간 경과 및 총 수의 각 프레임 사이의 시간 간격을 입력 합니다. 확인 시간 전에 다음 프레임은 받을 것 이다 모든 선택한 위치를 얻으려고 합니다.
   10. 각 위치를 다시 방문 하 고 수정 하 고 필요에 따라 초점을 업데이트.
   11. 온도 또는 외부 진동의 변화에서 발생할 수 있는 초점 드리프트를 수정 하려면 초점 드리프트 보정 시스템 (사용 가능한 경우)를 켭니다.
   12. 시간 시작 하 고 데이터를 저장.
   13. (그림 5영화 2) 사용할 수 있는 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.

결과

DNA 손상에 의해 유도 된 caspase-2 BiFC의 예는 그림 3에 표시 됩니다. Camptothecin는 topoisomerase 나 억제제, DNA 손상 및 caspase-2 활성화를 유도 하는 데 사용 되었다. 빨간 형광 단백질 mCherry 셀 BiFC 프로브 표현 게재 하 고 셀의 총 수를 시각화 하기 기자로 서 사용 되었다. 금성 형광 녹색으로 표시 됩니다 및 큰 puncta는 caspase-2 대표 근접을 유도. 이 세포는 금성...

토론

이 프로토콜 caspase 유도 근접 측정을 분할 형광 단백질의 사용을 설명 합니다. 때문에 매우 밝은, 높은 photostable는 refolding 이며 빠른 ¹³분할 금성이이 기술을 위해 선택 되었다. 따라서, caspase 유도 근접 시 refolding 비너스의 분석은 caspase 단백질 상호 작용 역동성의 실시간 의견 가까이 제공할 수 있습니다. 금성 금성 (비너스-N 또는 VN) 구성 아미노산 1-173의 N terminus 두 약간 겹치는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes	Mattek	P06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified Protein	Millipore	FC010-10MG
DPBS	Sigma	D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668019
OPTI MEM I	Invitrogen	31985088
C2-Pro VC plasmid	Addgene	49261
C2-Pro VN plasmid	Addgene	49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids			available by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components			available by request from LBH
DsRed mito plasmid	Clontech	632421	similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPES	Invitrogen	15630106
2 Mercaptoethanol 1000X	Invitrogen	21985023
q-VD-OPH	Apex Bio	A1901