Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

Resumen

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

Resumen

La familia de caspasas de proteasas juega un papel esencial en la inmunidad innata y la apoptosis. Entre ellos, un subgrupo conocido como iniciadores de caspasas son los primeros en activarse en estas vías. Este grupo incluye a caspasa-2, -8, -9, como la inflamatoria caspasas caspasa-1, -4 y -5. Todos los iniciadores de caspasas son activadas por dimerización después de reclutamiento a complejos de multiproteínas específicos llamados plataformas de activación. Caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro) es un enfoque basado en la proyección de imagen de donde se dividen proteínas fluorescentes fusionadas al iniciador de caspasas se utilizan para visualizar el reclutamiento de las caspasas de iniciador a sus plataformas de activación y la resultante proximidad inducida. Esta fluorescencia proporciona una lectura de uno de los primeros pasos necesarios para la activación de caspase del iniciador. Utilizando un número de diferentes enfoques basados en la microscopía, esta técnica puede proporcionar datos cuantitativos sobre la eficacia de la activación de caspasas en un nivel de población, así como la cinética de la activación de caspasas y el tamaño y número de activación de la caspasa complejos de forma por la célula.

Introducción

La familia de proteasas caspasas es conocida por su crítico papel en apoptosis e inmunidad innata ¹. Debido a su importancia, determinar cuándo, dónde y sobre la eficacia específicas caspasas son activadas puede proporcionar información crucial sobre los mecanismos de la caspasa vías de activación. El protocolo basado en proyección de imagen se describe aquí permite la visualización de los pasos más tempranos en la cascada de activación de la caspasa. Esta técnica aprovecha las interacciones proteína: proteína dinámica activación de la caspasa en coche.

Las caspasas pueden dividirse en dos grupos: los iniciadores de caspasas (caspasa-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 y -12) y el verdugo caspasas (caspasa-3, -6 y -7). El verdugo caspasas están presentes en la célula como dímeros preformadas y son activadas por clivaje entre las subunidades grandes y pequeñas ². Cuando se activa, hienden numerosas proteínas estructurales y reguladoras, dando como resultado apoptosis ³. Los iniciadores de caspasas son las caspasas primera a activarse en un camino y generalmente desencadenan la activación de las caspasas de verdugo. En contraste con verdugo caspasas, iniciadores de caspasas son activadas por dimerización ^4,5. Esta dimerización facilita el reclutamiento de monómeros inactivos a complejos de peso molecular grande específico conocidos como plataformas de activación. Montaje de plataformas de activación se rige por una serie de interacciones proteína: proteína específica. Estas son mediadas por motivos de interacción proteína conservada presentes en proform de lo caspase del iniciador e incluyen el dominio de la muerte (DD), dominio efector de muerte (DED) y caspasas reclutamiento dominio (CARD) ⁶ (figura 1A). Plataformas de activación generalmente incluyen una proteína receptora y una proteína del adaptador. El receptor se activa generalmente en Unión de un ligando, induce un cambio conformacional que permite la Oligomerización de numerosas moléculas. El receptor entonces recluta o la caspasas directamente o moléculas del adaptador que a su vez la caspasa al complejo. Así, numerosas moléculas caspasa entran en proximidad, que permite la dimerización. Esto se conoce como el modelo de proximidad inducida por ⁷. Una vez dimerized, la caspasa experimenta autoprocessing, que sirve para estabilizar la enzima activa ^4,8. Por ejemplo, el montaje del apoptosome Apaf1 es accionada por citocromo c tras su liberación de la mitocondria en un proceso llamado permeabilización mitocondrial membrana externa (MOMP). Apaf1 alternadamente recluta a caspasa-9 a través de una interacción que es mediada por una tarjeta presente en dos de las proteínas ⁹. Similar resultado de interacciones de proteínas en la Asamblea del CD95 muerte induce señalización complejo (disco) que conduce a la activación de la caspasa-8; el PIDDosome, que puede activar la caspasa-2; y varios complejos de inflammasome que inician la activación de la caspasa-1 ^10,11,12. Por lo tanto, iniciadores de caspasas son reclutados a plataformas de activación específico por un mecanismo común en proximidad inducida y dimerización, sin la cual no se producirá la activación.

Caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro) es un ensayo basado en la proyección de imagen que se desarrolló para medir este primer paso en la activación de las caspasas de iniciador, que permite la visualización directa de la proximidad de caspasas inducida tras la plataforma de activación Asamblea. Este método aprovecha las propiedades de la proteína fluorescente split Venus. Venus es un más brillante y más Fotoestables versión de proteína fluorescente amarilla (YFP) que puede dividirse en dos fragmentos no fluorescente y ligeramente superpuestos: el N-terminal de Venus (Venus N o VN) y el C-terminal de Venus (Venus C o VC). Estos fragmentos conservan la capacidad de replegar y fluorescente en cerca de ¹³. Cada fragmento de Venus está fusionada a la prodomain de las caspasas, que son la mínima porción de la caspasa que se une a la plataforma de activación. Esto asegura que las caspasas no retienen actividad enzimática y por tanto es posible el análisis simultáneo de posteriores eventos asociados con eventos endógenos. Venus los fragmentos doblados cuando las prodomains caspasas son reclutados a la plataforma de activación y experimentar la proximidad inducida. (Figura 1B). La fluorescencia resultante de Venus puede utilizarse con precisión y específicamente monitorear la localización subcelular, la cinética y la eficacia del conjunto de plataformas de activación de caspasas de iniciador en las células. Datos de la proyección de imagen puede ser adquirido por microscopía confocal o por microscopía de fluorescencia estándar y puede ser adaptado a una serie de microscopía diferentes incluyendo: Time-lapse de imágenes para el seguimiento de la activación de caspasas en tiempo real; proyección de imagen de alta resolución para la determinación precisa de la localización subcelular; y cuantificación de la punto final de eficacia de la activación.

Esta técnica se desarrolló inicialmente para investigar la activación de la caspasa-2¹⁴. Mientras que la plataforma de activación de la caspasa-2 se cree que el PIDDosome, compuesto por el receptor PIDD (inducida por p53 proteína con un dominio de la muerte) y el adaptador RAIDD (RIP-asociado de ICH-1/CAD-3 proteína homóloga con un dominio de la muerte), Se ha reportado activación de caspasa-2 PIDDosome-independiente. Esto sugiere que las plataformas de activación adicional para la caspasa-2 existen ^15,16. A pesar de no saber los componentes completos de la plataforma de activación de la caspasa-2, caspasa centro técnica ha permitido eficazmente los interrogatorios de las vías de señalización de caspasa-2 en el nivel molecular ^14,17. También hemos adaptado este protocolo para las caspasas inflamatoria (caspasa-1, -4, -5 y -12) ¹⁸ y, en principio, el mismo enfoque debería ser suficiente analizar del mismo modo cada uno de los restantes caspasas iniciador. Este protocolo de manera similar podría ser adaptado investigar otras vías era dimerización es una importante señal activadora. Por ejemplo, las proteínas STAT se activan por dimerización por fosforilación de Janus quinasa (JAK) ¹⁹. Así, el sistema de centro podría utilizarse para visualizar tendencia activación así como muchas otras vías regulados por las interacciones de la dinámica de la proteína. El siguiente protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la introducción de los reporteros en las células, así como metodologías para el análisis y la adquisición de la imagen.

Protocolo

1. preparación de células y platos de la cultura

Nota: Realice los pasos 1-3 en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos. Guantes.

1. Si usando platos de fondo de vidrio, capa del vidrio con fibronectina. Si utiliza platos de plástico, vaya al paso 1.2.
   1. Hacer una solución de 0,1 mg/mL de fibronectina: diluir 1 mL de solución de fibronectina de 1 mg/mL en 9 mL de 1 X PBS.
   2. Cubrir el fondo del vidrio de cada pozo con 0.5-1 mL de fibronectina e incubar durante 1-5 min a temperatura ambiente.
   3. Usando una pipeta, recoger la solución de fibronectina y almacenar a 4 ° C.
      Nota: La solución de fibronectina puede reutilizarse varias veces.
   4. Lavar el vaso una vez con 1-2 mL 1 X PBS y aspirar de PBS.
2. Placa de 1 x 10⁵ células por pocillo de una placa de 6 pozos en 2 mL de los medios de cultivo celular adecuado (ver tabla 1 para los números de celulares para diferentes pozos de tamaño). Si utiliza una línea celular que expresa estable los componentes de centro de caspasa (ver discusión), placa de 2 x 10⁵ células y proceder al tratamiento paso (paso 3).
3. Permitir que las células se adhieran a la placa durante la noche a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos.

2. transfección de las células para introducir los componentes de centro de caspasa

1. Transfectar las células con el reactivo de transfección adecuada.
   Nota: Este protocolo esboza las instrucciones para Lipofectamine 2000, que ha sido optimizada para toxicidad mínima. Este protocolo se ha utilizado con éxito en células Hela, células MCF7 y LN18 células. Si usa más reactivos de transfección siguen las instrucciones del fabricante y optimización según sea necesario.
   1. Añadir 12 μl del reactivo de transfección a 750 μl de medios reducidos del suero en un tubo estéril.
   2. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   3. Añadir 10 ng de un plásmido reportero (un plasmid codificando una proteína fluorescente, e.g. rojo proteína fluorescente [convocatoria], que se etiqueta las células transfected) a un tubo de 1,5 mL estériles para cada pozo a ser transfectadas.
   4. Añadir 20 ng de cada plásmido centro de caspasas (por ejemplo, 20 ng de caspasa-2 prodomain [C2 Pro]-VC y 20 ng de C2 Pro-VN) a cada tubo (tabla 2).
   5. Traer cada tubo hasta un volumen total de 100 μl mediante la adición de suero reduce los medios de comunicación.
   6. Utilizando una pipeta de p200, añadir 100 μl de solución de reactivo de transfección de paso 2.1.2 a la mezcla de plásmido en forma gota a gota.
   7. Incubar la mezcla de reactivo de transfección de plásmidos por 20 min a temperatura ambiente.
   8. Aspire los medios de comunicación de las células usando una pipeta o con la succión y luego, usando una pipeta p1000, pipetear 800 μl de medios libres de suero suavemente hacia abajo al lado del pozo.
   9. Utilizando una pipeta de p200, añadir 200 μL del ADN-lípido complejo gota a gota a cada pocillo.
   10. Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 3 horas.
   11. Teniendo cuidado de no interrumpir la monocapa, retire los medios libres de suero que contiene los complejos DNA-lipídica por aspiración mediante succión o con una pipeta.
   12. Pipetear 2 mL de medio de crecimiento completo precalentado (37 ° C) suavemente por el lado de cada pozo.
2. Incube las células a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos para 24-48 h para la expresión de la proteína óptimo.

3. inducción de la activación de caspasas

1. Tratar con un fármaco o estímulo que induce la caspasa activación aproximadamente 24 h después de la transfección.
   1. Añadir la concentración deseada del fármaco a la caliente (37 ° C) proyección de imagen medios (crecimiento completo suplementado con Hepes [20 mM, pH 7.2-7.5] y 2-Mercaptoetanol [55 μm]) y mezclar suavemente (tabla 3).
   2. Aspire los medios de comunicación de las células usando una pipeta o con la succión y luego, usando una pipeta, pipeta 2 mL de la solución 3.1.1 suavemente hacia abajo al lado del pozo.
   3. Añadir imágenes medios de comunicación sin la droga a un pocillo como control sin tratamiento.
2. Incubar las células en una incubadora a 37 ° C de cultivo de tejidos o proceder a paso 4.3 para un experimento de Time-lapse.

4. Adquisición de datos de Caspase BiFC

1. Caspase BiFC para adquisición de punto de vez
   1. Encienda el microscopio y fuente de luz fluorescente siguiendo las instrucciones del fabricante.
   2. Encontrar las células bajo el filtro de la RFP y enfoque en la fluorescencia del gen reportero.
   3. Utilizando un contador de mano cuenta, contar todas las celdas de RFP-positivo en el campo visual. Anotar el número.
   4. Manteniendo el mismo campo visual, cambiar el filtro GFP (o filtro YFP si está disponible) y, usando un contador de mano cuenta, contar el número de eritrocitos que también son verdes (Venus-positivo). Alternar entre los dos filtros para asegurar que sólo los eritrocitos son evaluados para Venus-positividad. Anotar el número (figura 3).
   5. Contar por lo menos 100 células de RFP-positivas de cada una de tres áreas individuales de la placa.
   6. En cada área, calculando el porcentaje de células transfectada Venus-positivo (es decir, las células rojas que también son de color verdes). Promedio de los porcentajes resultantes para obtener la desviación estándar.
2. Proyección de imagen tridimensional de la caspasa centro
   1. Encienda el microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante y ejecutar el programa de adquisición.
   2. Seleccione la x 60 o 63 x aceite objetivo y coloque una gota de aceite en el objetivo
   3. Coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio usando el soporte de la placa correcta.
   4. Con una fuente de luz de epifluorescencia y el ocular del microscopio o el láser confocal y la pantalla del ordenador, vaya a un campo de interés.
   5. Se centran en la fluorescencia del reportero con el láser RFP o filtro.
   6. Si epifluorescencia se ha utilizado hasta este punto, cambiar la fuente de luz para el láser confocal y visualizar la imagen en vivo de las células como adquiridos por la cámara y visualizado por el software de adquisición en la pantalla del ordenador.
   7. Usando el control de joystick y la rueda de enfoque, afinar el enfoque y la posición de las células para que las células están en el centro del visor. Seleccione las celdas que están separadas unos de otros y no se solapan.
   8. Entrada de la energía del laser porcentaje al 50% y el tiempo de exposición a 100 ms para Venus y RFP como punto de partida para determinar la configuración óptima para el experimento.
   9. Encienda la captura vivo e inspeccione la imagen resultante y los histogramas de pantalla acompañamiento para ambos canales.
   10. Si la señal es baja y la imagen es difícil de hacer, aumentar el tiempo porcentaje láser potencia y/o exposición en incrementos de hasta que la señal en la imagen se ve bien.
   11. Asegúrese de que la señal no alcanza la saturación. Inspeccione el histograma de la pantalla para asegurarse de que un pico distinto es visible para cada fluor. Si el pico abarca la pantalla histograma completo, entrada de ajustes más bajos láser potencia y exposición (figura 2).
   12. Visualizar las células control (no tratados o no transfectadas) bajo las mismas condiciones para que la señal sea específica.
       Nota: Solo color transfectants puede utilizarse también para control de crossover, pero si las señales son espacialmente distintas (por ejemplo, mitocondrial y citosólica) esto no es necesario.
   13. Seleccione o abra el módulo de pila de Z en el software del microscopio.
   14. Usando la perilla de enfoque, aproximado de la posición focal correspondiente al centro de la célula.
   15. Ajuste el foco en una dirección hasta que la celda no está visible, seleccione esta como la posición superior.
   16. Ajuste el enfoque en la dirección opuesta hasta que la célula otra vez ya no sea visible y seleccione esta como la posición inferior.
   17. Elegir el tamaño de paso óptimo (generalmente aproximadamente 20 μm) y empezar la adquisición para indicar a la cámara para tomar automáticamente una sola imagen en cada canal en cada uno de los 20 pasos μm entre las posiciones superior e inferior.
   18. Utilizar software de Render 3D para reconstruir la imagen 3D (figura 4película 1).
3. Imágenes de Time-lapse de la caspasa centro
   1. Al menos 1 h antes del experimento, encienda el microscopio y ajustar la temperatura a 37 ° C.
   2. Seleccione el 40 x, 60 x u objetivo de aceite x 63 y coloque una gota de aceite sobre el objetivo.
   3. Coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio usando el soporte de la placa correcta.
   4. Si una fuente de CO₂ está disponible, coloque el dispositivo de entrega de CO₂ (generalmente una tapa de plexiglás al tubo que entrega el CO₂) en la parte superior del sostenedor de la placa. Fijar el CO₂ nivel 5% y encienda el CO₂ controlador dentro del software. Si no hay una fuente de CO₂ , son 20 mM Hepes para proteger los medios de comunicación.
   5. Desplácese a un campo de células transfected y visualizar la imagen en vivo de las células como adquiridos por la cámara y visualizado por el software de adquisición en la pantalla del ordenador usando el laser de la RFP.
   6. Siguiendo pasos 4.2.8-4.2.12, entrada de la configuración de tiempo de exposición y poder de láser porcentaje para el láser RFP. Mantener estos valores tan bajos como sea posible mientras que todavía siendo capaces de detectar la señal fluorescente.
   7. Utilizando un control positivo de la muestra (ver tabla 3 para los ejemplos), siga 4.2.8-4.2.12 pasos para la configuración de entrada para tiempo de exposición y poder de láser porcentaje para la luz de láser YFP. Mantener estos valores tan bajos como sea posible mientras que todavía siendo capaz de detectar la señal de Venus.
   8. Para cada pocillo de la placa, elija un número de diversas posiciones que contengan una o más células expresando el reportero.
   9. Entrada del intervalo de tiempo entre cada fotograma del time-lapse y total número de marcos a tomarse. Asegúrese de que hay tiempo para adquirir todas las posiciones seleccionadas antes de tomarse el siguiente fotograma.
   10. Volver a visitar cada posición y corregir y actualizar el enfoque según sea necesario.
   11. Para corregir para la deriva focal que puede resultar de cambios de temperatura o las vibraciones externas, encienda el sistema de la corrección de la deriva del foco (si está disponible).
   12. Comienza el lapso de tiempo y guardar los datos.
   13. Analizar los datos utilizando el software de imágenes disponible (figura 5película 2).

Resultados

En la figura 3se muestra un ejemplo de centro de caspasa-2 inducida por daño en el ADN. Camptotecina, una topoisomerasa I inhibidor, fue utilizado para inducir daño y caspasa-2 activación de ADN. La proteína fluorescente roja mCherry fue utilizado como reportero para demostrar que las células expresan la sonda del centro y para ayudar a visualizar el número total de células. Fluorescencia de Venus se muestra en verde y el orificio grande representan ca...

Discusión

Este protocolo trata el uso de proteínas fluorescentes split para medir caspasas inducida por proximidad. Venus de Split fue elegida para esta técnica porque es muy brillante, altamente Fotoestables y el refolding es rápido ¹³. Así, el análisis de Venus refolding sobre proximidad de caspasas inducida puede proporcionar cerca de las estimaciones en tiempo real de la dinámica de interacción de la proteína caspasa. Venus se divide en dos fragmentos ligeramente superpuestas, la terminal N de V...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes	Mattek	P06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified Protein	Millipore	FC010-10MG
DPBS	Sigma	D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668019
OPTI MEM I	Invitrogen	31985088
C2-Pro VC plasmid	Addgene	49261
C2-Pro VN plasmid	Addgene	49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids			available by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components			available by request from LBH
DsRed mito plasmid	Clontech	632421	similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPES	Invitrogen	15630106
2 Mercaptoethanol 1000X	Invitrogen	21985023
q-VD-OPH	Apex Bio	A1901