Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

Riepilogo

Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Abstract

La famiglia di caspase di proteasi svolgono un ruolo essenziale nell'apoptosi e l'immunità innata. Tra questi, un sottogruppo conosciuto come initiator caspases sono il primo a essere attivato in queste vie. Questo gruppo include il caspase-2, -8 e -9, come pure i caspases infiammatori, caspasi-1, -4 e -5. I caspases iniziatore sono tutti attivati di dimerizzazione successivo all'assunzione di specifici complessi multiproteici chiamati piattaforme di attivazione. Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un approccio basato su formazione immagine dove dividere le proteine fluorescenti fuse initiator caspases sono utilizzati per visualizzare il reclutamento delle caspasi iniziatore a loro piattaforme di attivazione e la conseguente prossimità di indotto. Questa fluorescenza consente una lettura di uno dei primi passaggi richiesti per l'attivazione di caspase iniziatore. Utilizzando un numero di differenti approcci basati su microscopia, questa tecnica è in grado di fornire dati quantitativi sull'efficienza dell'attivazione di caspase a livello di popolazione, nonché la cinetica di attivazione delle caspasi e la dimensione e il numero di attivazione di caspase complessi su base per cella.

Introduzione

La famiglia di proteasi caspasi è noti per i loro ruoli critici nell'apoptosi e immunita ' ¹. A causa della loro importanza, determinare quando, dove e quanto efficientemente caspases specifici vengono attivati può fornire le comprensioni cruciale nei meccanismi della caspasi vie di attivazione. Il protocollo base imaging qui descritto consente la visualizzazione dei primi passi nella cascata di attivazione di caspasi. Questa tecnica sfrutta le interazioni dinamiche della proteina: l'attivazione di caspase che in auto.

I caspases possono essere divisi in due gruppi: i caspases iniziatore (caspasi-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e i caspases boia (caspase-3, -6 e -7). I caspases boia sono presenti nella cellula come dimeri preformati e vengono attivati tramite fenditura tra le grandi e piccole subunità ². Quando attivato, essi fendere numerose proteine strutturali e regolatorie conseguente apoptosi ³. I caspases iniziatore sono i caspases primi di essere attivato in un percorso e attivano l'attivazione delle caspasi boia. A differenza di caspases boia, initiator caspases sono attivati da dimerizzazione ^4,5. La dimerizzazione è facilitata dal reclutamento di monomeri inattivi per specifiche grande peso molecolare complessi noti come piattaforme di attivazione. Montaggio di piattaforme di attivazione è regolato da una serie di interazioni specifiche: proteina. Questi sono mediati dai motivi di interazione della proteina conservata presente nel proform di caspase l'iniziatore e includere il dominio di morte (DD), dominio effector di morte (DED) e caspase recruitment domain (CARD) ⁶ (Figura 1A). Piattaforme di attivazione in genere comprendono una proteina recettore e una proteina dell'adattatore. Il recettore è solitamente attivato al momento di legame di un ligando, che induce un cambiamento conformazionale che permette per l'oligomerizzazione di numerose molecole. Il recettore quindi neanche reclute il caspase direttamente o molecole di adattatore che a sua volta portano il caspase al complesso. Così, numerose molecole di caspase mai avvicinare permettendo la dimerizzazione. Questo è noto come la prossimità indotta modello ⁷. Una volta dimerized, le caspasi subisce autoprocessing, che serve a stabilizzare l'enzima attivo ^4,8. Ad esempio, Assemblea dell'apoptosoma Apaf1 viene attivato dal citocromo c dopo il suo rilascio dai mitocondri in un processo chiamato permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale (MOMP). Apaf1 reclute a sua volta caspase-9 attraverso un'interazione che è mediata da una carta presente in sia proteine ⁹. Risultato di interazioni proteina simile all'Assemblea della CD95 morte inducendo complessi di segnalazione (disco) che conduce all'attivazione di caspasi-8; il PIDDosome, che può attivare le caspasi-2; e vari complessi inflammasome che avviano l'attivazione di caspasi-1 ^10,11,12. Così, initiator caspases sono reclutati per piattaforme di attivazione specifico da un meccanismo comune conseguente indotto vicinanza e dimerizzazione, senza la quale non si verificherà l'attivazione.

Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un test basato su formazione immagine che è stato sviluppato per misurare questo primo passo nell'attivazione delle caspasi iniziatore, che permette la visualizzazione diretta di caspasi indotta prossimità seguendo piattaforma di attivazione Assemblea. Questo metodo sfrutta le proprietà della proteina fluorescente Spalato Venus. Venus è un più luminoso e più fotostabile versione di proteina fluorescente gialla (YFP) che possa essere divisi in due frammenti non fluorescenti e leggermente sovrapposti: N-terminale di Venus (Venus N o VN) e C-terminale di Venus (Venus C o VC). Questi frammenti mantengono la capacità di ripiegare e diventa fluorescente quando nella prossimità vicina ¹³. Ogni frammento di Venus è fuso il propeptide della caspasi, che è la parte minima della caspasi che si lega alla piattaforma di attivazione. Questo assicura che i caspases non mantengono l'attività enzimatica e pertanto sono possibile analisi simultanea degli eventi a valle associati agli eventi endogeni. Il Venus frammenti ripiegare quando il prodomains di caspasi sono reclutati per la piattaforma di attivazione e sottoposti a prossimità indotta. (Figura 1B). La fluorescenza di Venus risultante utilizzabile con precisione e in particolare monitorare la localizzazione subcellulare, la cinetica e l'efficienza dell'Assemblea delle piattaforme di attivazione di caspase iniziatore in singole cellule. Dati di imaging possono essere acquistati mediante microscopia confocale o mediante microscopia a fluorescenza standard e può essere adattato a una serie di approcci di microscopia diversi tra cui: Time-lapse di imaging per monitorare l'attivazione di caspase in tempo reale; formazione immagine ad alta risoluzione per la determinazione precise della localizzazione subcellulare; e la quantificazione di punto finale dell'efficienza dell'attivazione.

Questa tecnica in primo luogo è stata sviluppata per studiare l'attivazione di caspase-2¹⁴. Mentre la piattaforma di attivazione di caspase-2 è pensata per essere il PIDDosome, che consiste del recettore PIDD (proteina p53-indotta con un dominio di morte) e l'adattatore RAIDD (proteina omologa di RIP-collegata ICH-1/CAD-3 con un dominio di morte), L'attivazione di caspase-2 PIDDosome-indipendente è stata segnalata. Ciò suggerisce che l'attivazione di ulteriori piattaforme per caspase-2 esista ^15,16. Pur non sapendo i componenti completo della piattaforma attivazione di caspase-2, la caspasi BiFC tecnica ha permesso per l'interrogatorio di successo delle vie di segnalazione di caspase-2 al livello molecolare ^14,17. Abbiamo adattato con successo anche questo protocollo per i caspases infiammatori (caspasi-1, -4, -5 e -12) ¹⁸ e, in linea di principio, lo stesso approccio dovrebbe essere sufficiente allo stesso modo analizzare ciascuno dei rimanenti initiator caspases. Questo protocollo allo stesso modo potrebbe essere adattato per studiare altre vie erano dimerizzazione è un importante segnale d'attivazione. Ad esempio, le proteine STAT sono attivati da dimerizzazione dopo fosforilazione da Janus chinasi (JAK) ¹⁹. Così, il sistema di BiFC potrebbe essere utilizzato per visualizzare per attivazione STAT così come molte altre vie regolamentati da interazioni proteina dinamico. Il seguente protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'introduzione dei reporter nelle cellule nonché metodologie di analisi e acquisizione delle immagini.

Protocollo

1. preparazione delle cellule e piastre di coltura

Nota: Eseguire i passaggi 1-3 in cappa a flusso laminare di coltura del tessuto. Indossare i guanti.

1. Se utilizza piatti di fondo di vetro, ricoprire il vetro con fibronectina. Andare al passaggio 1.2 se utilizza piatti di plastica.
   1. Fare una soluzione di 0,1 mg/mL di fibronectina: diluire 1 mL di soluzione di fibronectina 1 mg/mL in 9 mL di 1X PBS.
   2. Coprire il fondo di vetro di ciascun pozzetto con 0,5-1 mL di fibronectina e incubare per 1-5 min a temperatura ambiente.
   3. Utilizzando una pipetta, raccogliere la soluzione di fibronectina e conservare a 4 ° C.
      Nota: La soluzione di fibronectina può essere riutilizzata più volte.
   4. Lavare il vetro una volta con 1-2 mL 1 X PBS e aspirare di PBS.
2. Piastra di 1 x 10⁵ cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 2 mL di terreno di coltura cella appropriata (Vedi tabella 1 per i numeri di cellulare da utilizzare per diverse dimensioni pozzi). Se utilizzando una linea cellulare che esprime stabilmente i caspase BiFC componenti (vedi discussione), 2 x 10⁵ cellule del piatto e procedere con il passaggio di trattamento (passaggio 3).
3. Consentire alle cellule di aderire al piatto durante la notte a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto.

2. transfezione delle celle per introdurre i componenti BiFC caspase

1. Transfect cellule con il reagente di transfezione appropriato.
   Nota: Questo protocollo delinea le istruzioni per Lipofectamine 2000, che è stato ottimizzato per tossicità minima. Questo protocollo è stato utilizzato con successo in cellule Hela, cellule MCF7 e cellule LN18. Se si utilizza ulteriori reagenti di transfezione seguono le istruzioni del produttore e ottimizzare come necessario.
   1. Aggiungere 12 µ l del reagente di transfezione di 750 µ l di media riduttori del siero in una provetta sterile.
   2. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
   3. Aggiungere 10 ng di un plasmide del reporter (un plasmide che codifica una proteina fluorescente, per esempio rosso proteina fluorescente [RFP], che verrà assegnata l'etichetta cellule transfected) in una provetta sterile 1,5 mL per ciascun pozzetto per essere transfected.
   4. Aggiungere 20 ng di ogni plasmide BiFC caspasi (ad es., 20 ng di caspase-2 propeptide [C2 Pro]-VC e 20 ng di C2 Pro-VN) ad ogni provetta (tabella 2).
   5. Portare ogni tubo fino ad un volume totale di 100 µ l con l'aggiunta di siero riduttore media.
   6. Utilizzando una pipetta p200, aggiungere 100 µ l di soluzione di reagente di transfezione dal punto 2.1.2 alla miscela del plasmide in modo goccia a goccia.
   7. Incubare il mix di reagente di transfezione plasmide per 20 min a temperatura ambiente.
   8. Aspirare i media dalle celle utilizzando una pipetta o con aspirazione e quindi, utilizzando una pipetta p1000, pipettare 800 µ l di media liberi del siero delicatamente verso il basso il lato del bene.
   9. Utilizzando una pipetta p200, aggiungere 200 µ l del complesso DNA-lipidico goccia a goccia in ciascun pozzetto.
   10. Incubare le cellule in coltura tissutale incubatore a 37 ° C per 3 h.
   11. Avendo cura di non perturbare il monostrato, rimuovere il supporto gratuito di siero contenente i complessi DNA-lipidico dall'aspirazione mediante aspirazione o con una pipetta.
   12. Pipettare 2 mL di pre-riscaldata (37 ° C) completa crescita media delicatamente verso il basso il lato di ciascun pozzetto.
2. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto per 24-48 h per espressione proteica ottimale.

3. induzione di attivazione delle caspasi

1. Trattare con un farmaco o stimolo che induce caspase attivazione circa 24 h dopo la transfezione.
   1. Aggiungere la concentrazione del farmaco per pre-riscaldati (37 ° C) avviabile (media di crescita completa completati con Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] e 2-mercaptoetanolo [55 µM]) e mescolare delicatamente (tabella 3).
   2. Aspirare i media dalle celle utilizzando una pipetta o con aspirazione e quindi, utilizzando una pipetta, pipettare 2 mL della soluzione da 3.1.1 inclinate leggermente il bordo del pozzo.
   3. Aggiungere avviabile senza la droga in un pozzetto come controllo non trattato.
2. Incubare le cellule in coltura tissutale incubatore a 37 ° C o procedere a passo 4.3 per un esperimento di time-lapse.

4. Acquisizione dati di Caspase BiFC

1. Caspase BiFC per acquisizione di punto singolo tempo
   1. Accendere il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente seguendo le istruzioni del produttore.
   2. Trovare le celle sotto al filtro RFP e concentrarsi sulla fluorescenza del gene reporter.
   3. Utilizzando un contatore di mano-tally, contare tutte le celle di RFP-positivi nel campo visivo. Il numero di record.
   4. Pur mantenendo il campo visivo stesso, passare al filtro GFP (o filtro YFP se disponibile) e, utilizzando un contatore di mano-tally, contare il numero di globuli rossi che sono anche verde (Venus-positivo). Passare avanti e indietro tra i due filtri per garantire che solo gli eritrociti vengono valutati per Venus-positività. Registrare il numero (Figura 3).
   5. Contare almeno 100 cellule RFP-positive da ciascuna delle tre aree individuali della piastra.
   6. In ogni area, calcolare la percentuale di cellule Venus-positive trasfettate (cioè globuli rossi che sono anche verdi). Media le percentuali risultanti per ottenere la deviazione standard.
2. Formazione immagine tridimensionale di caspase BiFC
   1. Accendere il microscopio seguendo le istruzioni del produttore e lanciare il software di acquisizione.
   2. Selezionare la x 60 o 63 x olio obiettivo e mettere una goccia di olio sull'obiettivo
   3. Posizionare la piastra di coltura sullo stage microscopio utilizzando il porta targa corretta.
   4. Utilizzando una sorgente di luce di epifluorescenza e l'oculare del microscopio o i laser confocale e lo schermo del computer, passare a un campo di interesse.
   5. Concentrarsi sulla fluorescenza reporter utilizzando il laser RFP o filtro.
   6. Se epifluorescenza è stato utilizzato fino a questo punto, passare alla sorgente di luce laser confocale e visualizzare l'immagine dal vivo delle cellule come acquisita dalla fotocamera e visualizzate dal software di acquisizione sullo schermo del computer.
   7. Utilizzando il joystick e la ghiera di messa a fuoco, mettere a punto la messa a fuoco e la posizione delle cellule così che le cellule sono al centro del mirino. Selezionare le celle che sono separate gli uni dagli altri e non si sovrappongano.
   8. Ingresso della potenza del laser di percentuale al 50% e il tempo di esposizione a 100 ms per Venus e RFP come punto di partenza per determinare le impostazioni ottimali da utilizzare per l'esperimento.
   9. Accendere l'acquisizione live e controllare l'immagine risultante e l'accompagnamento visualizzazione istogrammi per entrambi i canali.
   10. Se il segnale è basso e l'immagine è difficile da fare fuori, aumentare il tempo di alimentazione e/o l'esposizione di laser delle percentuale con incrementi fino a quando il segnale dell'immagine sembra buono.
   11. Assicurarsi che il segnale non raggiunge la saturazione. Ispezionare la visualizzazione istogramma per assicurarsi che un picco distinto è visibile per ogni fluor. Se il picco comprende la visualizzazione dell'istogramma intero, ingresso inferiore impostazioni di alimentazione e l'esposizione di laser (Figura 2).
   12. Visualizzare le cellule di controllo (non trattata o non trasfettate) alle stesse condizioni per garantire che il segnale è specifico.
       Nota: Singolo colore trasfettanti utilizzabile anche al controllo di crossover, ma se i segnali sono spazialmente distinte (per esempio mitocondriale contro citosolica) questo non è necessario.
   13. Selezionare o aprire il modulo dello stack Z nel software microscopio.
   14. Utilizzando la manopola di messa a fuoco, approssimativa della posizione focale corrispondente al centro della cella.
   15. Regolare il fuoco in una direzione fino a quando la cella non è visibile, selezionare questa come la posizione superiore.
   16. Regolare il fuoco in direzione opposta fino a quando la cella non è ancora visibile e selezionare questa opzione come posizione più bassa.
   17. Scegliere la dimensione ottimale passaggio (solitamente circa 20 µm) e avviare l'acquisizione per indicare alla fotocamera di scattare automaticamente una singola immagine in ogni canale a ciascuno dei 20 µm passi tra le posizioni superiore e inferiore.
   18. Utilizzare software di rendering 3D per ricostruire l'immagine 3D (Figura 4Movie 1).
3. Time-lapse imaging di caspase BiFC
   1. Almeno 1 h prima dell'esperimento, accendere il microscopio e impostare la temperatura a 37 ° C.
   2. Selezionare la x 40, 60 x o obiettivo di olio x 63 e mettere una goccia di olio sull'obiettivo.
   3. Posizionare la piastra di coltura sullo stage microscopio utilizzando il porta targa corretta.
   4. Se una fonte di CO₂ è disponibile, è possibile collocare il dispositivo di consegna di CO₂ (solitamente un coperchio di plexiglass attaccato al tubo che trasporta la CO₂) sopra il portatarga. Impostare la CO₂ livello al 5% e accendere il CO₂ controller all'interno del software. Se non è disponibile una fonte di CO₂ , includono 20 mM Hepes memorizzare nel buffer i media.
   5. Passare a un campo di cellule trasfettate e visualizzare l'immagine dal vivo delle cellule come acquisita dalla fotocamera e visualizzate dal software di acquisizione sullo schermo del computer usando il laser RFP.
   6. A seguito di passaggi 4.2.8-4.2.12, input le impostazioni per percentuale laser potenza e tempo di esposizione per il laser RFP. Mantenere questi valori più bassi possibili, pur essendo in grado di rilevare il segnale fluorescente.
   7. Utilizzo di un controllo positivo del campione (Vedi tabella 3 per esempi), seguire passaggi 4.2.8-4.2.12 per immettere le impostazioni per percentuale laser potenza e tempo di esposizione per la luce di laser YFP. Mantenere questi valori più bassi possibili, pur essendo in grado di rilevare il segnale di Venus.
   8. Per ciascun pozzetto della piastra, scegliere un numero di posizioni diverse che contengono una o più cellule che esprimono il reporter.
   9. Immettere l'intervallo di tempo tra ogni fotogramma del time-lapse e totale il numero di fotogrammi da adottare. Assicurare che non c'è tempo per acquisire tutte le posizioni selezionate prima il fotogramma successivo è quello di essere preso.
   10. Ri-visitare ogni posizione, correggere e aggiornare lo stato attivo in base alle necessità.
   11. Per correggere la deriva focale che può derivare da cambiamenti di temperatura o vibrazioni esterne, attivare il sistema di correzione del drift di messa a fuoco (se disponibile).
   12. Iniziare il time-lapse e salvare i dati.
   13. Analizzare i dati utilizzando il software di imaging disponibili (Figura 5film 2).

Risultati

Nella Figura 3è riportato un esempio di caspase-2 BiFC indotta da danno del DNA. Camptotecine, una topoisomerasi io inibitore, è stato usato per indurre il danno del DNA, attivazione di caspase-2. La mCherry proteina fluorescente rosso è stato utilizzato come reporter per mostrare che le cellule esprimono la sonda BiFC e per aiutare a visualizzare il numero totale di cellule. Fluorescenza di Venus è mostrato in verde e la grande puncta rappresentano caspa...

Discussione

Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo di proteine fluorescenti di Spalato per misurare caspasi indotta prossimità. Venus di Spalato è stato scelto per questa tecnica perché è molto luminoso, altamente fotostabili e il ripiegamento è veloce ¹³. Così, l'analisi di Venere ripiegamento su caspasi indotta prossimità può fornire vicino le valutazioni in tempo reale delle dinamiche di interazione della proteina caspasi. Venus è diviso in due frammenti leggermente sovrapposti, il capoline...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes	Mattek	P06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified Protein	Millipore	FC010-10MG
DPBS	Sigma	D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668019
OPTI MEM I	Invitrogen	31985088
C2-Pro VC plasmid	Addgene	49261
C2-Pro VN plasmid	Addgene	49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids			available by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components			available by request from LBH
DsRed mito plasmid	Clontech	632421	similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPES	Invitrogen	15630106
2 Mercaptoethanol 1000X	Invitrogen	21985023
q-VD-OPH	Apex Bio	A1901